CN114507655A - 一种从野生条斑钳蝎中分离纯化透明质酸酶的方法及应用 - Google Patents

一种从野生条斑钳蝎中分离纯化透明质酸酶的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从野生条斑钳蝎中分离纯化透明质酸酶的方法及应用，该方法由条斑钳蝎毒素为研究对象，通过电刺激法收集蝎素；利用冷冻干燥机进行干燥至白色粉末，在‑20℃冰箱储存备用；以透明质酸酶活力为导向，分别利用阳离子交换凝胶色谱，分子筛纯化；再利用制备性凝胶高效液相制备得到高纯度、高活力的透明质酸酶的方法。通过检测和评价结果表明：从条斑钳蝎中得到的透明质酸酶分子量为55KD，产率为1.5%，经高效液相检测其纯度达到90%以上，效价达到2300U/mg，通过红外检测，在1610cm‑1及1480cm‑1附近具有明显特征峰，为酰胺键标志。且得到的透明质酸酶具有较好的抗氧化活性。该方法操作简便，重复性强，得率高；为毒素来源的透明质酸酶新资源的开发利用提供技术支撑和科学依据。

Description

一种从野生条斑钳蝎中分离纯化透明质酸酶的方法及应用
技术领域
本发明涉及蝎毒素活性酶技术领域，具体涉及一种条斑钳蝎毒素中透明质酸酶的分离纯 化方法及应用。
背景技术
全蝎是平肝熄风的常用药材之一，多被用于中医临床治疗痉挛抽搐、疮疡中毒、瘰疬结 核、风湿顽痹和顽固性偏正头痛等疾病，同时具有抗凝血、抗肿瘤、抗癫痫和抗菌等药理作 用。全蝎的毒性成分主要来自尾部的蝎毒液，蝎毒液化学成分为蛋白质和多肽类等，其中约 有10万种不同的神经毒素，已报道的仅有500余种，其蕴藏着大量结构新颖、活性独特的多 肽，它是多肽新药开发的资源库，具有很大的探索空间。
透明质酸酶是广泛分布于自然界中的一类糖苷酶，通过作用于β-1，3或β-1，4糖苷键来降解透明质酸。此外，还可在一定程度上催化作用于软骨素和硫酸软骨素。透明质酸酶首次发现于1929年，Duran-Reynals在哺乳动物睾丸及其他组织提取物中发现一种可促进疫 苗、染料、毒素等扩散的扩散因子，随后被鉴定为透明质酸酶。透明质酸酶(Hyaluronidase， HAase)是能使透明质酸(HA)产生低分子化作用的一类酶的总称，能够提高组织中液体的渗 透能力，在控制癌细胞侵袭、抑制血管再生、促进创伤修复等过程中也能发挥重要作用。透 明质酸酶在自然界分布广泛，哺乳动物，无脊椎动物(甲壳类、昆虫类、蛭类)，致病菌(念珠 菌属、链霉菌属)，细菌和噬菌体中都有所报道。尤其是来自于动物毒液蝮蛇、蜥蜴、蝎子、 胡蜂、黄蜂、石鱼等毒液)机体组织透明质酸酶(生殖器官、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、皮肤 等)的透明质酸酶已经证实大量存在。当作为一种辅助剂使用时，可提高注射药物的扩散能力 和生物利用率。因此，该酶已被用作局部佐剂，以增加局部麻醉剂的扩散能力。增加镇痛效 果，减轻术中和术后产生的疼痛；而随着医美产业的发展，透明质酸酶也被用于处理因注射 透明质酸不当而产生的透明质酸填充物相关的并发症。由于透明质酸酶分离纯化困难，长期 被忽略，目前，国内自产的标准品的主要来源是依靠牛羊睾丸、蝎蛇毒素和透明质酸链霉菌 等，不同原料来源的透明质酸酶纯化难易度、活力和纯度都也有所差别，因此透明质酸酶标 准品的价格也是参差不齐，持续高涨不下。纯度相较于进口标准品还需要很大的改进，这使 得生化物质类标准品变成了一项“卡脖子”工程，因此加紧自主研发出高纯度、高活力、低 成本的生活标准品无论从科学性还是经济效益性方面都变得非常重要。
根据现有文献报道，蝎毒液中主要含有一些例如透明质酸酶，磷脂酶A2等酶类蛋白及毒 性蛋白和多肽类成分，现代研究表明，蝎毒成分非常复杂且具有广泛的药理活性，在治疗疾 病方面有自己独特的优势。Wang C G等从蝎毒中纯化出一种新型的短链蝎毒素，它由31个 氨基酸残基，包括6个半胱氨酸残基组成；Ahmidin等从东亚钳蝎的酶解液中分离出抗氧化 肽，并用MALDI-TOF-MS/MS测定出了氨基酸序列。
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C.Pessini等运用两次离子交换 树脂从蝎毒中分离出了透明质酸酶并检测了一些小分子物质对其的抑制能力。而对干燥虫体 的主要集中在三胺类，甜菜碱，甾体类衍生物等小分子的研究。徐林等在东亚钳蝎蝎毒中提 取分离出的蝎毒多肽提取物(PESV)具有抑瘤活性，能够防止小鼠Lewis肺癌转移与发展， 并且可以有效的缩小肿瘤的体积，减少肺表面转移灶的数目。宋益民等通过观察兔血流变受 蝎毒活性肽影响的实验，发现蝎毒中的活性肽(SVAPs)能够促进内皮细胞释放前列环素 (Epoprostenol，PGI2)、NO、组织纤溶酶原激活物(tissue typeplasminogen activator， t-PA)，具有抗血小板聚集的作用，推断SVAPs抗栓溶栓发生可能是由于血液黏度的降低从 而改变了血液流变性。
由于来源不同的酶在各方面都具有一定的差异，毒素来源的透明质酸酶目前市面上甚至 较为紧缺，该技术从原料层面利用物理手段高效完整的收集毒素，且能够反复进行毒素收取， 对蝎子几乎无伤害，可以保证条斑钳蝎资源的可持续利用；从分离手段层面，该技术整体步 骤简单，重复性强获得的成品纯度和活力都较强，为毒素来源的透明质酸酶新资源的开发利 用提供技术支撑和科学依据；为医药使用透明质酸酶提供廉价原料药。
发明内容
本发明目的在于，提供一种从野生条斑钳蝎中分离纯化透明质酸酶的方法及应用，该方 法由条斑钳蝎毒素为研究对象，通过电刺激法收集蝎素；利用冷冻干燥机进行干燥至白色粉 末，在-20℃冰箱储存备用；以透明质酸酶活力为导向，分别利用阳离子交换凝胶色谱，分子 筛纯化；再利用制备性凝胶高效液相制备得到高纯度、高活力的透明质酸酶的方法。通过检 测和评价结果表明：从条斑钳蝎中得到的透明质酸酶分子量约为55KD,产率为1.5％，经高效 液相检测其纯度达到90％以上，效价达到2300U/mg，通过红外检测，在1610cm-1及1480cm-1附近具有明显特征峰，为酰胺键标志。且得到的透明质酸酶具有较好的抗氧化活性。该方法 操作简便，重复性强，得率高；为毒素来源的透明质酸酶新资源的开发利用提供技术支撑和 科学依据。
本发明所述的一种从野生条斑钳蝎中分离纯化透明质酸酶的方法，按下列步骤进行：
