CN114533769B

CN114533769B - 大豆间座壳菌提取物用于抗紫外线伤害及减少色素沉着的用途

Info

Publication number: CN114533769B
Application number: CN202011344831.2A
Authority: CN
Inventors: 柯宏慧; 张训硕; 陈宜芳; 杨舜心; 林品妤; 林秀芳; 李政明; 谢松源; 郑铭仁; 吴明德
Original assignee: Kaohsiung Medical University; Food Industry Research and Development Institute
Current assignee: Kaohsiung Medical University; Food Industry Research and Development Institute
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: CN114533769A; CN116509909A

Abstract

本发明提供一种大豆间座壳菌(Diaporthecaulivora)提取物用于制备抗紫外线伤害及减少色素沉着的组合物的用途。本发明也提供一种分离自大豆间座壳菌(Diaporthecaulivora)提取物的新颖化合物，以及包含该化合物的组合物。

Description

大豆间座壳菌提取物用于抗紫外线伤害及减少色素沉着的用途

技术领域

本发明是关于大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)提取物在制备用于抗紫外线伤害及减少色素沉着的组合物的用途。

背景技术

太阳辐射中的紫外线（ultraviolet, UV）对生物体皮肤影响甚大，过量的紫外光照射除了会导致皮肤变黑，且使皮肤表层吸收紫外线产生自由基；而体内若累积过多的自由基则会产生氧化应激，使防御系统无法平衡调节，导致细胞损伤。虽然有些天然物质经研究证实具有紫外线保护及抑制黑色素的效果，但其几乎为植物来源的提取物或组合物；关于微生物应用于保养品开发者目前多为外生菌（如灵芝、木耳）的应用，关于内生菌的研究甚少。

大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)为间座壳科的菌种，其为植物病原菌，常感染黄豆；根据过去文献回顾，发现其化学成分以及生物活性尚未被深入探讨过。

虽然先前文献已验证大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)具有抗炎活性，但尚未证实大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)提取物可以用来预防紫外线所造成的皮肤伤害，也未证实大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)提取物可以用来抑制黑色素生成或减少色素沉着。

发明人针对现有技术的不足，经过悉心试验与研究，并以锲而不舍的精神，最终构思出本案“大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)提取物用于抗紫外线伤害及减少色素沉着的用途”，能够克服现有技术的不足，以下为本案的简要说明。

发明内容

除非另外特别加以定义，在此叙述中所用的名词将具有本领域技术人员已知的普通且常见的含意。

本发明自大武新木姜子( Neolitseadaibuensis)的叶子中分离出内生菌：大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)，并将其开发成具抗紫外线伤害及减少色素沉着作用的组合物，该组合物可预防皮肤遭受紫外线伤害，并具有美白皮肤的功效，可单独使用或作为医药品、化妆品、或保养品的活性添加物。本发明的大豆间座壳菌，其分类命名为大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)，于2020年10月23日保藏于德国生物保藏中心（DSMZ），其保藏编号为：DSM33674。

本发明将大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)分别经固态以及液态发酵所得到的固态发酵物及液态发酵物作为实验目标，固态发酵物经95%乙醇浸泡、减压浓缩后得到乙醇提取物，通过柱层析进行分离纯化后得到化合物1-18。其中化合物1、2、5、6、9、10、11、12、13、14及15为新颖化合物，而化合物3为首次从天然物中分离得到的化合物。将大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)提取物以及该18个化合物进行细胞安全性试验，确认其对细胞具有安全性，由光保护试验中显示大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)提取物具有紫外线保护效果，并且可抑制由紫外线照射所导致的活性氧物质上升。另外，于黑色素抑制试验中发现大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)提取物具有抑制酪氨酸酶及抑制黑色素作用，使其具有良好减少色素沉着的效果。将大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)提取物中分离的化合物进行活性试验，发现该些化合物具有抗紫外光损伤的效果，亦具有抑制酪氨酸酶及黑色素的作用。本发明证实大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)提取物以及其二次代谢物具有抗紫外线伤害及减少色素沉着活性，此实验结果可供化妆品或保养品等相关产业的美白、防晒、及抗老化产品开发及发展推广，或用于医药品用以预防或治疗过度曝露于紫外线所造成的过度色素沉着、皮肤老化等不适或疾病。

因此，本发明提供一种大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)提取物用于制备防晒美白组合物的用途。本发明中所使用的术语“防晒美白组合物”是指具有抗紫外线伤害及减少色素沉着效果的组合物。在一实施例中，该防晒美白组合物可保护细胞减少紫外线伤害、抑制紫外线造成的活性氧物质上升、并抑制酪氨酸酶及黑色素的生成。前述的防晒美白组合物可单独使用作为医药品、化妆品、或保养品，或作为医药品、化妆品、或保养品（例如化妆水、精华液、乳液及防晒霜等）的活性添加物。前述的防晒美白组合物可用于预防或治疗由于过度曝露于紫外线所造成的不适或疾病(如过度色素沉着、皮肤老化等)或光伤害状态(如红斑、结垢、水肿、厚度改变、晒斑、免疫反应被抑制、肿瘤发生(tumorigenesis)、或其任意组合)，以及用于预防或治疗过度色素沉着所造成的不适或疾病，包括但不限于雀斑(freckle)、黄褐斑(chloasma)、妊娠纹(striae of pregnancy)、老人斑(senile plaque)、以及黑色素瘤(melanoma)。由上述可知，本发明的防晒美白组合物除防晒美白外，亦具有抗皮肤老化的功效，可应用作为防晒、美白、抗皮肤老化产品或防晒、美白、抗皮肤老化产品中的活性添加物。在一实施例中，该防晒美白组合物用于制备外用化妆品或皮肤制剂。在一实施例中，该大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)提取物是以溶剂提取大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态发酵物所得的提取物，该溶剂可为有机溶剂，包括但不限于乙醇。在另一实施例中，该大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)提取物是以溶剂与大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)液态发酵物进行等体积液液分配(liquid-liquid partition)所得的提取物，该溶剂可为有机溶剂，包括但不限于乙醇。在一实施例中，该大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)提取物包含至少一种选自以下的化合物：caulivotrioloxin A、caulivotrioloxin B、caulivotrioloxin C、caulivotrioloxin D、caulivotrioloxin E、caulivotrioloxin F、caulibysin A、caulibysin B、diapopyrone、diapophthalide A、diapophthalide B。

