CN114515277A - 钙离子纳米螯合剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种钙离子纳米螯合剂及其制备方法和应用，该钙离子纳米螯合剂为核壳结构，内核为包含巯基结构且经1,2‑双（2‑氨基苯氧基）乙烷‑N,N,N′,N′‑四乙酸基聚乙二醇修饰的金颗粒，外壳为由丙烯酰胺、2‑甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽及引发剂原位自由基聚合形成的凝胶。本发明通过先制备钙离子螯合剂聚合物然后再在内核表面聚合形成凝胶外壳而制得钙离子纳米螯合剂，该制备方法简单温和，原料易得，适于大规模生产，制得的钙离子纳米螯合剂对Ca2+的选择性比Mg2+高100倍以上，用于制备抗肿瘤药物。

Description

钙离子纳米螯合剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于螯合剂材料技术领域，涉及一种离子纳米螯合剂，具体地说是钙离子纳米螯合剂及其制备方法和应用。
背景技术
钙离子是细胞内最重要的第二信使之一，在肿瘤发生发展过程中，异常的钙离子浓度将激活钙离子引发的循环信号促进细胞增殖、肿瘤发生和迁移的转导通路，从而促进肿瘤细胞无限增殖。因此，有效调控肿瘤细胞中的钙离子浓度是一种治疗肿瘤药物研发中的重要策略。
近年来，包括钙通道阻滞剂在内的能够阻断细胞内活性钙信号通路的药物已被相继开发用于癌症治疗。但钙通道阻滞剂使用后会出现具有水肿、潮红、头痛、头晕、嗜睡等不良反应，对细胞内已有钙离子螯合作用不大。
现有的钙离子螯合剂如：乙二胺四乙酸或者乙二醇双四乙酸，在螯合钙离子的同时也会与镁离子、锰离子、亚铁离子等二价金属离子螯合，因此对钙离子螯合的选择性较低，易引发其他金属离子缺失的副作用，如：贫血、脑和心脏疾病、生长迟缓，减慢金属酶催化的生化反应造成代谢紊乱。而1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N,N-四乙酸四(乙酰氧基甲基酯)(BAPTA-AM)是细胞渗透性钙螯合剂，进入细胞后可被酯酶水解成为活性钙螯合剂BAPTA，然后选择性地与Ca2+快速配对，从而降低细胞内钙浓度，但由于其水溶性差、在肾脏及肝脏的高富集以及在肿瘤内的渗透及滞留差的问题，临床治疗效果不佳同时也对正常组织的产生不可逆转的损伤，阻碍了其在体内的广泛应用，且上述螯合剂分子量较小，易在发挥作用前被降解。为了提高钙离子螯合能力，也有研究利用纳米载体(脂质体、聚合物胶束等)将钙离子螯合剂递送至肿瘤，来干预肿瘤中钙代谢；然而，该纳米螯合剂对钙螯合并非特异性，在吸附钙离子的同时也会吸附其他金属离子；另一方面，无法保证钙螯合剂在肿瘤部位释放及发挥作用。
发明内容
本发明的一个目的，是要提供一种钙离子纳米螯合剂，以1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸基聚乙二醇(Cac-PEG)修饰的金颗粒为内核；以由丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽及引发剂原位自由基聚合形成的凝胶为外壳，以达到制得具有良好的稳定性、生物相容性、低毒性的高螯合能力的肿瘤靶向钙离子纳米螯合剂的目的；
本发明的另一个目的，是要提供上述钙离子纳米螯合剂的制备方法，以达到高效制备钙离子纳米螯合剂；
本发明还有一个目的，是提供钙离子纳米螯合剂应用于制备抗肿瘤药物的应用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种钙离子纳米螯合剂，该钙离子纳米螯合剂为核壳结构，内核为包含巯基结构且经1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸基聚乙二醇(Cac-PEG)修饰的金颗粒；
外壳为由丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽及引发剂原位自由基聚合形成的凝胶。