a、用高频弱电流刺激法刺激蝎子尾节，采用小型按摩仪采毒，将连续感应电刺激档调频 到128赫兹，电压为3-7伏，用两个镊子分别与两个电极相连接，一个镊子夹住蝎子的一个 触肢，另一个镊子夹在蝎子尾节毒囊腺体处，使整个系统产生带电通路，对蝎子产生电刺激， 以排出毒液，若无反应，在电极与镊子接触的部位滴上几滴生理盐水，使蝎子毒囊腺体肌肉 收缩，促其排毒，得到粗毒液；
b、将步骤a得到的粗毒液，放入含冰水50mL的离心管收集尾刺所排出的粗毒液；
c、将步骤b中提取的粗毒液，用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压力为10Pa，时 间为24h，得到总的粗毒素干粉；
d、将步骤c中的粗毒素干粉，溶于20mM，pH 4.5-7醋酸铵、磷酸或三羟甲基氨基甲烷 盐酸盐缓冲溶液，震荡10min，在温度4℃静止1h，之后离心，离心温度为4℃，离心时间为10min，离心转速为8000rpm/min取上清液；
e、将步骤d中的上清液，用20mM醋酸铵、磷酸或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液平衡 的阳离子交换柱，上样量为80mg，流速为0.4-2mL/min，用洗脱液为含0％-70％的氯化钠的20mM 醋酸铵缓冲液溶液进行梯度洗脱,按离子强度分为四个蛋白组分，分别为一个酸性蛋白部位和 三个碱性蛋白部位；
f.将步骤e中的四个蛋白部位，在温度4℃环境下用冷蒸水透析，每4h换一次透析溶液， 共替换8次，得到四个蛋白部位的脱盐溶液；
g、将步骤f中的四个蛋白组分分别用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压力为15Pa， 时间为24h，得到四个蛋白部位干燥粉末；
h、将步骤g中的干燥粉末通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对判断透明质酸酶所在部位 为50％氯化钠洗脱组分；
i、将步骤h中的50％氯化钠洗脱组分溶于5ml超纯水中，用超纯水平衡分子筛凝胶柱， 上样量为20-100mg,流速为0.4ml/min，以超纯水进行洗脱，得到分子量分别为55KD，40KD 和20KD的三种蛋白类物质水溶液；
j、将步骤i中的三种蛋白类物质水溶液分别用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到三种蛋白类物质粉末；
k、将步骤j中的三种粉末样品通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对最终确认分子量为 55KD的蛋白样品为高纯度透明质酸酶。
所述方法获得的条斑钳蝎毒素中的透明质酸酶在制备抗氧化中的药物的用途。
本发明所述的一种从野生条斑钳蝎中分离纯化透明质酸酶的方法及应用，该方法首先按 照频率为128赫兹，电压为4-6伏电刺激取毒液，采用低温真空冷冻干燥技术获得粗毒素干 粉；将粗毒素在pH 4.5-7,20mM铵缓冲液中溶解，离心取上清液；对溶于铵缓冲液的毒素 流速0.4-2ml/min的条件下进行CM-650M离子交换色谱层析，在上样量为20mg-100mg的条件 下进行sephadex G-75色谱层析，过滤分子量为3500Da规格的透析袋透析除杂，得到高纯度 透明质酸酶,得率为1.5％。将高纯度透明质酸酶进行HPLC纯度分析、化学性质检测、氨基酸、 单糖组成分析、酶活力分析、红外特征官能团检测和抗氧化能力筛选。对其进行酶活力评价， 活力测试结果表明，从条斑钳蝎毒素中纯化得到的高纯度透明质酸酶酶活力达到2300U/mg。 氨基酸组成分析表明，该部位主要含有的氨基酸为色氨酸，赖氨酸和丝氨酸，主要含有的多 糖为甘露糖和氨基葡萄糖。
附图说明
图1为本发明使用CM-650M阳离子交换色谱纯化条斑钳蝎毒素的色谱图；
图2为本发明使用sephadex G-75凝胶色谱层析纯化条斑钳蝎毒素透明质酸酶部位的色 谱图；
图3为本发明的高纯度透明质酸酶的15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图4为本发明的透明质酸酶与所购标准品HPLC图谱比较；
图5本发明的透明质酸酶的红外检测图谱；
图6本发明的透明质酸酶的氨基酸分析图谱；
图7本发明的透明质酸酶与阳性对照对比抗氧化活性指标IC50柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但这些举例性实施方式的用途和 目的仅用来列举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本 发明的保护范围局限于此。
实施例1
a、用高频弱电流刺激法刺激蝎子尾节，采用小型按摩仪采毒，将连续感应电刺激档调频 到128赫兹，电压为3伏，用两个镊子分别与两个电极相连接，一个镊子夹住蝎子的一个触 肢，另一个镊子夹在蝎子尾节毒囊腺体处，使整个系统产生带电通路，对蝎子产生电刺激， 以排出毒液；若无反应，在电极与镊子接触的部位滴上几滴生理盐水，使蝎子毒囊腺体肌肉 收缩，促其排毒，得到粗毒液；
b、将步骤a得到的粗毒液，再放入含冰水50mL的离心管收集尾刺所排出的粗毒液；
c、将步骤b中提取的粗毒液，用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压力为10Pa，时 间为24h，得到总的粗毒素干粉；
d、将步骤c中的粗毒素干粉，溶于20mM，pH 4.5醋酸铵缓冲溶液，震荡10min，在 温度4℃静止1h，之后离心，离心温度为4℃，离心时间为10min，离心转速为8000rpm/min 取上清液；
e、将步骤d中的上清液，用20mM，pH 4.5醋酸铵缓冲溶液平衡的CM-650M柱，上样量为80mg，流速为0.8mL/min，用洗脱液为含0％-50％氯化钠的20mM pH 4.5醋酸铵缓冲溶液进 行梯度洗脱，按离子强度分为四个蛋白组分，分别为一个酸性或中性蛋白部位和三个碱性蛋 白部位；
f、将步骤e中的四个蛋白部位，在温度4℃环境下用冷蒸水透析，每4h换一次透析溶液， 共替换8次，得到四个蛋白组分的脱盐溶液；
g、将步骤f中的四个蛋白组分分别用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压力为10Pa， 时间为24h，得到四个蛋白部位干燥粉末；
h、将步骤g中的干燥粉末通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对，判断透明质酸酶所在部 位为50％氯化钠洗脱组分；