本发明亦提供一种分离自大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)提取物的化合物，其选自：caulivotrioloxin A、caulivotrioloxin B、caulivotrioloxin C、caulivotrioloxin D、caulivotrioloxin E、caulivotrioloxin F、caulibysin A、caulibysin B、diapopyrone、diapophthalide A、diapophthalide B。

本发明进一步提供一种组合物，其包含至少一种前述的化合物。在一实施例中，该组合物具有抗紫外线伤害的效果。在另一实施例中，该组合物具有减少色素沉着的效果。

本发明的组合物可形成乳霜、软膏、乳液、化妆水、乳浆、糊状物或慕丝(mousse)等外观。视需要可经由烟雾剂形式将其施用于皮肤，亦可为固体形式，例如棒状物形式。本发明的组合物也可运用于任何局部施用制剂形态的医药品、保养品、或化妆品，特别是水溶液、水-醇溶液或含油溶液，油溶于水或水溶于油或多重的乳状液，水性或油性凝胶，液状、糊状或固状无水产物。本领域技术人员会谨慎选择辅助剂，辅助剂的种类及其用量是根据本发明的化合物或提取物的性质考虑，不会或实质上不至于因所构思的添加而有不利的影响。

本发明的组合物也可包含在保养品、化妆品或皮肤科制剂中常见的辅助剂，例如亲水性或亲油性胶凝剂、亲水性或亲油性活性剂、保存剂、抗氧化剂、溶剂，香料、填充剂、防晒剂、颜料、气味吸收剂及染料等。这些不同辅助剂的量为所考虑领域中的已知用量，例如：占组成物总重量的0.01至20%。根据其性质，这些辅助剂可被送入脂肪相、水相、脂囊。

当本发明的组合物为一种乳状液时，相对于组成物总重量，脂肪相的比例范围可从5至80重量%，例如：从5至50重量%。用于乳状液形式的本组成物中的油、乳化剂及辅助乳化剂等是选自已知用于所考虑领域的试剂。相对于组成物总重量，乳化剂与辅助乳化剂存在于组成物中的比例范围为从0.3至30重量%，例如：从0.5至20重量%。

可用于本发明的油类原料，可为例如液体石油的矿物油类、鳄梨油、大豆油的植物油类，羊毛脂的动物油类、合成油、全氢角鲨烯(perhydrosqualene)、硅油、环甲硅氧烷(cyclomethicone)、氟化油、或全氟聚醚。也可使用鲸蜡醇的脂肪醇、脂肪酸及巴西棕榈蜡、地蜡的蜡类等作为脂肪物质。

可用于本发明的乳化剂与辅助乳化剂原料，可为例如：聚乙二醇的脂肪酸酯（如PEG-20硬脂酸酯）、及甘油的脂肪酸酯（如硬脂酸甘油酯）。可用于本发明的亲水性胶凝剂原料，可为例如：羧乙烯基聚合物、卡波姆(carbomer)、丙烯酸酯/烷基丙烯酸酯共聚物的丙烯酸系共聚物、聚丙烯酰胺、聚糖、天然树胶、及黏土。可用于本发明的亲油性胶凝剂原料，可为例如：皂土的改性黏土、脂肪酸的金属盐类、疏水性硅石、及聚乙烯。

可用于本发明的活性剂，可为例如：多元醇、维他命、角质溶解剂及/或去鳞片剂、抗炎剂、镇静剂(calmant)及其混合物、脱色素剂（例如曲酸）、及其衍生物。本发明的组合物中也可使用亲油性或亲水性的UV屏蔽剂，例如苯-1,4-双(3-亚甲基-10-樟脑磺酸)、2-乙基己基α-氰基-β,β-二苯基丙烯酸或氰双苯丙烯酸辛酯(octocrylen)、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷、甲氧基肉桂酸辛酯及/或氧化钛和氧化锌。

可用于本发明的化妆品粉末通常包含填充剂、颜料、及珍珠。适宜的填充剂包括硅石、表面处理型硅石、氧化铝、表面处理型氧化铝、滑石及表面处理型滑石、硬脂酸锌、云母及表面处理型云母、高岭土、如Orgasol TM的尼龙(Nylon)粉、聚乙烯粉末、Teflon TM、淀粉、氮化硼、月桂酰离胺酸、共聚物微球、交联聚甲基丙烯酸酯共聚物、及聚硅氧树脂微珠、及其类似物。

生物材料保藏说明

分类命名：大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)

保藏机构：德国生物保藏中心（Leibniz-InstitutDSMZ - German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures GmbH）

