CN114522272A - 一种用于伤口修复的仿生血小板水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于伤口修复的仿生血小板水凝胶的制备方法，包括以下步骤：S1、抗凝全血加入到离心管中，第一次离心后获得的血浆；对血浆使用稀释剂稀释，进行第二次离心，用PBS混合液重悬第二次离心后获得的血小板；对悬浮在PBS混合液中的血小板利用超声辅助进行反复冻融获得血小板膜；对血小板膜进行第三次离心，丢弃上清液并分离出血小板膜；S2、在去离子水中添加海藻酸盐、1‑[3‑(二甲氨基)丙基]‑3‑乙基‑碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺，配置活化的海藻酸盐溶液；在去离子水中添加S1制备得到的血小板膜，配置血小板膜溶液；将活化的海藻酸盐溶液和血小板膜溶液混合，通过活化的海藻酸盐的羧基基团与血小板膜上的胺基共价偶联，形成仿生血小板水凝胶。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种用于伤口修复的仿生血小板水凝胶及其制备方法。
背景技术
伤口在生活和临床救治中时有发生，频繁的伤口治疗导致巨大财务支出。单纯依靠皮肤细胞自身的修复机能，周期长、易感染、且处理不当易造成二次伤害。迄今为止，已经开发了诸多用于伤口愈合的生物医用材料，如纳米纤维、海绵和水凝胶等。其中，水凝胶因具有良好的柔韧性、舒适性、透氧性、保水性和良好的组织液渗出吸收在伤口治愈表现了非凡的优势。然而大多报道所涉及的水凝胶制备工艺复杂，可重复性差，且不具备良好的生物相容性和血液相容性，对伤口的粘附性不好，止血效果不佳，其复杂的提取或聚合过程可能会导致有争议的生物相容性和免疫原性。此外，所获得的水凝胶机械性能固定不可调节，对伤口的适应性弱。再者，大多数水凝胶不具备防止伤口感染，促进伤口愈合的功能。
因此，亟需一种合成简单，生物相容性和血液相容性良好，机械性能可调的且具备杀菌性能的用于伤口修复的仿生血小板水凝胶。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足，提供一种用于伤口修复的仿生血小板水凝胶的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于伤口修复的仿生血小板水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备血小板膜：
将抗凝全血加入到离心管中，经第一次离心后获得富含血小板的血浆(PRP)；对血浆使用稀释剂稀释后，进行第二次离心，并用PBS混合液重悬第二次离心后获得的血小板；对悬浮在PBS混合液中的血小板利用超声辅助进行反复冻融获得血小板膜；对血小板膜进行第三次离心，丢弃上清液并分离出血小板膜；利用PBS缓冲液对血小板膜洗涤三次后，进行超声处理、冻干以及称重；
S2、制备仿生血小板水凝胶：
在去离子水中添加海藻酸盐、1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，配置活化的海藻酸盐溶液；在去离子水中添加S1制备得到的血小板膜(PLTM)，配置血小板膜溶液；将活化的海藻酸盐溶液和血小板膜溶液混合，通过活化的海藻酸盐的羧基基团与血小板膜上的胺基共价偶联，形成仿生血小板水凝胶。
为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：
进一步地，步骤S1中，所述抗凝全血为新鲜的或者在-4℃环境中保存一周以内的人或动物的抗凝全血，其用量为0.02-20mL。
进一步地，步骤S1中，所述第一次离心的离心力为100-500g，离心时间为5-30分钟；所述第二次离心的离心力为100-2000g，离心时间为5-50分钟；所述第三次离心的离心力为1000-10000g，离心时间为5-60分钟。
进一步地，步骤S1中，所述PBS混合液和PBS缓冲液中均添加有0.2-10mM的蛋白酶抑制剂，所述PBS混合液中还添加有0.1-15mM的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂。
进一步地，步骤S1中，在所述冻融这一步骤中，冷冻温度为-100～-20℃，解冻温度为1～45℃，冻融次数为1-10次；优选的，冷冻温度为-80℃，解冻温度为室温。