i、将步骤h中的50％氯化钠洗脱组分溶于5ml超纯水中，用超纯水平衡分子筛凝胶柱， 上样量为50mg,流速为0.4ml/min，以超纯水进行洗脱，得到分子量分别为55KD，40KD和20KD 的三种蛋白类物质水溶液；
j、将步骤i中的三种蛋白类物质的水溶液分别用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃， 压力为10Pa，时间为24h，得到三种蛋白类物质粉末；
k、将步骤j中的三种粉末样品通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对最终确认分子量为55KD的蛋白样品为高纯度透明质酸酶。
实施例2
a、用高频弱电流刺激法刺激蝎子尾节，采用小型按摩仪采毒，将连续感应电刺激档调频 到128赫兹，电压为4伏，用两个镊子分别与两个电极相连接，一个镊子夹住蝎子的一个触 肢，再用一个镊子夹在蝎子尾节毒囊腺体处，使整个系统产生带电通路，对蝎子产生电刺激， 以排出毒液；若无反应，在电极与镊子接触的部位滴上几滴生理盐水，使蝎子毒囊腺体肌肉 收缩，促其排毒，得到粗毒液；
b、将步骤a得到的粗毒液，再放入含冰水50mL的离心管收集尾刺所排出的粗毒液；
c、将步骤b中提取的粗毒液，用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压力为 10Pa，时间为24h，得到总的粗毒素干粉；
d、将步骤c中的粗毒素干粉，溶于20mM，pH 5.4醋酸铵缓冲溶液，震荡10min，在 温度4℃静止1h，之后离心，离心温度为4℃，离心时间为10min，离心转速为8000rpm/min 取上清液；
e、将步骤d中的上清液，用20mM，pH 5.4醋酸铵缓冲溶液平衡CM-650M阳离子交换层 析柱，上样量为80mg，流速为0.8mL/min，用洗脱液为含0％-50％氯化钠的20mM pH 5.4的醋 酸铵缓冲溶液进行梯度洗脱，按离子强度分为四个蛋白组分，分别为一个酸性或中性蛋白部 位和三个碱性蛋白部位；
f.将步骤e中的四个蛋白部位，在温度4℃环境下用冷蒸水透析，每4h换一次透析溶液， 共替换8次，得到四个蛋白组分的脱盐溶液；
g、将步骤f中的四个蛋白组分分别用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到四个蛋白部位干燥粉末；
h、将步骤g中的干燥粉末通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对判断透明质酸酶所在部位 为50％氯化钠洗脱组分；
i、将步骤h中的50％氯化钠洗脱组分溶于5ml超纯水中，用超纯水平衡分子筛凝胶柱， 上样量为20mg,流速为0.4ml/min，以超纯水进行洗脱，得到分子量分别为55KD，40KD和20KD 的三种蛋白类物质水溶液；
j、将步骤i中的三种蛋白类物质水溶液分别用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到三种蛋白类物质粉末；
k、将步骤j中的三种粉末样品通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对最终确认分子量为 55KD的蛋白样品为高纯度透明质酸酶。
实施例3
a、用高频弱电流刺激法刺激蝎子尾节，采用小型按摩仪采毒，将连续感应电刺激档调频 到128赫兹，电压为5伏，用两个镊子分别与两个电极相连接，一个镊子夹住蝎子的一个触 肢，再用一个镊子夹在蝎子尾节毒囊腺体处，使整个系统产生带电通路，对蝎子产生电刺激， 以排出毒液；若无反应，在电极与镊子接触的部位滴上几滴生理盐水，使蝎子毒囊腺体肌肉 收缩，促其排毒，得到粗毒液；
b、将步骤a得到的粗毒液，再放入含冰水50mL的离心管收集尾刺所排出的粗毒液；
c、将步骤b中提取的粗毒液，用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压力为 10Pa，时间为24h，得到总的粗毒素干粉；
d、将步骤c中的粗毒素干粉，溶于20mM，pH 6.8醋酸铵缓冲溶液，震荡10min，在 温度4℃静止1h，之后离心，离心温度为4℃，离心时间为10min，离心转速为8000rpm/min 取上清液；
e、将步骤d中的上清液，用20mM，pH 6.8醋酸铵缓冲溶液平衡CM-650M阳离子交换层析 柱，上样量为80mg，流速为0.8mL/min，用洗脱液为含0％-50％氯化钠的20mM pH 5.4的醋酸 铵缓冲溶液进行梯度洗脱，按离子强度分为四个蛋白组分，分别为一个酸性或中性蛋白部位 和三个碱性蛋白部位；
f.将步骤e中的四个蛋白部位，在温度4℃环境下用冷蒸水透析，每4h换一次透析溶液， 共替换8次，得到四个蛋白组分的脱盐溶液；
g、将步骤f中的四个蛋白组分分别用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到四个蛋白部位干燥粉末；
h、将步骤g中的干燥粉末通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对判断透明质酸酶所在部位 为50％氯化钠洗脱组分。
i、将步骤h中的50％氯化钠洗脱组分溶于5ml超纯水中，用超纯水平衡分子筛凝胶柱， 上样量为30mg,流速为0.4ml/min，以超纯水进行洗脱，得到分子量分别为55KD，40KD和20KD 的三种蛋白类物质水溶液；
j、将步骤i中的三种蛋白类物质水溶液分别用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到三种蛋白类物质粉末；
k、将步骤j中的三种粉末样品通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对最终确认分子量为 55KD的蛋白样品为高纯度透明质酸酶。
实施例4
a、用高频弱电流刺激法刺激蝎子尾节，采用小型按摩仪采毒，将连续感应电刺激档调频 到128赫兹，电压为7伏，用两个镊子分别与两个电极相连接，一个镊子夹住蝎子的一个触 肢，再用一个镊子夹在蝎子尾节毒囊腺体处，使整个系统产生带电通路，对蝎子产生电刺激， 以排出毒液；若无反应，在电极与镊子接触的部位滴上几滴生理盐水，使蝎子毒囊腺体肌肉 收缩，促其排毒，得到粗毒液；
b、将步骤a得到的粗毒液，再放入含冰水50mL的离心管收集尾刺所排出的粗毒液；