保藏机构简称：DSMZ

地址：德国布伦瑞克茵霍芬大街7B38124（Inhoffenstraße7B,38124Braunschweig, GERMANY）

保藏日期：2020年10月23日

保藏编号：DSM33674。

附图说明

图1. 大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态发酵物的提取物及其活性提取层制备流程。溶剂A为水；溶剂B为乙酸乙酯。DC-S-EtOH为大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态发酵物的乙醇提取物；DC-S-EA为乙酸乙酯溶解层；DC-S-W为水溶解层。

图2. 大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)液态发酵物的提取物及其活性提取层制备流程。溶剂A为水；溶剂B为乙酸乙酯。将液态发酵物与乙酸乙酯(v/v, 1:1)进行液液分配 (liquid-liquid partition)，得到DC-L-EA为乙酸乙酯溶解层；DC-L-W为水溶解层。

图3. 大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态发酵物的乙醇提取物的分离流程。D为二氯甲烷；M为甲醇；*为新化合物；**为天然物首次分离的化合物。

图4. 大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)的化合物结构图。

图5. (A)浓度30 μg/mL下大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物和其活性提取层的安全性分析。(B) 300 μg/mL下大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物和其活性提取层的安全性分析。

图6. (A)浓度10 μM下大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态发酵物分离的化合物1-9的安全性分析。(B)浓度50 μM下大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态发酵物分离的化合物1-9的安全性分析。**: P<0.01表示与照射紫外线的对照组有显著性差异。

图7. 大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物和其活性提取层对于被紫外线伤害的细胞的光保护效果（浓度为30及300 µg/mL）。##: P<0.01表示与未照射紫外线的对照组有显著性差异；**: P<0.01表示与照射紫外线的对照组有显著性差异；Qu(quercetin，槲皮素)及atRA (all-trans retinoic acid，全反式维甲酸)为阳性对照组。

图8. 大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态发酵物化合物1-9对于被紫外线伤害的细胞的光保护效果（浓度为10及50 µM）。##: P<0.01表示与未照射紫外线的对照组有显著性差异；**P<0.01表示与照射紫外线的对照组有显著性差异；Qu (quercetin)及atRA (all-trans retinoic acid)为阳性对照组。

图9. 大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物和其活性提取层对于被紫外线诱发的细胞内活性氧物质的抑制效果（浓度为30及300 µg/mL）。##: P<0.01表示与未照射紫外线的对照组有显著性差异；**: P<0.01表示与照射紫外线的对照组有显著性差异；Qu (quercetin)及atRA (all-trans retinoic acid)为阳性对照组。

图10. 大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态发酵物分离的化合物1-9对于被紫外线诱发的细胞内活性氧物质的抑制效果（浓度为10及50 µM）。##: P<0.01表示与未照射紫外线的对照组有显著性差异；**: P<0.01表示与照射紫外线的对照组有显著性差异。Qu (quercetin)及atRA (all-trans retinoic acid)为阳性对照组。

图11. 大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态发酵物乙酸乙酯提取层(DC-S-EA)对紫外线诱导COX-2蛋白表达量的抑制作用。

图12. 大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物和其活性提取层(300 μg/mL)及分离的化合物1-9 (50 μM)于小鼠黑色素瘤细胞的安全性分析。*: P<0.05表示与含α黑色素细胞刺激素诱导剂的对照组有差异。**: P<0.01表示与含α黑色素细胞刺激素诱导剂的对照组有显著性差异。熊果苷(arbutin)及曲酸(kojic acid)为阳性对照组。Cpd: 化合物。

图13. 大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物和其活性提取层及化合物1于小鼠黑色素瘤细胞的安全性分析。*: P<0.05表示与含α黑色素细胞刺激素诱导剂的对照组有差异。**: P<0.01表示与含α黑色素细胞刺激素诱导剂的对照组有显著性差异。熊果苷(arbutin)及曲酸(kojic acid)为阳性对照组。Cpd: 化合物。

图14. 大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物和其活性提取层的酪氨酸酶抑制效果。*: P<0.05表示与含α黑色素细胞刺激素诱导剂的对照组有差异。**:P<0.01表示与含α黑色素细胞刺激素诱导剂的对照组有显著性差异。熊果苷(arbutin)及曲酸(kojic acid)为阳性对照组。

图15. 大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态发酵物分离的化合物1-9的酪氨酸酶抑制效果。*: P<0.05表示与含α黑色素细胞刺激素诱导剂的对照组有差异。**: P<0.01表示与含α黑色素细胞刺激素诱导剂的对照组有显著性差异。熊果苷(arbutin)及曲酸(kojic acid)为阳性对照组。Cpd：化合物。

图16. 大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物和其活性提取层与化合物1的酪氨酸酶抑制效果。*: P<0.05表示与含α黑色素细胞刺激素诱导剂的对照组有差异。**: P<0.01表示与含α黑色素细胞刺激素诱导剂的对照组有显著性差异。熊果苷(arbutin)及曲酸(kojic acid)为阳性对照组。Cpd: 化合物。

图17. 大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物和其活性提取层的黑色素抑制效果。*: P<0.05表示与含α黑色素细胞刺激素诱导剂的对照组有差异。**: P<0.01表示与含α黑色素细胞刺激素诱导剂的对照组有显著性差异。熊果苷(arbutin)及曲酸(kojic acid)为阳性对照组。

图18. 大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态发酵物分离的化合物1-9的黑色素抑制效果。*: P<0.05表示与含α黑色素细胞刺激素诱导剂的对照组有差异。**: P<0.01表示与含α黑色素细胞刺激素诱导剂的对照组有显著性差异。熊果苷(arbutin)及曲酸(kojic acid)为阳性对照组。Cpd: 化合物。