作为一种限定，所述双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽，是两端丙烯酰胺化的短肽。
作为本发明的另一种限定，所述引发剂为过硫酸铵；
所述双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽，其氨基酸序列为VPLGVRTK、GGVPMSMRGGK、GPLGIAG、GPLGIAGQ、GPLGVRGDG、PLGLAG或PVGLIG。
作为本发明的第三种限定，所述内核的粒径为20～80nm；所述的外壳的粒径为5～50nm。
作为本发明的第四种限定，所述丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽的摩尔比为5～10：5～10：1。
本发明还提供了上述钙离子纳米螯合剂的一种制备方法，包括依次进行的以下步骤：
S1.钙离子螯合剂聚合物的制备
将羧基官能团化的钙离子螯合剂与巯基-PEG-氨基聚合物进行混合反应，纯化反应产物，得钙离子螯合剂聚合物；
S2.内核的制备
在含金纳米颗粒的水溶液中加入钙离子螯合剂聚合物和巯基-PEG-丙烯酰胺，反应得内核；
S3.外壳的制备
取丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽及引发剂在内核表面原位自由基聚合形成凝胶。
作为一种限定，所述羧基官能团化的钙离子螯合剂，是将5-甲基-2-硝基苯酚和1,2-二溴乙烷反应后，取产物与2-硝基苯酚反应，再依次经还原反应、酯化反应和氧化反应制得。
作为另一种限定，所述纯化为透析；所述含金纳米颗粒的水溶液由水热法制得；所述巯基-PEG-氨基聚合物中PEG的分子量为300～10000Da。
作为第三种限定，所述含金纳米颗粒的水溶液中金纳米颗粒的浓度为5～20mg/mL；
所述钙离子螯合剂聚合物和巯基-PEG-丙烯酰胺的质量比为0.25～4:1；所述反应的时间为12～20h。
钙离子螯合剂聚合物和巯基-PEG-丙烯酰胺的质量比优选为1:1。
本发明还提供了上述钙离子纳米螯合剂的一种应用，即所述钙离子纳米螯合剂用于制备抗肿瘤药物。
本发明的钙离子纳米螯合剂为基质金属蛋白酶响应性凝胶包被的核壳结构钙离子纳米螯合剂，制备成的抗肿瘤药物进入机体后，响应基质金属蛋白酶，凝胶降解，暴露出Cac-PEG中钙离子螯合位点，通过螯合作用，调控肿瘤内钙离子浓度，进而抑制肿瘤生长。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明提供了一种核壳结构钙离子纳米螯合剂，以1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸基聚乙二醇(Cac-PEG)修饰的金颗粒为内核；以丙烯酰胺和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱为单体，以双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽为交联剂；将上述单体、交联剂及引发剂原位自由基聚合于内核表面形成凝胶外壳，该钙离子纳米螯合剂具有良好的稳定性、生物相容性、低毒性及肿瘤靶向的钙螯合能力；
本发明的钙离子纳米螯合剂相较于商业化钙螯合剂BAPTA-AM，具有更好的亲水性、生物相容性及钙离子螯合性能：亲水性更好，从而避免在肾脏及肝脏的高富集以及在肿瘤内造成渗透及滞留差；生物相容性更好，避免对正常组织产生不可逆损伤；钙离子螯合性能强，针对性螯合钙离子，能够避免干扰体内镁离子、锰离子、亚铁离子等其它金属离子浓度与功能；
本发明的钙离子纳米螯合剂中，以双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽为交联剂，该交联剂具有基质金属蛋白酶响应性，在肿瘤区域靶向性断裂；两亲性的2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱具有优良的生物相容性和稳定性，使钙离子纳米螯合剂能稳定存在于血液中，提高在血液中循环停留的时间，提高对肿瘤细胞内钙离子螯合的效果；外壳结构可以避免内核表面的Cac-PEG提早暴露，降低对正常组织的毒性；