c、将步骤b中提取的粗毒液，用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压力为 10Pa，时间为24h，得到总的粗毒素干粉；
d、将步骤c中的粗毒素干粉，溶于20mM，pH 5.4醋酸铵缓冲溶液，震荡10min，在 温度4℃静止1h，之后离心，离心温度为4℃，离心时间为10min，离心转速为8000rpm/min 取上清液；
e、将步骤d中的上清液，用20mM，pH 5.4醋酸铵缓冲溶液平衡CM-650M阳离子交换层 析柱上样量为80mg，流速为1mL/min，用洗脱液为含0％-50％氯化钠的20mM pH 5.4的醋酸铵 缓冲溶液进行梯度洗脱，按离子强度分为四个蛋白组分，分别为一个酸性或中性蛋白部位和 三个碱性蛋白部位；
f.将步骤e中的四个蛋白部位，在温度4℃环境下用冷蒸水透析，每4h换一次透析溶液， 共替换8次，得到四个蛋白组分的脱盐溶液；
g、将步骤f中的四个蛋白组分分别用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到四个蛋白部位干燥粉末；
h、将步骤g中的干燥粉末通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对判断透明质酸酶所在部位 为50％氯化钠洗脱组分。
i、将步骤h中的50％氯化钠洗脱组分溶于5ml超纯水中，用超纯水平衡分子筛凝胶柱， 上样量为60mg,流速为0.4ml/min，以超纯水进行洗脱，得到分子量分别为55KD，40KD和20KD 的三种蛋白类物质水溶液；
j、将步骤i中的三种蛋白类物质水溶液分别用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到三种蛋白类物质粉末；
k、将步骤j中的三种粉末样品通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对最终确认分子量为 55KD的蛋白样品为高纯度透明质酸酶。
实施例5
a、用高频弱电流刺激法刺激蝎子尾节，采用小型按摩仪采毒，将连续感应电刺激档调频 到128赫兹，电压为6伏，用两个镊子分别与两个电极相连接，一个镊子夹住蝎子的一个触 肢，再用一个镊子夹在蝎子尾节毒囊腺体处，使整个系统产生带电通路，对蝎子产生电刺激， 以排出毒液；若无反应，在电极与镊子接触的部位滴上几滴生理盐水，使蝎子毒囊腺体肌肉 收缩，促其排毒，得到粗毒液；
b、将步骤a得到的粗毒液，再放入含冰水50mL的离心管收集尾刺所排出的粗毒液；
c、将步骤b中提取的粗毒液，用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压力为 10Pa，时间为24h，得到总的粗毒素干粉；
d、将步骤c中的粗毒素干粉，溶于20mM，pH 5.4磷酸缓冲溶液(PBS)，震荡10min，在温度4℃静止1h，之后离心，离心温度为4℃，离心时间为10min，离心转速为8000rpm/min取上清液；
e、将步骤d中的上清液，用20mM，pH 5.4磷酸缓冲溶液平衡CM-650M阳离子交换层析 柱，上样量为80mg，流速为1mL/min，用洗脱液为含0％-50％氯化钠的20mM pH 5.4的磷酸缓 冲溶液进行梯度洗脱，按离子强度分为四个蛋白组分，分别为一个酸性或中性蛋白部位和三 个碱性蛋白部位；
f.将步骤e中的四个蛋白部位，在温度4℃环境下用冷蒸水透析，每4h换一次透析溶液， 共替换8次，得到四个蛋白组分的脱盐溶液；
g、将步骤f中的四个蛋白组分分别用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到四个蛋白部位干燥粉末；
h、将步骤g中的干燥粉末通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对判断透明质酸酶所在部位 为50％氯化钠洗脱组分。
i、将步骤h中的50％氯化钠洗脱组分溶于5ml超纯水中，用超纯水平衡分子筛凝胶柱， 上样量为70mg,流速为0.4ml/min，以超纯水进行洗脱，得到分子量分别为55KD，40KD和20KD 的三种蛋白类物质水溶液；
j、将步骤i中的三种蛋白类物质水溶液分别用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到三种蛋白类物质粉末；
k、将步骤j中的三种粉末样品通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对最终确认分子量为 55KD的蛋白样品为高纯度透明质酸酶。
实施例6
a、用高频弱电流刺激法刺激蝎子尾节，采用小型按摩仪采毒，将连续感应电刺激档调频 到128赫兹，电压为3伏，用两个镊子分别与两个电极相连接，一个镊子夹住蝎子的一个触 肢，再用一个镊子夹在蝎子尾节毒囊腺体处，使整个系统产生带电通路，对蝎子产生电刺激， 以排出毒液；若无反应，在电极与镊子接触的部位滴上几滴生理盐水，使蝎子毒囊腺体肌肉 收缩，促其排毒，得到粗毒液；
b、将步骤a得到的粗毒液，再放入含冰水50mL的离心管收集尾刺所排出的粗毒液；
c、将步骤b中提取的粗毒液，用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压力为 10Pa，时间为24h，得到总的粗毒素干粉；
d、将步骤c中的粗毒素干粉，溶于20mM，pH 5.4三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl) 缓冲溶液，震荡10min，在温度4℃静止1h，之后离心，离心温度为4℃，离心时间为10min， 离心转速为8000rpm/min取上清液；
e、将步骤d中的上清液，用20mM，pH 5.4三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液平衡CM-650M 阳离子交换层析柱，上样量为80mg，流速为0.8mL/min，用洗脱液为0％-50％的氯化钠20mM pH 5.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲溶液进行梯度洗脱，按离子强度分为四个 蛋白组分，分别为一个酸性或中性蛋白部位和三个碱性蛋白部位；
f.将步骤e中的四个蛋白部位，在温度4℃环境下用冷蒸水透析，每4h换一次透析溶液， 共替换8次，得到四个蛋白组分的脱盐溶液；
g、将步骤f中的四个蛋白组分分别用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到四个蛋白部位干燥粉末；