图19. 大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物和其活性提取层与化合物1的黑色素抑制效果。*: P<0.05表示与含α黑色素细胞刺激素诱导剂的对照组有差异。**: P<0.01表示与含α黑色素细胞刺激素诱导剂的对照组有显著性差异。熊果苷(arbutin)及曲酸(kojic acid)为阳性对照组。

图20. 化合物1对酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白的作用。熊果苷(arbutin) (1mM)及曲酸(kojic acid) (1 mM)为阳性对照组。

图21. 化合物1的UVB光毒性评估。##P<0.01表示与未照射UVB的对照组有显著性差异。**P<0.01表示与照射UVB的对照组有显著性差异。

具体实施方式

本发明可能以不同的形式实施，并不仅限于下列文中所提及的实例。下列实施例仅作为本发明不同方面及特点中的代表。

实施例1、大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物的提取物及其活性的提取层制备流程

将大武新木姜子叶片使用解剖刀将其切割成约7×7 mm²共15片，放入离心管中先以95%酒精消毒30秒，再以3.5% NaClO进行表面消毒2分钟，接着以95%酒精消毒30秒，于滤纸上沥干，直接置入MEA (malt extract agar)培养基(2%的麦芽抽出物培养基)上，培养于室温，待菌丝由组织长出后，进行分离纯化，切取菌丝尖端移植于MEA平板上，于25℃培养14天后进行保存。所有分离的菌株皆进行冷冻保存，将菌丝连同洋菜切下0.5 cm²大小数块，移至含0.5 mL抗冻保护剂的冷冻管内，保存于‒80℃，待有实验需要时再取出重新活化。菌种鉴定：将该菌株在室温下静置培养7到14天后，以NucleoSpin^® PlantⅡ提取真菌菌丝的DNA。选用ITS1/ITS4引物对 (SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2)进行PCR反应，增幅ITS1-5.8S-ITS2序列(SEQ ID NO: 3)，该序列与NCBI GenBank上序列分析结果最接近大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)。

将在来米清洗后以0.2%海宝（增碱剂）、0.2%酒石酸浸泡过夜，滤去多余水分，分装每罐100 g，高温高压杀菌，接种前添加营养液15 ml（0.2%海宝、0.2%NH₄Cl、0.2%酵母提取物），以作为大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)的固态培养基。接种大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)于固态培养基时，将一片长满9厘米平板的菌种放置于100 ml无菌水中打碎，每罐接种10 ml后搅拌均匀，然后于25℃避光静置培养14天。液态培养基的制作是在1.0 L的去离子水(pH=6)中加入玉米淀粉30 g (加入玉米淀粉后，添加2.5％α-淀粉酶，微波加热，使淀粉糊化)、玉米浸渍液(corn steep liquor)10 g、酵母提取物5 g、海宝(hipo)2 g后，将其分装于150 mL/500 mL三角瓶。接种大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)于液态培养基时，将一片长满9厘米平板的菌种放置于100 ml无菌水中打碎，接着于无菌操作室中接种10 mL至液态培养基中，接种后放置到25℃培养室的振荡器 (100 rpm)上培养14天。大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态发酵物(DC-S)的提取流程可参考图1；大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)液态发酵物(DC-L) 的提取流程可参考图2。

固态发酵物部分如图1所示，将DC-S以乙醇浸泡三天，共两次，浸泡后的提取液经减压浓缩后得到乙醇提取物 (DC-S-EtOH，45.0 g)，利用水及乙酸乙酯 (v/v, 1:1)进行液液分配 (liquid-liquid partition)后得到不同极性的提取层。液态发酵物部分如图2所示，将DC-L及乙酸乙酯(v/v, 1:1)进行液液分配 (liquid-liquid partition)，得到不同极性的提取层。

实施例2、大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物的提取物及其活性的提取层结果分析

固态发酵物部分：将DC-S (1.4 kg)于室温下以2000ml乙醇浸泡，每次三天共两次，浸泡后的提取液经减压浓缩后得到45.0g乙醇提取物 (DC-S-EtOH)，利用水及乙酸乙酯(v/v, 1:1)进行液液分配 (liquid-liquid partition)后得到水溶解层(DC-S-W，11.0 g)及乙酸乙酯溶解层(DC-S-EA，1.1 g)。

液态发酵物部分：将DC-L(900 ml)及乙酸乙酯(v/v, 1:1)进行液液分配(liquid-liquid partition)后得到水溶解层(DC-L-W，6.1 g)及乙酸乙酯溶解层(DC-L-EA，147.3mg)。

实施例3、大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态发酵物所含化合物分析

参考图3，大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态发酵物经由95%乙醇浸泡，每次三天共三次，浸泡后的提取液经减压浓缩后得到乙醇提取物，利用柱层析进行成分分离及纯化，共得到18个化合物（参考图4），包含11个新化合物：caulivotrioloxin A（化合物1）、caulivotrioloxin B（化合物2）、caulivotrioloxin E（化合物5）、caulivotrioloxin D（化合物6）、caulibysin A（化合物9）、caulivotrioloxin C（化合物10）、caulivotrioloxinF（化合物11）、diapopyrone（化合物12）、caulibysin B（化合物13）、diapophthalide A（化合物14）、diapophthalide B（化合物15）；一个天然物首次分离之化合物：3- O-desmethylphomentrioloxin（化合物3）；以及六个已知化合物：phomentrioloxin（化合物4）、de- O-methyldiaporthin（化合物7）、adenosine（化合物8）、mellein（化合物16）、palmitic acid（化合物17）、及ergosterol peroxide （化合物18）。