本发明的钙离子纳米螯合剂制备过程简单温和，原料易得，所制钙离子纳米螯合剂可应用于抗肿瘤药物领域，易大规模生产，具有工业和实际应用的潜力。
下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明实施例1中应用原理图；
图2为本发明实施例1中所得化合物2的1H NMR图；
图3为本发明实施例1中所得化合物3的1H NMR图；
图4为本发明实施例1中所得化合物4的1H NMR图；
图5为本发明实施例1中所得化合物5的1H NMR图；
图6为本发明实施例1中所得化合物6的1H NMR图；
图7为本发明实施例1中所得化合物7的1H NMR图；
图8为本发明实施例1中所得化合物8的1H NMR图；
图9为本发明实施例1中化合物1逐步反应合成化合物8的合成路线图；
图10为本发明对比例中钙离子螯合剂聚合物的细胞毒性检测结果图；
图11为本发明对比例中钙离子螯合的特异性检测结果图；
图12为本发明对比例中透射电子显微镜照片；
图13为本发明对比例中钙离子纳米螯合剂的粒径检测结果图；
图14为本发明对比例中表面电势检测结果图；
图15为本发明对比例中基质金属蛋白酶响应性检测结果图；
图16为本发明对比例中Au-Cac、Au-S-Gel及Au-S-Gel与基质金属蛋白酶(MMP)联合处理后细胞存活率细胞毒性检测结果图。
具体实施方式
实施例1一种钙离子纳米螯合剂的制备方法
本实施例的原理图如图1，该制备方法包括依次进行的以下步骤：
S0：羧基官能团化的钙离子螯合剂的制备
将9kg的5-甲基-2-硝基苯酚(化合物1，59mol)和4.9kg的K2CO3(35mol)分散在24L无水N,N-二甲基甲酰胺中，于90℃下搅拌20min；加入66kg的1,2-二溴乙烷(351mol)，至上述混合物的亮橙色很快褪为淡黄色，并出现白色沉淀，于90℃下继续反应18h；冷却至室温后，过滤得沉淀和滤液，用水和二氯甲烷依次冲洗沉淀，将滤液及沉淀洗涤液用浓度为0.1M的稀NaOH溶液反复洗涤直至水相中不再出现橙色，然后用含有少量NaH2PO 4的饱和NaCl洗涤有机相一次；真空旋蒸去除有机溶剂后，采用体积比1:4的乙酸乙酯和石油醚，选择二氧化硅进行柱色谱法纯化产物，经计算，得到产率为37％的5.7kg化合物2，化合物2的1H NMR图如图2所示，表征数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,1H),6.88(tdd,2H),4.40(t,2H),3.68(t,2H),2.42(s,3H).
取2.6kg化合物2(10mol)、1.4kg的2-硝基苯酚(10mol)和0.83kg的K2CO3(6mol)悬浮于10L无水N,N-二甲基甲酰胺，在90℃下搅拌5h反应；冷却至室温后，缓慢加入100L蒸馏水，过滤得固体用水和乙醚依次洗涤后真空干燥，得2.8kg白色固体化合物3，经计算，化合物3产率为88％，化合物3的1H NMR图如图3所示，表征数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(dd,1H),7.78(d,1H),7.57(ddd,1H),7.25(dd,1H),7.08(ddd,1H),7.03(t,1H),6.87(dt,1H),4.53(p,4H),2.44(s,3H).
还原反应：取2kg化合物3(6.3mol)和0.4kg的10wt％的钯碳催化剂Pd/C，分散在200L体积比为4:1的乙酸乙酯/甲醇混合液中，在氢气气氛下，室温搅拌，还原反应2天，在充分吸氢后，抽滤除去催化剂，除去有机溶剂后，残余物用甲醇洗涤并真空干燥，得到1.6kg化合物4；经计算，产量为97％，化合物4的1H NMR图如图4所示，表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ6.86(dd,1H),6.73–6.62(m,3H),6.57–6.48(m,3H),4.68(s,2H),4.47(s,2H),4.26(s,4H),2.16(s,3H).