h、将步骤g中的干燥粉末通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对判断透明质酸酶所在部位 为50％氯化钠洗脱组分。
i、将步骤h中的50％氯化钠洗脱组分溶于5ml超纯水中，用超纯水平衡分子筛凝胶柱， 上样量为80mg,流速为0.4ml/min，以超纯水进行洗脱，得到分子量分别为55KD，40KD和20KD 的三种蛋白类物质水溶液；
j、将步骤i中的三种蛋白类物质水溶液分别用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到三种蛋白类物质粉末；
k、将步骤j中的三种粉末样品通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对最终确认分子量为 55KD的蛋白样品为高纯度透明质酸酶。
实施例7
a、用高频弱电流刺激法刺激蝎子尾节，采用小型按摩仪采毒，将连续感应电刺激档调频 到128赫兹，电压为7伏，用两个镊子分别与两个电极相连接，一个镊子夹住蝎子的一个触 肢，再用一个镊子夹在蝎子尾节毒囊腺体处，使整个系统产生带电通路，对蝎子产生电刺激， 以排出毒液；若无反应，在电极与镊子接触的部位滴上几滴生理盐水，使蝎子毒囊腺体肌肉 收缩，促其排毒，得到粗毒液；
b、将步骤a得到的粗毒液，再放入含冰水50mL的离心管收集尾刺所排出的粗毒液；
c、将步骤b中提取的粗毒液，用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压力为 10Pa，时间为24h，得到总的粗毒素干粉；
d、将步骤c中的粗毒素干粉，溶于20mM，pH 5.4醋酸铵缓冲溶液，震荡10min，在 温度4℃静止1h，之后离心，离心温度为4℃，离心时间为10min，离心转速为8000rpm/min 取上清液；
e、将步骤d中的上清液，用20mM，pH 5.4醋酸铵缓冲溶液平衡CM-650M阳离子交换层 析柱，上样量为80mg，流速为0.4mL/min，用洗脱液为含0％-50％氯化钠的20mM pH 5.4的 醋酸铵缓冲溶液进行梯度洗脱，按离子强度分为四个蛋白组分，分别为一个酸性或中性蛋白 部位和三个碱性蛋白部位；
f.将步骤e中的四个蛋白部位，在温度4℃环境下用冷蒸水透析，每4h换一次透析溶液， 共替换8次，得到四个蛋白组分的脱盐溶液；
g、将步骤f中的四个蛋白组分分别用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到四个蛋白部位干燥粉末；
h、将步骤g中的干燥粉末通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对判断透明质酸酶所在部位 为50％氯化钠洗脱组分。
i、将步骤h中的50％氯化钠洗脱组分溶于5ml超纯水中，用超纯水平衡分子筛凝胶柱， 上样量为90mg,流速为0.4ml/min，以超纯水进行洗脱，得到分子量分别为55KD，40KD和20KD 的三种蛋白类物质水溶液；
j、将步骤i中的三种蛋白类物质水溶液分别用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到三种蛋白类物质粉末；
k、将步骤j中的三种粉末样品通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对最终确认分子量为 55KD的蛋白样品为高纯度透明质酸酶。
实施例8
a、用高频弱电流刺激法刺激蝎子尾节，采用小型按摩仪采毒，将连续感应电刺激档调频 到128赫兹，电压为4伏，用两个镊子分别与两个电极相连接，一个镊子夹住蝎子的一个触 肢，再用一个镊子夹在蝎子尾节毒囊腺体处，使整个系统产生带电通路，对蝎子产生电刺激， 以排出毒液；若无反应，在电极与镊子接触的部位滴上几滴生理盐水，使蝎子毒囊腺体肌肉 收缩，促其排毒，得到粗毒液；
b、将步骤a得到的粗毒液，再放入含冰水50mL的离心管收集尾刺所排出的粗毒液；
c、将步骤b中提取的粗毒液，用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压力为 10Pa，时间为24h，得到总的粗毒素干粉；
d、将步骤c中的粗毒素干粉，溶于20mM，pH 5.4醋酸铵缓冲溶液，震荡10min，在温度4℃静止1h，之后离心，离心温度为4℃，离心时间为10min，离心转速为8000rpm/min 取上清液；
e、将步骤d中的上清液，用20mM，pH 5.4醋酸铵缓冲溶液平衡CM-650M阳离子交换层 析柱，上样量为80mg，流速为1.2mL/min，用洗脱液为含0％-50％氯化钠的20mM pH 5.4的醋 酸铵缓冲溶液进行梯度洗脱，按离子强度分为四个蛋白组分，分别为一个酸性或中性蛋白部 位和三个碱性蛋白部位；
f.将步骤e中的四个蛋白部位，在温度4℃环境下用冷蒸水透析，每4h换一次透析溶液， 共替换8次，得到四个蛋白组分的脱盐溶液；
g、将步骤f中的四个蛋白组分分别用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到四个蛋白部位干燥粉末；
h、将步骤g中的干燥粉末通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对判断透明质酸酶所在部位 为50％氯化钠洗脱组分。
i、将步骤h中的50％氯化钠洗脱组分溶于5ml超纯水中，用超纯水平衡分子筛凝胶柱， 上样量为100mg,流速为0.4ml/min，以超纯水进行洗脱，得到分子量分别为55KD，40KD和 20KD的三种蛋白类物质水溶液；
j、将步骤i中的三种蛋白类物质水溶液分别用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到三种蛋白类物质粉末；
k、将步骤j中的三种粉末样品通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对最终确认分子量为 55KD的蛋白样品为高纯度透明质酸酶。
实施例9
a、用高频弱电流刺激法刺激蝎子尾节，采用小型按摩仪采毒，将连续感应电刺激档调频 到128赫兹，电压为5伏，用两个镊子分别与两个电极相连接，一个镊子夹住蝎子的一个触 肢，再用一个镊子夹在蝎子尾节毒囊腺体处，使整个系统产生带电通路，对蝎子产生电刺激， 以排出毒液；若无反应，在电极与镊子接触的部位滴上几滴生理盐水，使蝎子毒囊腺体肌肉 收缩，促其排毒，得到粗毒液；