实施例4、大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora，DC)固态及液态发酵物提取层和化合物的人类角质细胞株细胞安全性测试

1.配置DC提取层 (DC-L-EA, DC-S-EA, DC-S-W)及化合物1-9于培养基中，以二甲基亚砜试剂作为对照组，DC提取物测试浓度分别为30及300 µg/mL，而化合物测试的浓度分别为10及50 µM。

2.将人类角质细胞株细胞(HaCaT cells)种于96孔板，每一孔为1 x 10⁴个细胞，并待细胞贴附于板。

3.经过不同时间点（24、48、及72小时）的2个小时前添加10 µL的0.2 mg/mL荧光染剂（Resazurin试剂），置于含有5% CO₂、温度为37℃的培养箱中等待，并检测其荧光 (ex/em: 530 nm/590 nm)及吸光值 (570 nm及600 nm)，来求得细胞存活率。

实施例5、大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物提取层和化合物的人类角质细胞株细胞安全性结果分析

此实验使用人类角质细胞株 (HaCaT cell line)测试DC提取层及化合物1-9是否对细胞生长有影响。结果显示浓度为30 μg/mL及300 μg/mL的DC提取层(DC-L-EA, DC-S-EA, DC-S-W)与24小时对照组相比，于经过48及72小时内，没有任何处理的对照组的细胞的生长有依时间的增加而增加的趋势。不同样品同时间的比较下，此三个提取层对细胞生长并没有明显影响（参考图5）。

图6显示浓度为10 μM以及50 μM的化合物1-9与24小时对照组相比，经过48及72小时，没有任何处理的对照组的细胞的生长有依时间的增加而增加的趋势。化合物1-9同样有此趋势，表明化合物对细胞生长并无明显影响。

实施例6、大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物提取层和化合物的光保护试验

1. 配置DC提取层 (DC-L-EA, DC-S-EA, DC-S-W)及化合物1-9于培养基中，以二甲基亚砜试剂作为对照组，此次植物内生菌提取物测试浓度分别为30及300 µg/mL，而化合物测试浓度为10及50 µM。

2. 将人类角质细胞株 (HaCaT cell line)种于96孔板，每一孔为1 x 10⁴个细胞，并待细胞贴附于孔板。

3. 待细胞贴附后，加入以配置好的待测物―DC提取层及化合物1-9，培养6小时。

4. 时间到后，将DC提取层及化合物1-9的培养液吸半干，再用1倍磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline; PBS)清洗残留于96孔板中的培养液，清洗后吸出再加入100 µL的1倍磷酸盐缓冲生理盐水于96孔板中，利用能量40 mJ/cm²的紫外线照射。重新添加含有DC提取层及化合物1-9的培养液于96孔板，培养24小时。

5. 孔板处理完后照射能量40 mJ/cm²的紫外线，照射完后再将含有DC提取层及化合物1-9的培养液加进孔板之中，并培养24小时。

6. 并于24小时之2个小时前添加10 µL的0.2 mg/mL Resazurin试剂，置于含有5%二氧化碳、温度为37℃的培养箱中等待检测其荧光 (ex/em: 530 nm/590 nm)及吸光值(570 nm及600 nm)，来求得细胞存活率。

实施例7、大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物提取层和化合物的光保护结果分析

此实验使用人类角质细胞株来评估被紫外线照射的细胞的存活率，测试DC提取层及化合物1-9是否具有紫外线光保护效果。所有的数据与0小时且没做任何处理的对照组相比，经过24小时没经任何处理的对照组的细胞的生长有依时间的增加而增加的趋势，照射过紫外线后培养24小时的细胞存活率被紫外线伤害而下降。比较DC提取层及化合物1-9对细胞的保护效果，及不同DC提取层在浓度为30 μg/mL及300 μg/mL的作用下，大部分都有保护效果，其中以DC-S-EA效果最佳（参考图7）。而在10及50 µM 的化合物1-9中，除了化合物1对被紫外线伤害的细胞的保护效果不佳外，但大部分的化合物都有保护效果，尤其是化合物7、8、9的保护效果最佳（参考图8）。

实施例8、大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物提取层和化合物对于紫外线诱导活性氧物质抑制效果

1. 配置DC提取层 (DC-L-EA, DC-S-EA, DC-S-W)及化合物1-9于培养基中，以二甲基亚砜试剂作为对照组，此次植物内生菌提取物浓度为30及300 µg/mL而化合物测试的浓度为10及50 µM。

2. 将人类角质细胞株种于96孔板，每一孔为1x10⁴个细胞，并待细胞贴附于孔板。

4. 时间到后，将含有DC提取物或其化合物的培养液吸半干，用1倍磷酸盐缓冲生理盐水清洗残留于96孔板中的培养液，清洗后吸出，再加入荧光染剂2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸 (H₂DCFDA)于96孔板之中，并置于含有5%二氧化碳、温度为37℃的培养箱中避光30分钟。

5. 待时间到时，将2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸吸出，用100 µL的1倍磷酸盐缓冲生理盐水清洗1次，清洗后吸出，再加入100 µL的1倍磷酸盐缓冲生理盐水于96孔板中，利用能量40 mJ/cm²的紫外线照射，并检测其荧光 (ex/em: 485 nm/530 nm)，来求得细胞内活性氧物质的含量。