酯化反应：将1.3kg化合物4(5mol)、4.2kg溴乙酸乙酯(25mol)和5.4kg质子海绵(ProtonSponge，25mol)溶于50L无水乙腈中并加入4kg的NaI(27mol)；将所得混合物在回流下搅拌20小时；冷却至室温后，将混合物用300L二氯甲烷稀释，依次用饱和NaH2PO4、NaHCO3和NaCl水溶液洗涤，有机相用MgSO4干燥，除去所有挥发物后，将残余物悬浮在20L甲醇中并冷却至-20℃重结晶，得到2.1kg浅黄色微晶固体化合物5，经计算，产量为70％，化合物5的1H NMR图如图5所示，表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ6.98–6.90(m,1H),6.89–6.81(m,2H),6.76(d,1H),6.73–6.68(m,1H),6.67–6.57(m,2H),4.17(s,4H),4.07(d,8H),4.00–3.88(m,8H),2.21(s,3H),1.05(td,12H).
氧化反应：将2kg化合物5(3.3mol)和0.4L吡啶溶于20L无水N,N-二甲基甲酰胺中并在氮气氛下冰浴冷却，逐滴加入3L三氯氧磷，将混合物逐渐加热至60℃并在该温度下继续搅拌1h，搅拌过程中，采用薄层色谱法跟踪反应进程；将反应溶液用40L二氯甲烷稀释并加入与碎冰混合的0.1M的NaOH溶液，萃取后，有机相加入200L二氯甲烷稀释并用饱和NaHCO3和NaCl溶液依次洗涤，除去有机相后，将残余物用甲醇溶解并冷却至-20℃重结晶，12h后过滤得固体，用甲醇洗涤并真空干燥，得1.3kg黄色结晶固体化合物6，经计算，产量为60％，化合物6的1H NMR图如图6所示，表征数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.80(s,1H),7.38(d,2H),6.78–6.72(m,2H),6.70–6.64(m,2H),4.35–4.29(m,2H),4.29–4.25(m,2H),4.17(d,8H),4.06(dq,8H),2.26(s,3H),1.15(td,12H).
将397.7kg化合物6和100L的2-甲基-2-丁烯溶于5L的1,4-二恶烷中，依次加入1L的浓度为180g/L的NaH2PO4和1L浓度为110g/L的NaClO2溶液，将所得溶液在室温下搅拌反应30分钟，再依次加入1L的NaH2PO4和1L的NaClO2饱和溶液，在室温下继续搅拌反应30分钟；加入50L水淬灭反应后，用50L乙酸乙酯进行3次萃取，合并有机相，用MgSO4干燥，在真空中，除去所有挥发物后得到390g无色油状化合物7，即为羧基官能团化的钙离子螯合剂，经计算，产量为95％，羧基官能团化的钙离子螯合剂的1H NMR图如图7所示，表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.44(s,1H),7.46(dd,1H),7.41(d,1H),6.76(d,1H),6.68–6.57(m,3H),4.24–4.11(m,8H),4.04(d,4H),3.99–3.92(m,8H),2.22(s,3H),1.05(td,12H).
S1：钙离子螯合剂聚合物的制备
以PEG分子量2000的钙离子螯合剂聚合物为例：将32kg化合物7(50mol)和9.7kg的N,N-二异丙基乙胺(75mol)溶于6L无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入26kg六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOp，50mol)；在室温下，搅拌反应10min后，加入PEG的分子量为2000Da的150kg巯基-PEG-氨基聚合物(NH2-PEG2000-SH，75mol)并搅拌30h，所得粗产物依次在N,N-二甲基甲酰胺、水中依次透析后冻干，得到52.8kg化合物8，即为钙离子螯合剂聚合物(Cac-PEG，1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸基聚乙二醇)，经计算，产量为40％，该钙离子螯合剂聚合物的1H NMR图如图8所示，表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.49(s,4H),8.33(s,1H),7.50–7.36(m,2H),6.99(s,1H),6.83–6.63(m,3H),4.31(d,4H),4.06(d,8H),3.47(d,271H),3.24(s,4H),2.36–2.14(m,3H).