进一步地，步骤S1中，所述超声处理使用的超声仪频率设置为20-100kHz，功率设置为5-500W，超声时间设置为1-30分钟；优选的，频率设置为42kHz，功率设置为100W，超声时间设置为5分钟。
进一步地，步骤S2中，所述活化的海藻酸盐溶液体积为5-10000μL，海藻酸盐的浓度为0.2-20wt％，1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基-碳二亚胺的添加量为0.5-50mg，N-羟基琥珀酰亚胺的添加量为0.3-30mg。
进一步地，步骤S2中，所述血小板膜溶液的浓度为1-100mg/mL。
进一步地，步骤S2中，活化的海藻酸盐和血小板膜的混合溶液中添加有银纳米颗粒，其浓度为1-2000μg/mL；银纳米颗粒使仿生血小板水凝胶具有广谱的抗菌性。
本发明还提供一种通过上述制备方法得到的用于伤口修复的仿生血小板水凝胶。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供一种用于伤口修复的仿生血小板水凝胶，利用血小板和海藻酸盐作为伤口愈合元素，具有良好的生物相容性和血液相容性，粘附性好，能够有效止血，促进慢性伤口愈合中的血管生成、胶原沉积和肉芽组织生成，且该水凝胶无毒副作用，可批量化重复制备。
(2)本发明提供的用于伤口修复的仿生血小板水凝胶，通过血小板膜上的氨基基团和活化的海藻酸盐上的羧基基团一步共价偶联实现反应，原理及操作简单、无需多次复杂化学反应，成本低廉、可重复性高。
(3)本发明提供的用于伤口修复的仿生血小板水凝胶制备方法，可以通过改变血小板膜与海藻酸盐的添加比例，调节仿生血小板水凝胶的机械性能，以适应不同的伤口环境。
(4)本发明在血小板膜溶液中添加有银纳米颗粒，血小板膜溶液和活化的海藻酸盐溶液交联后，银纳米颗粒存在于交联后形成的仿生血小板水凝胶内部的空隙中，能够有效防止伤口细菌感染，促进伤口愈合。
附图说明
图1为仿生血小板水凝胶的制备流程图；
图2为仿生血小板水凝胶的实物及SEM表征图，其中a为仿生血小板水凝胶实物图，b为仿生血小板水凝胶的SEM表征图；
图3为实施例1中的仿生血小板水凝胶止血及抗菌效果表征图，其中a为对照组的止血效果图，b为实验组的止血效果图，c为抗金黄色葡萄球菌对照组的荧光图，d为抗金黄色葡萄球菌实验组的荧光图；
图4为实施例2中伤口愈合修复表征图，其中a为对照组创面HE染色结果，b为实验组创面HE染色结果，其中箭头指向范围为肉芽生长范围；c为对照组CD31和α-SMA双免疫荧光染色，d为实验组CD31和α-SMA双免疫荧光染色，其中箭头指向新生血管。
具体实施方式
实施例1
一种用于伤口修复的仿生血小板水凝胶，其制备过程如图1所示，具体包括以下步骤：
S1、制备血小板膜：
将10mL小鼠抗凝全血加入到离心管中，小鼠抗凝全血在280g离心力下第一次离心15分钟后获得富含血小板的血浆(PRP)；对血浆使用稀释剂稀释后，在500g离心力下进行第二次离心20分钟，并用包含2mM蛋白酶抑制剂和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂的PBS混合液重悬第二次离心后获得的血小板；对悬浮在PBS混合液中的血小板利用超声辅助进行3次反复冻融获得血小板膜(-80℃冷冻，室温下解冻)；将血小板膜在5000g离心力下进行第三次离心30分钟，丢弃上清液并分离出血小板膜；利用2mM的PBS缓冲液对血小板膜洗涤3次后，进行超声处理5分钟(频率：42kHz，功率：100W)、冻干以及称重；
S2、制备仿生血小板水凝胶：
在去离子水中添加0.2g海藻酸盐，制备120μL的2wt％的海藻酸盐溶液，向其中添加5mg的1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基-碳二亚胺(EDC)和3mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，用于活化海藻酸盐的羧基基团，配置活化的海藻酸盐溶液；在去离子水中添加S1制备得到的血小板膜(PLTM)，配置20mg/mL的血小板膜(PLTM)溶液；将活化的海藻酸盐溶液和血小板膜溶液混合，通过活化的海藻酸盐的羧基基团与血小板膜上的胺基共价偶联，形成仿生血小板水凝胶。在偶联过程中，将浓度为200μg/mL的银纳米颗粒添加至海藻酸盐溶液和血小板膜溶液的混合液中，并立即置于-20℃冰箱中冷冻保存24h。获得的仿生血小板水凝胶的实物图和SEM表征图分别如图2a和2b所示。