实施例9、大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物提取层和化合物对于活性氧物质抑制效果分析

此实验使用人类角质细胞株测试DC提取层 (DC-L-EA, DC-S-EA, DC-S-W)及化合物1-9是否会抑制细胞内被紫外线诱发的活性氧物质。所有的数据都与没有照射紫外线的对照组相比，照射过紫外线后的活性氧物质荧光值有被紫外线诱导上升，并以照射过紫外线 40 mJ/cm²的荧光值为基准，来比较DC提取层及化合物1-9对细胞内活性氧物质的抑制效果。其中DC-S-EA、DC-S-W及大部分的化合物对细胞内活性氧物质有抑制效果（参考图9），其中以化合物7、8、9对细胞内活性氧物质的抑制效果最佳（参考图10）。

实施例10、大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)提取物 (DC-S-EA)对紫外线诱导环氧合酶-2(COX-2)蛋白表达量的抑制作用：蛋白质印迹分析

1. 配置DC-S-EA于二甲基亚砜试剂中，DC提取物测试浓度为30及300 µg/mL。人类角质细胞株细胞以2 x 10⁶种于10厘米培养皿中，待细胞贴附后添加DC提取物培养6个小时。

2. 将含有DC提取物培养液吸半干，用1倍磷酸盐缓冲生理盐水清洗1次残留培养液，吸出后再加入7 mL的1倍磷酸盐缓冲生理盐水，并利用能量20 mJ/cm²的紫外线照射再重新添加含有DC-S-EA的培养液于培养皿，置于含有5%二氧化碳、温度为37℃的培养箱中等待12小时。

3. 培养液吸干后添加350 µL的放射免疫沉淀法缓冲液(radioimmunoprecipitation assay buffer; RIPA reagent)并刮下细胞，放置于微量离心管(eppendrof)以15,000 rpm于4℃经10分钟的条件下离心，上清液吸出置于新的微量离心管中于‒80度冰箱保存。

4. 利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis; SDS-page)以80伏特进行蛋白质分离电泳，并以0.35安培3个小时转膜到硝酸纤维素膜(Blotting membrane)上。

5. 转膜完成后将膜浸泡于5%脱脂牛奶振荡至隔天。

6. 以1倍三羟甲基氨基甲烷缓冲液 (tris(hydroxymethyl)aminomethane; TBSbuffer)清洗10分钟重复三次。

7. 加入目标蛋白质的一级抗体，于振荡器上并保持在4℃上直至隔天。

8. 以1倍三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗10分钟重复三次，加入二级抗体置于振荡器上1小时，一样以1倍三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗10分钟重复三次。

9. 于硝酸纤维素膜上添加1 mL显影剂，均匀分散后放进冷光影像仪拍照并储存实验结果行图像定量与分析。

实施例11、大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)提取物 (DC-S-EA)对紫外线诱导环氧合酶-2(COX-2)蛋白表达量的抑制效果分析

本实验使用蛋白印迹分析进行DC固态发酵物乙酸乙酯提取层 (DC-S-EA)对紫外线诱导环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2; COX-2)反应的抑制作用。与12小时对照组相比，被能量20 mJ/cm²的UVB照射后环氧合酶-2表达增加，在不同浓度30 µg/mL的DC-S-EA作用下，环氧合酶-2的表达下降表明DC-S-EA抑制了被紫外线诱导的炎症反应（参考图11），且30μg/mL的效果优于300 μg/mL，显示低浓度即可有作用。

实施例12、大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物提取层和化合物的小鼠黑色素瘤细胞安全性测试

1. 配置DC提取层 (DC-L-EA, DC-S-EA, DC-S-W)及化合物1-9于培养基中，以二甲基亚砜试剂作为对照组，DC提取物测试浓度为300 µg/mL，而化合物测试的浓度为50 µM。

2. 将小鼠黑色素瘤细胞（B16-F10细胞）种于24孔板，每一孔为5 x 10⁴个细胞，并待细胞贴附于孔板。

3. 添加10 µL的0.2 mg/mL Resazurin试剂，置于含有5% CO₂、温度为37℃的培养箱中等待2个小时，并检测其荧光(ex/em: 530 nm/590 nm)及吸光值 (570 nm及600 nm)，以求得细胞存活率。

实施例13、大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物提取层和化合物的小鼠黑色素瘤细胞安全性结果分析

此实验使用小鼠黑色素瘤细胞（B16-F10细胞）测试DC提取层及化合物1-9是否对细胞生长有影响。与未进行任何处理的对照组相比，结果显示浓度为300 μg/mL的DC提取层(DC-L-EA, DC-S-EA, DC-S-W)及浓度为50 μM的化合物1-9对细胞生长并没有明显影响（参考图12及图13）。

实施例14、大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物提取层和化合物对于酪氨酸酶的抑制效果

1. 在24孔板种入5x10⁴个小鼠黑色素瘤细胞，加入100 µl的α黑色素细胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone;α-MSH)(50 nM)诱导黑色素 (melanin)生成，置于37℃、内含5% CO₂的培养箱中培养24小时，以诱导黑色素生成。

2. 移除培养基质，加入配置好的DC提取层 (DC-L-EA, DC-S-EA, DC-S-W)及化合物1-9后，置于培养箱中培养48小时，DC提取层的浓度为30及300 µg/mL，而化合物测试的浓度为50 µM。

3. 时间到后，将细胞以1倍磷酸盐缓冲生理盐水（每孔500 µl）清洗两次，接着加入100 µl酪氨酸 (trypsin)及500 µl的1倍磷酸盐缓冲生理盐水收集细胞，于室温下以10,000转离心五分钟。