上述步骤S1和S2是由化合物1逐步反应合成化合物8的过程，具体合成路线如图所示。
S2：内核的制备
在135℃油浴条件下，向125L剧烈搅拌的暴沸水中加入40mL的0.25g/mL的四氯金酸(HAuCl4)原液，稀释成浓度为0.2M的HAuCl4水溶液体系，迅速加入12.5L浓度为40mM的柠檬酸钠，使溶液迅速变成红棕色，得含金纳米颗粒的水溶液；经检测，该含金纳米颗粒的水溶液中金纳米颗粒的浓度为10mg/mL；经紫外分光光度计检测，含金纳米颗粒的水溶液在520-550nm处出现最大吸收峰，即浓度为500nM粒径为20～80nm的金颗粒；
取上述含金纳米颗粒的水溶液，加入10g钙离子螯合剂聚合物(Cac-PEG)和10g巯基-PEG-丙稀酰胺(SH-PEG2000-Alkene)(钙离子螯合剂聚合物和巯基-PEG-丙烯酰胺的质量比为1:1)，反应16h，即得内核，标记为Au-Cac；
该内核为包含巯基结构且经1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸基聚乙二醇修饰的金颗粒，粒径为20～80nm。
S3：外壳的制备
将226mg上述内核稀释于5L，pH为7.4，浓度为0.01M的脱氧磷酸盐缓冲液中，然后加入15mL过硫酸铵(8.8μM)和4mL的N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(3.1mM)，将上述所得溶液逐滴添加到由摩尔比为1:1:1的丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱、氨基酸序列为VPLGVRTK的双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽和0.5L超纯水组成的混合液中，在氮气氛下，原位自由基聚合反应2h，通过透析过夜对产物进行纯化；
其中，双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽，是两端丙烯酰胺化的短肽；透析袋的分子量截止值为100kDa；过硫酸铵为引发剂；N,N,N′,N′-四甲基乙二胺为催化剂，收集纯化后产物，即为钙离子纳米螯合剂，标记为M1。
经检测，外壳的粒径为5～50nm。
实施例2～7钙离子纳米螯合剂的制备方法
实施例2～7分别为一种钙离子纳米螯合剂的制备方法，它们的制备方法中的工艺步骤与实施例1相似，与实施例1的不同之处仅在于：
实施例2中，丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和氨基酸序列为GGVPMSMRGGK的双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽的摩尔比为5：5：1；钙离子螯合剂聚合物和巯基-PEG-丙烯酰胺的质量比为0.25:1；其中，巯基-PEG-氨基聚合物中PEG的分子量为7500Da；含金纳米颗粒的水溶液中金纳米颗粒的浓度为10mg/mL；步骤S2中，反应的时间为18h；所得钙离子纳米螯合剂，标记为M2。
实施例3中，丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和氨基酸序列为GPLGIAG的双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽的摩尔比为10：10：1；钙离子螯合剂聚合物和巯基-PEG-丙烯酰胺的质量比为1:1；其中，巯基-PEG-氨基聚合物中PEG的分子量为900Da；含金纳米颗粒的水溶液中金纳米颗粒的浓度为9mg/mL；步骤S2中，反应的时间为15h；所得钙离子纳米螯合剂，标记为M3。
实施例4中，丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和氨基酸序列为GPLGIAGQ的双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽的摩尔比为8：6：1；钙离子螯合剂聚合物和巯基-PEG-丙烯酰胺的质量比为0.7:1；其中，巯基-PEG-氨基聚合物中PEG的分子量为3000Da；含金纳米颗粒的水溶液中金纳米颗粒的浓度为15mg/mL；步骤S2中，反应的时间为18h；所得钙离子纳米螯合剂，标记为M4。