仿生血小板水凝胶的止血效果评估：使用小鼠肝出血模型评估仿生血小板水凝胶的止血效果，从同一批小鼠中挑选大小相近、生理状况相似的10只小鼠，用10％的水合氯醛从小鼠腹腔注入体内，等待5min后用消毒的手术刀，剖开小鼠腹部，使小鼠肝脏暴露，在小鼠体内肝脏处原位切除约三分之一的肝脏组织，用制备的200ul仿生水凝胶均匀涂敷在肝脏伤口处，并用白纸作为背景指示参考，在120s后拍摄伤口出血部位来监测肝脏的出血情况。图3a为对照组的肝脏伤口出血图，从中可观察到大量血液浸润白纸并沿着白纸流淌，通过称重测量，对照组在120s内总失血量为33.2±4.45mg。图3b为实验组的肝脏伤口出血图，从中可观察到当血小板水凝胶均匀涂敷在肝脏伤口处时，失血迅速得到有效控制，白纸上浸润少量的血液，通过称重测量，对照组在120s内总失血量为6.17±0.85mg。
仿生血小板水凝胶的抗菌性能测试：将200ul制备的仿生血小板水凝胶和0.5mcf浓度的金黄色葡萄球菌混合在一起，在培养皿中进行共培养，加入500ul培养液，在共同培养24h后，用活死染料在黑暗中对金黄色葡萄球菌进行染色，即SYTO处理30分钟，碘化丙啶处理5分钟，共聚焦激光扫描显微镜记录结果，绿色代表活的金黄色葡萄球菌，红色代表死亡的金黄色葡萄球菌。图3c为对照组的金黄色葡萄球菌的荧光显微图，大部分的金黄色葡萄球菌存活，小部分金黄色葡萄球菌死亡，死亡率为15％。图3d为实验组的金黄色葡萄球菌的荧光显微图，大部分的金黄色葡萄球菌死亡，小部分金黄色葡萄球菌存活，死亡率约为83％。上述结果说明在仿生血小板水凝胶中加入的200μg/mL的银纳米颗粒(AgNPs)大大提高了仿生血小板水凝胶的抗菌性能。
实施例2
一种用于伤口修复的仿生血小板水凝胶，其制备过程如图1所示，具体包括以下步骤：
S1、制备血小板膜：
将15mL小鼠抗凝全血加入到离心管中，小鼠抗凝全血在300g离心力下第一次离心15分钟后获得富含血小板的血浆(PRP)；对血浆使用稀释剂稀释后，在500g离心力下进行第二次离心20分钟，并用包含2mM蛋白酶抑制剂和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂的PBS混合液重悬第二次离心后获得的血小板；对悬浮在PBS混合液中的血小板利用超声辅助进行3次反复冻融获得血小板膜(-80℃冷冻，室温下解冻)；将血小板膜在5000g离心力下进行第三次离心30分钟，丢弃上清液并分离出血小板膜；利用2mM的PBS缓冲液对血小板膜洗涤3次后，进行超声处理5分钟(频率：42kHz，功率：100W)、冻干以及称重；
S2、制备仿生血小板水凝胶：
在去离子水中添加0.4g海藻酸盐制备240μL的2wt％的海藻酸盐溶液，向其中添加5mg的1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基-碳二亚胺(EDC)和3mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，用于活化海藻酸盐的羧基基团，配置活化的海藻酸盐溶液；在去离子水中添加S1制备得到的血小板膜(PLTM)，配置20mg/mL的血小板膜(PLTM)溶液；将活化的海藻酸盐溶液和血小板膜溶液混合，通过活化的海藻酸盐的羧基基团与血小板膜上的胺基共价偶联，形成仿生血小板水凝胶。在偶联过程中，将浓度为200μg/mL的银纳米颗粒添加至海藻酸盐溶液和血小板膜溶液的混合液中，并立即置于-20℃冰箱中冷冻保存24h。
仿生血小板水凝胶的伤口修复性能评估：从同一批小鼠中挑选大小相近、生理状况相似的9只小鼠，用10％的水合氯醛从小鼠腹腔注入体内，在小鼠背部，用剪刀剪出直径为0.6mm的伤口，并在伤口处添加2×108CFU/mL金黄色葡萄球菌，模拟背部金黄色葡萄糖球菌感染全层皮肤缺损模型。取预先制备好的200ul仿生血小板水凝胶处理伤口，在7天后对伤口进行拍照，结果如图4所示。图4a为对照组创面HE染色结果，图4b为实验组创面HE染色结果，其中箭头指向范围为肉芽生长范围，从中观察得到实验组所制备的仿生血小板水凝胶处理的伤口在7天后再生的肉芽组织厚度要比对照组厚，在伤口愈合中表现了优异的性能。此外，图4c为对照组CD31和α-SMA双免疫荧光染色结果，图4d为实验组CD31和α-SMA双免疫荧光染色结果，其中箭头指向新生血管，从中观察得到实验组所制备的仿生血小板水凝胶处理的伤口在7天后伤口处血管结构密度高于对照组，肉芽组织中血管加速生成。由图4结果可得，本发明提供的仿生血小板水凝胶能够加速伤口处肉芽组织和血管再生，是理想的伤口愈合生物医用材料。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于伤口修复的仿生血小板水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备血小板膜：