4. 移除上清液，加入细胞组织裂解缓冲液 (lysis buffer) （包含磷酸盐缓冲生理盐水、聚乙二醇辛基苯基醚 (triton X-100)及1 mM苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride or phenylmethylsulfonylfluorid; PMSF)）混合均匀，于4℃下反应30分钟，再以14,000转离心10分钟，加入以1 mg/ml配置于磷酸盐缓冲生理盐水的左旋多巴 (Levodopa; L-DOPA)，于37℃反应3小时，吸出180 μL至96孔板。

5. 利用全光谱盘式扫描仪在波长490 nm下观测待测物吸光值的变化，以求得抑制率。

实施例15、大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物提取层和化合物对于酪氨酸酶抑制效果分析

此实验使用小鼠黑色素瘤细胞（B16-F10细胞株）测试DC提取层 (DC-L-EA, DC-S-EA, DC-S-W)及化合物1-9的酪氨酸酶抑制效果。与黑色素细胞刺激素诱导的对照组相比，DC-S-EA、DC-L-EA有良好的酪氨酸酶抑制效果（参考图14），化合物1活性最佳，且于10、50、及100 µM呈现与市售美白剂曲酸 (kojic acid)效果相当的酪氨酸酶抑制效果（参考图15及图16）。

实施例16、大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物提取层和化合物对于黑色素的抑制效果

1. 在12孔板种入1x10⁵个小鼠黑色素瘤细胞，加入500 µl的α黑色素细胞刺激素(50 nM)，置于37℃、内含5% CO₂的培养箱中培养24小时，以诱导黑色素生成。

2. 移除培养基质，加入配置好的DC提取层 (DC-L-EA, DC-S-EA, DC-S-W)及化合物1-9后，置于培养箱中培养48小时，DC提取层浓度为30及300 µg/mL，而化合物测试的浓度为50 µM。

3. 加入200 µl胰蛋白酶及500 µl的1倍磷酸盐缓冲生理盐水，于室温下离心3,000转八分钟，在移出上清液，再加入100 µl 2N氢氧化钠 (NaOH)混合均匀，置于95 ℃烘箱加热15分钟，取出置96孔板，于波长405 nm下测定其吸光值。

实施例17、大豆间座壳菌( Diaporthecaulivora)固态及液态发酵物提取层和化合物对于黑色素的抑制效果分析

此实验使用小鼠黑色素瘤细胞（B16-F10细胞株）测试DC提取层 (DC-L-EA, DC-S-EA, DC-S-W)及化合物1-9的黑色素 (melanin)抑制效果。与黑色素细胞刺激素诱导的对照组相比，DC-L-EA有良好的黑色素抑制效果（参考图17），化合物1及化合物9具有抑制黑色素效果，其中化合物1活性最佳且于浓度100 µM下，具有接近市售美白剂曲酸 (kojic acid)效果的黑色素抑制活性（参考图18及图19）。

实施例18、Caulivotrioloxin A (化合物1)对酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白的作用：蛋白印迹分析

1.小鼠黑色素瘤细胞以2 x 10⁶个种于10厘米培养皿中，加入α黑色素细胞刺激素(50 nM)，置于37℃、内含5% CO₂的培养箱中培养24小时，以诱导黑色素生成。

2. 移除培养基质，加入配置好的化合物1测试培养基（浓度为5、10、50、100 µM），置于培养箱中培养，培养48小时。

3. 培养液吸干后添加350 µL的放射免疫沉淀法缓冲液(radioimmunoprecipitation assay buffer; RIPA reagent)并刮下细胞，放置于微量离心管 (Eppendorf)以15,000 rpm于4℃经10分钟的条件下离心，上清液吸出置于新的微量离心管中于‒80度冰箱保存。

4. 利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis; SDS-page)以80伏特进行蛋白质分离电泳，并以0.35安培3个小时转膜到硝酸纤维素膜 (Blotting membrane)上。

5. 转膜完成后将膜浸泡于5%脱脂牛奶振荡至隔天。

6. 以1倍三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗10分钟重复三次。

实施例19、Caulivotrioloxin A (化合物1)对酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白的作用分析

本实验使用蛋白印迹分析对化合物1对酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白的相关通路进行探讨，黑色素是由酪氨酸(tyrosine)所衍生，酪氨酸酶(tyrosinase)为黑色素生成通路时所需的酶，其下分为两个通路，酪氨酸酶相关蛋白-1 (tyrosinase related protein;TRP-1)与真黑色素 (eumelanin)生成相关，而酪氨酸酶相关蛋白-2 (tyrosinase relatedprotein; TRP-2)与褐黑素 (pheomelanin)的产生有关。而图20A可观察化合物1于浓度10、50、100 µM下，具有抑制酪氨酸酶蛋白表达量的效果，图20B则显示化合物1于浓度10及50 µM下，可抑制酪氨酸酶相关蛋白-1 (TRP-1)蛋白表达量，而化合物1于浓度50、100 µM可以些微抑制酪氨酸酶相关蛋白-2 (TRP-2)蛋白表达量（参考图20C），由实验结果可得知化合物1对于黑色素的抑制效果，可能源于其抑制酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白-1蛋白表达量。