实施例5中，丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和氨基酸序列为GPLGVRGDG的双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽的摩尔比为5：10：1；钙离子螯合剂聚合物和巯基-PEG-丙烯酰胺的质量比为4:1；其中，巯基-PEG-氨基聚合物中PEG的分子量为300Da；含金纳米颗粒的水溶液中金纳米颗粒的浓度为5mg/mL；步骤S2中，反应的时间为20h；所得钙离子纳米螯合剂，标记为M5。
实施例6中，丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和氨基酸序列为PLGLAG的双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽的摩尔比为8：6：1；钙离子螯合剂聚合物和巯基-PEG-丙烯酰胺的质量比为0.7:1；其中，巯基-PEG-氨基聚合物中PEG的分子量为7000Da；含金纳米颗粒的水溶液中金纳米颗粒的浓度为18mg/mL；步骤S2中，反应的时间为19h；所得钙离子纳米螯合剂，标记为M6。
实施例7中，丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和氨基酸序列为PVGLIG的双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽的摩尔比为5：10：1；钙离子螯合剂聚合物和巯基-PEG-丙烯酰胺的质量比为4:1；其中，巯基-PEG-氨基聚合物中PEG的分子量为10000Da；含金纳米颗粒的水溶液中金纳米颗粒的浓度为20mg/mL；步骤S2中，反应的时间为12h；所得钙离子纳米螯合剂，标记为M7。
实施例2～7的制备方法中其它部分内容与实施例1相同，或为本领域技术人员根据实施情况的常规调整。
对比例钙离子螯合剂的结构和性能检测
(一)细胞毒性检测
检测实施例1制得的钙离子螯合剂聚合物(Cac-PEG)、商用的小分子钙离子螯合剂BAPTA接触细胞后存活率以检测不同浓度Cac-PEG和BAPTA的细胞毒性。
将4T1细胞在37℃，5％的CO2条件下培养24小时，然后按每孔1.0×104细胞密度接种于96孔培养板，分为各占30孔的A、B两组，以100μL/孔的量添加含有10％的胎牛血清的培养液，在CO2体积分数5％、温度为37℃的细胞培养箱中继续培养至细胞密度达到70％；更换新培养液，取Cac-PEG加入至A组培养液，梯度稀释至Cac-PEG浓度依次为0μM、3μM、6μM、9μM、12μM、15μM、18μM、21μM、24μM和30μM，相邻的3孔浓度相同；另取小分子钙离子螯合剂BAPTA加入至B组培养液，稀释至BAPTA浓度依次为0μM、3μM、6μM、9μM、12μM、15μM、21μM、18μM、24μM和30μM，相邻的3孔浓度相同；继续培养48小时后，采用MTT方法，测定细胞存活率，其计算公式为[细胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100％，结果如图10所示；
结果表明，根据细胞存活率均值，相较于小分子钙离子螯合剂BAPTA，Cac-PEG对细胞的毒性更小，且呈明显的剂量依赖性。
(二)钙离子螯合的特异性检测
Cac-PEG与钙离子螯合后，在360nm处紫外吸收会降低而230nm处的紫外吸收增高，因此可通过紫外分光光度计，检测实施例1制得的钙离子螯合剂聚合物(Cac-PEG)的钙离子螯合特异性；
具体操作为：检测对钙离子的螯合吸附能力时，在Cac-PEG(1mM)的MOPS缓冲液液(pH 7.2)依次添加0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM、2.0mM和2.5mM的氯化钙溶液，并分别进行紫外检测，并对360nm处的紫外吸收值进行统计；检测对镁离子的螯合吸附能力时，在PEG-Cac(1mM)的MOPS缓冲液(pH7.2)依次添加0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM、2.0mM和2.5mM的氯化镁溶液，并分别进行紫外检测，并对360nm处的紫外吸收值进行统计，最终结果如图11所示；