b、将步骤a得到的粗毒液，再放入含冰水50mL的离心管收集尾刺所排出的粗毒液；
c、将步骤b中提取的粗毒液，用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压力为 10Pa，时间为24h，得到总的粗毒素干粉；
d、将步骤c中的粗毒素干粉，溶于20mM，pH 5.4醋酸铵缓冲溶液，震荡10min，在温度4℃静止1h，之后离心，离心温度为4℃，离心时间为10min，离心转速为8000rpm/min 取上清液；
e、将步骤d中的上清液，用20mM，pH 5.4醋酸铵缓冲溶液平衡CM-650M阳离子交换层 析柱，上样量为80mg，流速为2mL/min，用洗脱液为含0％-50％氯化钠的20mM pH 5.4的醋酸 铵缓冲溶液进行梯度洗脱，按离子强度分为四个蛋白组分，分别为一个酸性或中性蛋白部位 和三个碱性蛋白部位；
f.将步骤e中的四个蛋白部位，在温度4℃环境下用冷蒸水透析，每4h换一次透析溶液， 共替换8次，得到四个蛋白组分的脱盐溶液；
g、将步骤f中的四个蛋白组分分别用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到四个蛋白部位干燥粉末；
h、将步骤g中的干燥粉末通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对判断透明质酸酶所在部位 为50％氯化钠洗脱组分；
i、将步骤h中的50％氯化钠洗脱组分溶于5ml超纯水中，用超纯水平衡分子筛凝胶柱， 上样量为25mg,流速为0.4ml/min，以超纯水进行洗脱，得到分子量分别为55KD，40KD和20KD 的三种蛋白类物质水溶液；
j、将步骤i中的三种蛋白类物质水溶液分别用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到三种蛋白类物质粉末；
k、将步骤j中的三种粉末样品通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对最终确认分子量为 55KD的蛋白样品为高纯度透明质酸酶。
实施例10
a、用高频弱电流刺激法刺激蝎子尾节，采用小型按摩仪采毒，将连续感应电刺激档调频 到128赫兹，电压为6伏，用两个镊子分别与两个电极相连接，一个镊子夹住蝎子的一个触 肢，再用一个镊子夹在蝎子尾节毒囊腺体处，使整个系统产生带电通路，对蝎子产生电刺激， 以排出毒液；若无反应，在电极与镊子接触的部位滴上几滴生理盐水，使蝎子毒囊腺体肌肉 收缩，促其排毒，得到粗毒液；
b、将步骤a得到的粗毒液，再放入含冰水50mL的离心管收集尾刺所排出的粗毒液；
c、将步骤b中提取的粗毒液，用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压力为 10Pa，时间为24h，得到总的粗毒素干粉；
d、将步骤c中的粗毒素干粉，溶于20mM，pH 5.4醋酸铵缓冲溶液，震荡10min，在温度4℃静止1h，之后离心，离心温度为4℃，离心时间为10min，离心转速为8000rpm/min 取上清液；
e、将步骤d中的上清液，用20mM，pH 5.4醋酸铵缓冲溶液平衡CM-650M阳离子交换层 析柱，上样量为80mg，流速为1mL/min，用洗脱液为含0％-50％氯化钠的20mM pH 5.4的醋酸 铵缓冲溶液进行梯度洗脱，按离子强度分为四个蛋白组分，分别为一个酸性或中性蛋白部位 和三个碱性蛋白部位；
f.将步骤e中的四个蛋白部位，在温度4℃环境下用冷蒸水透析，每4h换一次透析溶液， 共替换8次，得到四个蛋白组分的脱盐溶液；
g、将步骤f中的四个蛋白组分分别用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到四个蛋白部位干燥粉末；
h、将步骤g中的干燥粉末通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对判断透明质酸酶所在部位 为50％氯化钠洗脱组分；
i、将步骤h中的50％氯化钠洗脱组分溶于5ml超纯水中，用超纯水平衡分子筛凝胶柱， 上样量为20mg,流速为0.4ml/min，以超纯水进行洗脱，得到分子量分别为55KD，40KD和20KD 的三种蛋白类物质水溶液；
j、将步骤i中的三种蛋白类物质水溶液分别用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到三种蛋白类物质粉末；
k、将步骤j中的三种粉末样品通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对最终确认分子量为 55KD的蛋白样品为高纯度透明质酸酶。
实施例11
a、用高频弱电流刺激法刺激蝎子尾节，采用小型按摩仪采毒，将连续感应电刺激档调频 到128赫兹，电压为7伏，用两个镊子分别与两个电极相连接，一个镊子夹住蝎子的一个触 肢，再用一个镊子夹在蝎子尾节毒囊腺体处，使整个系统产生带电通路，对蝎子产生电刺激， 以排出毒液；若无反应，在电极与镊子接触的部位滴上几滴生理盐水，使蝎子毒囊腺体肌肉 收缩，促其排毒，得到粗毒液；
b、将步骤a得到的粗毒液，再放入含冰水50mL的离心管收集尾刺所排出的粗毒液；
c、将步骤b中提取的粗毒液，用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压力为 10Pa，时间为24h，得到总的粗毒素干粉；
d、将步骤c中的粗毒素干粉，溶于20mM，pH 5.4醋酸铵缓冲溶液，震荡10min，在温度4℃静止1h，之后离心，离心温度为4℃，离心时间为10min，离心转速为8000rpm/min 取上清液；
e、将步骤d中的上清液，用20mM，pH 5.4醋酸铵缓冲溶液平衡CM-650M阳离子交换层 析柱，上样量为80mg，流速为1mL/min，用洗脱液为含0％-50％氯化钠的20mM pH 5.4的醋酸 铵缓冲溶液进行梯度洗脱，按离子强度分为四个蛋白组分，分别为一个酸性或中性蛋白部位 和三个碱性蛋白部位；
f.将步骤e中的四个蛋白部位，在温度4℃环境下用冷蒸水透析，每4h换一次透析溶液， 共替换8次，得到四个蛋白组分的脱盐溶液；
g、将步骤f中的四个蛋白组分分别用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到四个蛋白部位干燥粉末；