实施例20、Caulivotrioloxin A (化合物1)的UVB光毒性效果

1. 配置化合物1于二甲基亚砜试剂中，化合物1测试低浓度和高浓度分别为10、50µM。

2. 将人类角质细胞株细胞 (HaCaT cells)种于96孔板，每一孔为1 x 10⁴个细胞，并待细胞贴附于孔板。

3. 细胞贴附后，加入配置好的待测物化合物1培养6个小时。

4. 时间到后，将含有化合物1的培养液吸半干，用1X PBS清洗1次残留于96孔板中的培养液，清洗后吸出，再加入100 µL的1倍磷酸盐缓冲生理盐水于96孔板中，利用能量40mJ/cm²的UVB照射。

5. 照射后将没有含化合物1的培养液添加于96孔板，培养24小时，并于24小时的2个小时前添加10 µL的0.2 mg/mL Resazurin试剂，置于含有5% CO₂、温度为37℃的培养箱中等待检测其荧光 (ex/em: 530 nm/590 nm)及吸光值 (570 nm及600 nm)，来求得细胞存活率。

实施例21、Caulivotrioloxin A (化合物1)对UVB的光毒性效果分析

由上述实施例12-19可证实化合物1具有抑制黑色素及酪氨酸酶的功效，为评估使用化合物1再经照光，是否会产生光毒性，遂进行本实验。本实验使用人类角质细胞株(HaCaT cells)测试化合物1是否加成UVB对细胞的损伤作用。图21显示化合物1 (10 μM)与UVB并无加成效果，不会造成细胞的加剧伤害效果，显示其光安全性。50 μM虽有影响，但并不显著。未来制成产品时建议可搭配防晒剂或于夜间使用。

本领域技术人员能迅速体会到本发明可很容易达成目标，并获得所提到的结果及优点，以及那些存在于其中的东西。本发明中的化合物、组合物、提取物及混合物、其制造程序与方法及其用途是较佳实施例的代表，其是示范性的且不仅局限于本发明领域。本领域的技术人员将会想到其中可修改之处及其他用途。这些修改都蕴含在本发明的精神中，并在权利要求中界定。本发明的内容叙述与实施例均揭示详细，得使本领域技术人员都能够制造及使用本发明，即使其中有各种不同的改变、修饰、及进步之处，仍应视为不脱离本发明的精神及范围。

说明书中提及的所有专利及出版品，都以和发明有关领域的现有技术为准。所有专利和出版品都在此被纳入相同的参考程度，就如同每一个个别出版品都被具体且个别地指出纳入参考。

在此所适当地举例说明的发明，可能得以在缺乏任何要件，或许多要件、限制条件或并非特定为本文中所揭示的限制情况下实施。所使用的名词及表达是作为说明书的描述而非限制，同时并无意图使用这类排除任何等同于所示及说明的特点或其部份的名词及表达，但需认清的是，在本发明的权利要求内有可能出现各种不同的改变。因此，应了解到虽然已根据较佳实施例及任意的特点来具体揭示本发明，但是本领域技术人员仍会修改和改变其中所揭示的内容，诸如此类的修改和变化仍在本发明的申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 高雄医学大学

财团法人食品工业发展研究所

<120> 大豆间座壳菌提取物用于抗紫外线伤害及减少色素沉着的用途

<130> 20F-1689-CNP

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物ITS1

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物ITS4

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 571

<212> DNA

<213>大豆间座壳菌 (Diaporthe caulivora)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(571)

<400> 3

gacctgcgga gggatcattg ctggaacgcg cccctggcgc acccagaaac cctttgtgaa 60

cttatacctt actgttgcct cggcgcaggc cggcccccct cggggggccc ctcggagacg 120

aggagcaggc ccgccggcgg cctagttaac tcttgttttt acactgaaac tctgagaaac 180

aaacataaat gaatcaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa 240

cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga 300

acgcacattg cgccctctgg tattccggag ggcatgcctg ttcgagcgtc atttcaaccc 360

tcaagcctgg cttggtgatg gggcactgcc tgtgaaaggg caggccctga aattcagtgg 420

cgagctcgcc aggaccccga gcgcagtagt taaaccctcg ctctggaagg ccctggcggt 480

gccctgccgt taaaccccca acttctgaaa atttgacctc ggatcaggta ggaatacccg 540

ctgaacttaa gcatatcaat aagcggagga a 571

Claims

1.一种大豆间座壳菌(Diaporthecaulivora)提取物用于制备防晒美白组合物的用途，所述大豆间座壳菌在DSMZ中的保藏编号为DSM33674，其中所述大豆间座壳菌提取物包含化合物caulivotrioloxin A。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述防晒美白组合物是具有抗紫外线伤害效果的组合物。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述防晒美白组合物是具有减少色素沉着效果的组合物。

4.如权利要求1所述的用途，其中所述防晒美白组合物是用于预防或治疗由于过度曝露于紫外线所造成的不适或疾病或光伤害状态。

5.如权利要求4所述的用途，其中所述不适或疾病为过度色素沉着或皮肤老化。

6.如权利要求4所述的用途，其中所述光伤害状态为红斑、结垢、水肿、厚度改变、晒斑、免疫反应被抑制、肿瘤发生、或其任意组合。

7.如权利要求1所述的用途，其中所述防晒美白组合物用于预防或治疗过度色素沉着所造成的不适或疾病，包含雀斑、黄褐斑、妊娠纹、老人斑、以及黑色素瘤。

8.一种分离自大豆间座壳菌(Diaporthecaulivora)提取物的化合物caulivotrioloxin A，所述大豆间座壳菌在DSMZ中的保藏编号为DSM33674。

9.一种组合物，其包含如权利要求8所述的化合物。

10.如权利要求9所述的组合物，其具有抗紫外线伤害的效果。

11.如权利要求9所述的组合物，其具有减少色素沉着的效果。