结果表明，相较于Mg2+，PEG-Cac对Ca2+具有特异性吸附能力，对Ca2+的选择性比Mg2+高100倍以上。
(三)透射电子显微镜照片
制备Au-N-Gel：按照与实施例1相似的方法制备Au-N-Gel，不同之处仅在于S4中，用等量N,N'-甲烯基双丙烯酰胺代替双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽作为交联剂，制备方法其它部分与实施例1相同；
对实施例1制得的Au-Cac、钙离子纳米螯合剂M1(标记为Au-S-Gel)和Au-N-Gel三种样品拍摄透射电子显微镜照片，以观察结构，具体方法为：分别吸取10μL样品置于透射电镜制样铜网上，室温下于超净工作台中晾干，使用常温透射电子显微镜在100kV条件下观测样品形貌；
结果如图12所示，Au-S-Gel与Au-N-Gel相比于Au-Cac，衬度高的金内核表面有一层衬度较低的有机物包覆层，因此结果显示成功制备得到了以金纳米颗粒为内核，表面包覆有机凝胶层的金纳米凝胶颗粒。
(四)钙离子纳米螯合剂的粒径
使用MalvernZetasizer动态光散射粒度仪测定Au-S-Gel、Au-N-Gel和Au-Cac颗粒三种样品的平均粒径和分布情况，分别取0.5mL样品加入样品检测池，设置检测材料为金颗粒，设置检测温度为25℃，平衡时间为120s，检测介质为水，观测图13所示的粒径及图14所示的表面电势；
结果如图13～14所示，Au-Cac颗粒内核粒径为20nm，其表面电负性较强，Au-S-Gel、Au-N-Gel的平均粒径为25nm，粒径略微增大，同时电负性降低，进一步验证了Au-S-Gel的成功制备。
(五)基质金属蛋白酶响应性检测
取1mg/mL的Au-S-Gel与Au-N-Gel分别加入2μg/mL的胶原酶IV，模拟体内基质金属蛋白酶的高表达，37℃下孵育2小时，12000rpm离心弃上清，用超纯水洗3次；使用透射电子显微镜对其形貌进行观测，将制备的样品吸取10μL置于透射电镜制样铜网上，在室温下静置于超净工作台中晾干，使用常温透射电子显微镜在100kV条件下观测样品形貌，如图15所示，Au-S-Gel与胶原酶IV孵育后，金内核表面的有机物包覆层被降解消失，而Au-N-Gel表面凝胶层无变化；因此，结果显示实施例1制得的Au-S-Gel具有基质金属蛋白酶响应性。
(六)钙离子螯合能力检测
钙离子荧光探针可竞争性螯合溶液中的钙离子而发出荧光，应用荧光分光光度计检测游离钙离子的浓度，从而进一步评估钙离子螯合性能，具体方法为首先制备待测样品，分为Au-Cac,Au-S-Gel,Au-N-Gel,Au-S-Gel+胶原酶IV及Au-N-Gel+胶原酶IV五个组，其中后两组为Au-S-Gel及Au-N-Gel组与胶原酶IV(2μg/mL)在37℃孵育2h，向等浓度1mL各样品中加入5μL钙离子探针Fura-2(3μM)，并在37℃下在比色皿中孵育10min；
检测510nm的发射波长下的激发光谱，再向其中逐步添加钙离子溶液，最终检测340nm与380nm处荧光强度比率的变化；结果如图15，Au-S-Gel+胶原酶IV组与Au-Cac具有相似的钙离子螯合能力，且显著高于Au-S-Gel、Au-N-Gel及Au-N-Gel+胶原酶IV组。
(七)细胞毒性检测
检测(三)中的Au-Cac、Au-S-Gel及Au-S-Gel与基质金属蛋白酶(MMP)联合处理后细胞存活率以检测细胞毒性。
将4T1细胞在含有10％的胎牛血清的培养液中，在37℃，5％CO2条件下培养24小时，然后按每孔1.0×104细胞密度接种于96孔培养板，在5％CO2、温度为37℃的细胞培养箱中继续培养到细胞密度达到70％左右；更换含有10％胎牛血清的新鲜培养液(100μL/孔)，分别取Au-Cac、Au-S-Gel及MMP(金颗粒浓度1-500μg/mL，MMP浓度为2μg/mL)加入到细胞培养孔中，继续培养48小时后，采用MTT方法，测定细胞存活率，其计算公式为[细胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100％；