h、将步骤g中的干燥粉末通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对判断透明质酸酶所在部位 为50％氯化钠洗脱组分；
i、将步骤h中的50％氯化钠洗脱组分溶于5ml超纯水中，用超纯水平衡分子筛凝胶柱， 上样量为100mg,流速为0.4ml/min，以超纯水进行洗脱，得到分子量分别为55KD，40KD和 20KD的三种蛋白类物质水溶液；
j、将步骤i中的三种蛋白类物质水溶液分别用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到三种蛋白类物质粉末；
k、将步骤j中的三种粉末样品通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对最终确认分子量为 55KD的蛋白样品为高纯度透明质酸酶。
实施例12
a、用高频弱电流刺激法刺激蝎子尾节，采用小型按摩仪采毒，将连续感应电刺激档调频 到128赫兹，电压为3伏，用两个镊子分别与两个电极相连接，一个镊子夹住蝎子的一个触 肢，再用一个镊子夹在蝎子尾节毒囊腺体处，使整个系统产生带电通路，对蝎子产生电刺激， 以排出毒液；若无反应，在电极与镊子接触的部位滴上几滴生理盐水，使蝎子毒囊腺体肌肉 收缩，促其排毒，得到粗毒液；
b、将步骤a得到的粗毒液，再放入含冰水50mL的离心管收集尾刺所排出的粗毒液；
c、将步骤b中提取的粗毒液，用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压力为 10Pa，时间为24h，得到总的粗毒素干粉；
d、将步骤c中的粗毒素干粉，溶于20mM，pH 5.4醋酸铵缓冲溶液，震荡10min，在 温度4℃静止1h，之后离心，离心温度为4℃，离心时间为10min，离心转速为8000rpm/min 取上清液；
e、将步骤d中的上清液，用20mM，pH 5.4醋酸铵缓冲溶液平衡CM-650M阳离子交换层 析柱，上样量为80mg，流速为1mL/min，用洗脱液为含0％-50％氯化钠的20mM pH 5.4的醋酸 铵缓冲溶液进行梯度洗脱，按离子强度分为四个蛋白组分，分别为一个酸性或中性蛋白部位 和三个碱性蛋白部位；
f.将步骤e中的四个蛋白部位，在温度4℃环境下用冷蒸水透析，每4h换一次透析溶液， 共替换8次，得到四个蛋白组分的脱盐溶液；
g、将步骤f中的四个蛋白组分分别用真空冷冻干燥机冻干，冷冻干燥温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到四个蛋白部位干燥粉末；
h、将步骤g中的干燥粉末通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对判断透明质酸酶所在部位 为50％氯化钠洗脱组分。
i、将步骤h中的50％氯化钠洗脱组分溶于5ml超纯水中，用超纯水平衡分子筛凝胶柱， 上样量为60mg,流速为0.4ml/min，以超纯水进行洗脱，得到分子量分别为55KD，40KD和20KD 的三种蛋白类物质水溶液；
j、将步骤i中的三种蛋白类物质水溶液分别用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压 力为10Pa，时间为24h，得到三种蛋白类物质粉末；
k、将步骤j中的三种粉末样品通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对最终确认分子量为 55KD的蛋白样品为高纯度透明质酸酶。
实施例13
将实施例1-12所得到的三个蛋白组分利用常规浊度法进行酶活力测定，确定透明质酸酶 所在部位：
实验方法：
配置含氯化钠浓度为0.15mol/l的0.2mol/l pH4.5的醋酸缓冲液，将样品和透明质酸(HA) 溶于缓冲液，浓度分别为2mg/ml及1mg/ml；以浓度2％氢氧化钠为溶剂配置浓度为2.5％的十 六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；
在1.5ml离心管内加入20μl样品和100μl透明质酸溶液，空白组为20μl缓冲液和100μl透明质酸溶液，放入烘箱温度37℃反应45分钟；冷却至室温后加入200μl 2.5％十 六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，再次放入烘箱温度37℃反应10分钟，每个样品重复三次 平行实验；
将离心管内的溶液加入96孔板中，每孔加入250μl，用酶标仪测定波长为405nm处各 实验组与空白组的吸光度值，以市购标准品做标准曲线，测定实验组即条斑钳蝎毒素中纯化 出的高纯度透明质酸酶的酶活力见表1；
表1透明质酸酶纯化步骤活力最高部位相关化学性质
Figure BDA0003530473270000141
实施例14
将实施例13所得到的酶活力最高部位进行化学性质测定：
实验方法：
蛋白含量检测：使用BCA试剂盒法，以标准牛血清蛋白作为标准曲线，以蛋白样品：工 作液1:8的比例混合加入金96孔板中，温度37℃孵育30分钟，利用酶标仪在波长562nm处检测吸光度，将样品吸光度带入标准曲线求出样品浓度；
糖含量检测：使用苯酚硫酸法，以葡萄糖标准品作为标准曲线，按照体积比4:6:3的比 例将5％苯酚溶液，浓硫酸，样品溶液加入96孔板内，沸水浴10分钟，利用酶标仪在波长490nm 处检测吸光度，将样品吸光度带入标准曲线求出样品浓度见表1。
实施例15
将实施例13所得到的酶活力最高部位进行氨基酸组成分析：
实验方法：
样品酸水解：将8mg样品置于20ml旋盖(内置隔垫)细口瓶，加入10ml 0.1％苯酚和6mol/l 盐酸水溶液，旋紧盖子，震荡混匀，温度110℃下反应24h，反应完毕，将反应液全部转移到 100ml蒸馏瓶中，温度75℃下减压旋蒸至近干，以除去反应液中残留的盐酸，然后用12ml 0.2mol/l盐酸水溶液分三次溶解残渣，并转移到20ml玻璃具塞刻度试管，再用纯水定容至 20ml,待衍生；
异硫氰酸苯酯衍生化：取量200μl酸水解后样品溶液，置于1.5ml离心管中，加入100 μl 1mol/l三乙胺乙腈溶液和100μl 0.2mol/l异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，室温反应1 小时，然后再加入400μl正己烷，旋紧盖子后剧烈震荡5-10秒，静置分层，取200μl下层 溶液与800μl水混合，0.22μm针式过滤器过滤，待分析；