将抗凝全血加入到离心管中，经第一次离心后获得富含血小板的血浆；对血浆使用稀释剂稀释后，进行第二次离心，并用PBS混合液重悬第二次离心后获得的血小板；对悬浮在PBS混合液中的血小板进行反复冻融获得血小板膜；对血小板膜进行第三次离心，丢弃上清液并分离出血小板膜；利用PBS缓冲液对血小板膜洗涤后，进行超声处理、冻干以及称重；
S2、制备仿生血小板水凝胶：
在去离子水中添加海藻酸盐、1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，配置活化的海藻酸盐溶液；在去离子水中添加S1制备得到的血小板膜，配置血小板膜溶液；将活化的海藻酸盐溶液和血小板膜溶液混合，通过活化的海藻酸盐的羧基基团与血小板膜上的胺基共价偶联，形成仿生血小板水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种用于伤口修复的仿生血小板水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤S1中，所述抗凝全血为新鲜的或者在-4℃环境中保存一周以内的人或动物的抗凝全血，其用量为0.02-20mL。
3.根据权利要求1所述的一种用于伤口修复的仿生血小板水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤S1中，所述第一次离心的离心力为100-500g，离心时间为5-30分钟；所述第二次离心的离心力为100-2000g，离心时间为5-50分钟；所述第三次离心的离心力为1000-10000g，离心时间为5-60分钟。
4.根据权利要求1所述的一种用于伤口修复的仿生血小板水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤S1中，所述PBS混合液和PBS缓冲液中均添加有0.2-10mM的蛋白酶抑制剂，所述PBS混合液中还添加有0.1-15mM的乙二胺四乙酸抗凝剂。
5.根据权利要求1所述的一种用于伤口修复的仿生血小板水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤S1中，在所述冻融这一步骤中，冷冻温度为-100～-20℃，解冻温度为1～45℃，冻融次数为1-10次。
6.根据权利要求1所述的一种用于伤口修复的仿生血小板水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤S1中，所述超声处理使用的超声仪频率设置为20-100kHz，功率设置为5-500W，超声时间设置为1-30分钟。
7.根据权利要求1所述的一种用于伤口修复的仿生血小板水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤S2中，所述活化的海藻酸盐溶液体积为5-10000μL，海藻酸盐的浓度为0.2-20wt％，1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基-碳二亚胺的添加量为0.5-50mg，N-羟基琥珀酰亚胺的添加量为0.3-30mg。
8.根据权利要求1所述的一种用于伤口修复的仿生血小板水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤S2中，所述血小板膜溶液的浓度为1-100mg/mL。
9.根据权利要求1所述的一种用于伤口修复的仿生血小板水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤S2中，活化的海藻酸盐和血小板膜的混合溶液中添加有银纳米颗粒，其浓度为1-2000μg/mL。
10.一种如权利要求1-9中任一项所述的制备方法得到的用于伤口修复的仿生血小板水凝胶。
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