如图16所示，Au-Cac对肿瘤细胞的细胞毒性均具有明显的剂量依赖性；Au-S-Gel在没有MMP降解作用下，显示出良好的生物相容性；加入MMP处理后，Au-S-Gel显示出明显的剂量依赖的细胞毒性。
对实施例2～7制得的钙离子纳米螯合剂M2～M7代替钙离子纳米螯合剂M1进行上述实验均得到相似结果。
上述结果表明，本发明的钙离子纳米螯合剂具有核壳结构，由单体、交联剂及引发剂原位自由基聚合于内核表面形成凝胶外壳，该钙离子纳米螯合剂具有良好的稳定性、生物相容性、低毒性及肿瘤靶向的高螯合能力。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明权利要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种钙离子纳米螯合剂，其特征在于，该钙离子纳米螯合剂为核壳结构，其中：
内核为包含巯基结构且经1,2-双（2-氨基苯氧基）乙烷- N, N, N′,N′-四乙酸基聚乙二醇修饰的金颗粒；
外壳为由丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽及引发剂原位自由基聚合形成的凝胶。
2.根据权利要求1所述的钙离子纳米螯合剂，其特征在于，所述双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽，是两端丙烯酰胺化的短肽。
3.根据权利要求1或2所述的钙离子纳米螯合剂，其特征在于，所述引发剂为过硫酸铵；
所述双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽，其氨基酸序列为VPLGVRTK、GGVPMSMRGGK、GPLGIAG、GPLGIAGQ、GPLGVRGDG、PLGLAG或PVGLIG。
4.根据权利要求1或2所述的钙离子纳米螯合剂，其特征在于，所述内核的粒径为20~80nm；所述的外壳的粒径为5~50 nm。
5.根据权利要求1或2所述的钙离子纳米螯合剂，其特征在于，所述丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱和双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽的摩尔比为5~10：5~10：1。
6.权利要求1~5中任一项所述的钙离子纳米螯合剂的一种制备方法，其特征在于，该制备方法包括依次进行的以下步骤：
S1. 钙离子螯合剂聚合物的制备
将羧基官能团化的钙离子螯合剂与巯基-PEG-氨基聚合物进行混合反应，纯化反应产物，得钙离子螯合剂聚合物；
S2. 内核的制备
在含金纳米颗粒的水溶液中加入钙离子螯合剂聚合物和巯基-PEG-丙烯酰胺，反应得内核；
S3. 外壳的制备
取丙烯酰胺、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、双丙烯酸化基质金属蛋白酶响应性的多肽及引发剂在内核表面原位自由基聚合形成凝胶。
7.根据权利要求6所述的钙离子纳米螯合剂的制备方法，其特征在于，所述羧基官能团化的钙离子螯合剂，是将5-甲基-2-硝基苯酚和1,2-二溴乙烷反应后，取产物与2-硝基苯酚反应，再依次经还原反应、酯化反应和氧化反应制得。
8.根据权利要求6或7所述的钙离子纳米螯合剂的制备方法，其特征在于，所述纯化为透析；所述含金纳米颗粒的水溶液由水热法制得；所述巯基-PEG-氨基聚合物中PEG的分子量为300~10000 Da。
9.根据权利要求6或7所述的钙离子纳米螯合剂的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述含金纳米颗粒的水溶液中金纳米颗粒的浓度为5~20 mg/mL；
所述钙离子螯合剂聚合物和巯基-PEG-丙烯酰胺的质量比为0.25~4:1；
所述反应的时间为12~20h。
10.权利要求1~5中任一项所述的钙离子纳米螯合剂的一种应用，其特征在于，所述钙离子纳米螯合剂用于制备抗肿瘤药物。
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