HPLC氨基酸组成分析：按照Diamonsil AAA氨基酸分析住使用说明书，对衍生过的氨基 酸混合标准品和样品分别进行HPLC分析，比对样品所得谱图出峰时间与混合标准品中不同氨 基酸的出峰时间判断样品所含氨基酸种类；比对样品谱图中各峰峰面积比判断样品所含氨基 酸比例结果见表2；
表2条斑钳蝎纯化透明质酸酶主要氨基酸组成
Figure BDA0003530473270000151
实施例16
将实施例13所得的酶活力最高部位进行单糖组成分析：
实验方法：
1)样品衍生化：称取样品20mg，加入2ml 4mol/l的三氟乙酸，充分混匀，于温度110℃ 条件下充分反应6h后，减压蒸干，加入甲醇复溶减压蒸干，重复至无三氟乙酸残留，然后加 入1ml吡啶和20mg盐酸羟胺充分混匀，于温度90℃水浴锅内反应30分钟，冷却，加入lml醋酸酐混匀后，温度90℃水浴锅内反应30分钟，冷却，0.22μm针式过滤器过滤，待分析；
2)GC-MS分析：根据GC-MS测定单糖组成方法，对衍生过的氨基酸混合标准品和样品分 别进行HPLC分析，比对样品所得谱图出峰时间与不同单糖标准品的出峰时间判断样品所含单 糖种类；比对样品谱图中各峰峰面积比判断样品所含单糖比例结果如表3；
表3条斑钳蝎纯化透明质酸酶主要单糖组成
Figure BDA0003530473270000152
实施例17
以清除DPPH自由基和抗ABTS+·为指标对实施例13所得的酶活力最高部位进行抗氧化活 性筛选：
实验方法：
1)清除DPPH自由基活性：取100μl的DPPH乙醇溶液置于96孔板中，再加入同等量样品溶液，混匀，其中每个样品进行3次平行实验，在温度37℃下避光反应30min后，用酶 标仪在517nm处测定其吸光度，按下式计算DPPH自由基清除率。并计算出样品的IC50；
Figure BDA0003530473270000161
式中:A0为未加样品空白组体系的吸光度；Ai为加入样品实验组体系的吸光度；Aj为仅 含样品对照组的吸光度；
2)抗ABTS+·活性：将配制好的ABTS+·乙醇溶液稀释至在波长为734nm处吸光度为0.7 ±0.02，取100μl稀释过的ABTS+·乙醇溶液于96孔板中，加入同等量的样品液，混匀，其 中每个样品进行3次平行实验，常温反应10min后，用酶标仪在734nm处测定吸光度，按下 式计算ABTS·清除率。并计算出两种样品的IC50(图7)；
Figure BDA0003530473270000162
式中：A0为未加样品体系的吸光度；Ai为加入样品体系的吸光度。
通过本发明所述方法获得透明质酸酶命名为F1,得率为1.5％。对其进行酶活力评价，活 力测试结果表明：从条斑钳蝎毒素中纯化得到的高纯度透明质酸酶比活力达到2300U/mg，为 市售标准品的2-3倍。氨基酸组成分析表明：主要含有的氨基酸为色氨酸，赖氨酸和丝氨酸， 含有的多糖为甘露糖和氨基葡萄糖。抗氧化活性筛选，结果表明：具有较好的抗氧化活性， 尤其是抗ABTS+·活性，对透明质酸酶类物质的抗氧化有一定的指导作用。本发明分离制备 方法更科学化，得到了纯度和活力都较高的透明质酸酶，生产工艺更简单及合理，使产品质 量有了进一步保障，为透明质酸酶标准品的制备药用原料提供一定的物质基础依据。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应 为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种从野生条斑钳蝎中分离纯化透明质酸酶的方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、用高频弱电流刺激法刺激蝎子尾节，采用小型按摩仪采毒，将连续感应电刺激档调频到128赫兹，电压为3-7伏，用两个镊子分别与两个电极相连接，一个镊子夹住蝎子的一个触肢，另一个镊子夹在蝎子尾节毒囊腺体处，使整个系统产生带电通路，对蝎子产生电刺激，以排出毒液，若无反应，在电极与镊子接触的部位滴上几滴生理盐水，使蝎子毒囊腺体肌肉收缩，促其排毒，得到粗毒液；
b、将步骤a得到的粗毒液，放入含冰水50 mL的离心管收集尾刺所排出的粗毒液；
c、将步骤b中提取的粗毒液，用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压力为10 Pa，时间为24 h，得到总的粗毒素干粉；
d、将步骤c中的粗毒素干粉，溶于20 mM，pH 4.5-7 醋酸铵、磷酸或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液，震荡10 min，在温度4℃静止1 h，离心，温度4℃，时间10 min，转速为8000rpm/min，取上清液；
e、将步骤d中的上清液，用20 mM醋酸铵、磷酸或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液平衡的阳离子交换柱，上样量为80mg，流速为0.4-2mL/min，用洗脱液为含0%-70%的氯化钠的20mM醋酸铵缓冲液溶液进行梯度洗脱，按离子强度分为四个蛋白组分，分别为一个酸性或中性蛋白部位和三个碱性蛋白部位；
f. 将步骤e中的四个蛋白部位，在温度4℃环境下用冷蒸水透析，每4h换1次透析溶液，共替换8次，得到四个蛋白部位的脱盐溶液；
g、将步骤f中的四个蛋白组分分别用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压力为15Pa，时间为24h，得到四个蛋白部位干燥粉末；
h、将步骤g中的干燥粉末通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对判断透明质酸酶所在部位为50%氯化钠洗脱组分；
i、将步骤h中的50%氯化钠洗脱组分溶于5ml超纯水中，用超纯水平衡分子筛凝胶柱，上样量为20-100mg,流速为0.4ml/min，以超纯水进行洗脱，得到分子量分别为55KD，40KD和20KD的三种蛋白类物质水溶液；
j、将步骤i中的三种蛋白类物质水溶液分别用真空冷冻干燥机冻干，温度为-80℃，压力为10 Pa，时间为24h，得到三种蛋白类物质粉末；
k、将步骤j中的三种粉末样品通过SDS聚丙酰胺电泳与标准品比对最终确认分子量为55KD的蛋白样品为高纯度透明质酸酶。
2.根据权利要求1所述方法获得的条斑钳蝎毒素中的透明质酸酶在制备抗氧化中的药物的用途。
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