CN114504000A - 一种环保酵素及其快速制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

炭角菌科真菌（Xylaria radix）sj18菌株和发酵毕赤酵母菌（Pichia fermentans）15B1菌株以农牧业生产加工的剩余废物作为发酵底物依次发酵，获得的发酵液经灭活，加工生产制得的酵素具有驱蚊虫效用。该生产成本低廉，无污染无残留，对环境友好，对动植物无毒副作用，在生物驱虫剂的加工生产上有重要的指导意义。

Description

一种环保酵素及其快速制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及炭角菌科真菌（Xylaria radix）sj18菌株和发酵毕赤酵母菌（Pichia fermentans）15B1菌株依次发酵的产物在驱离蚊虫方面的应用。
背景技术
酵素是以动物、植物、菌类等为原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分（包括多糖类、寡糖类、蛋白质及多肽、氨基酸类、维生素类）的产品。酵素有驱蚊作用，由于其多由各种益生菌发酵糖类而来，所以有较好的生物安全性。传统上生产酵素都需要提供水果、蔬菜和各种糖类作为发酵底物，这些原材料价格高，因此发酵成本高，而且时间长，少则1个月，多则半年。如果能够利用一些农牧业加工的残余物作为生产酵素的原料，那么就能够废物利用，变废为宝，降低生产成本。炭角菌科真菌（Xylaria radix）sj18菌株能够利用和分解木屑，并且还有较好的利用米糠进行发酵的能力，其发酵产物对于酵素类菌的生长十分有益，可以大大缩短酵素的发酵过程，所以将其发酵产物再让发酵毕赤酵母菌（Pichia fermentans）15B1菌株进行二次发酵生成酵素。上述过程的发酵底物价格低，发酵时间段，因此生产成本低廉；
本发明在已有的发明“一种炭角菌科真菌及其应用”（ZL 201710795984.0）和“一种发酵毕赤酵母及其应用”（ZL 202110032614.8）的基础上，结合两种真菌发酵底物的差异和互补性，将米糠和木屑等农作物加工残余物分解成糖类，成为发酵毕赤酵母菌（Pichia fermentans）15B1酵素菌进一步发酵的底物，最后发酵产生包含多种挥发性物质的酵素。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种利用炭角菌科真菌菌株sj18和发酵毕赤酵母菌株15B1以农作物加工残余物如木屑和米糠等为底物进行依次发酵，快速、低成本生产用于驱离蚊虫的酵素；
所述的菌株是保藏号为CGMCC No.12780的炭角菌科真菌（Xylaria radix）菌株sj18和保藏号为CGMCC No.19317的发酵毕赤酵母菌（Pichia fermentans）菌株15B1；
所述的依次发酵过程是：
本发明的两个菌株sj18和15B1均来源于植物内生菌，利用农作物作为发酵底物，不论是发酵过程还是发酵产物均是无污染无残留，对环境友好；且由于两个菌的生长过程优势互补，使得其能充分利用农作物加工残余物依次发酵，最终制作获得具有驱离蚊虫效用的酵素。
附图说明
图1：Sj18菌株利用各种糖类的能力，32℃培养2天后的菌落；
图1中，培养皿中的碳源从左到右依次为：乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、木糖、空白未接种、空白接种（对照）。每种碳源2皿。
图2：Sj18菌株利用松木屑和米糠混合物生长的菌落状态。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。下述的实施例并不对本发明作限定作用。
实施例1：Sj18菌株的碳源测试
Sj18菌株具有利用各种糖类的能力。碳源测试：先将sj18菌株从育有sj18菌落的PDA平板打孔0.5cm获得菌种，将这0.5cm菌块接种至只含琼脂的空白培养基平板上32℃生长3天，再从长出的菌丝边缘打孔取出菌块接种入各种不同碳源培养基的平板中，32℃培养2天，比较它们的菌丝生长差异；
所述的碳源分别为：乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、木糖、空白未接种、空白接种。Sj18菌株在不同碳源中生长均良好，各类碳源都能充分利用，具体生长表状见图1；
上述各种试剂均为国产分析纯；
Sj18菌株还能够利用松木屑和米糠混合物生长。实验测试：配制培养基，将水100mL、松木5g、米糠5g、琼脂1.2g称量，混合后在121℃灭菌20min，将培养基倒平板，取sj18菌种接种入平板中，32℃培养5天后，可见菌落生长，但速度慢于上述各类碳源培养基，具体生长表状见图2。
实施例2：利用米糠和木屑进行sj18和15B1菌的依次发酵
先准备含5%木屑和5%米糠的培养液500mL装入1L三角瓶中，121℃高温灭菌20min。在sj18菌的培养平板上用1cm打孔器打孔2-3个取得菌种，并将菌种接种到上述的1L三角瓶培养液中，200rpm震荡32℃培养5天，发酵液经200目真空抽滤，得滤液；
准备15B1菌的PDA平板，挑取克隆接种于5mL PDB培养液中过夜培养，然后将此5mL培养液接种到上述sj18发酵后的滤液中，32℃ 200rpm震荡培养2天，过滤，滤液4-15℃静置1天，离心取上清，70℃处理1h，得到灭活的菌类酵素。
实施例3：菌类酵素的气质联用检测挥发性组分分析
此分析揭示了酵素中一些具有驱蚊虫效用的关键组分。具体方法：
将sj18菌的培养平板用0.5cm打孔器从5cm以上的菌落边缘取一块菌种，接种入装有培养基斜面的顶空玻璃瓶（带有密封塞）中，32ºC培养三天。将脱附预处理过的SPME管穿透样品瓶隔垫，插入瓶中，推手柄杆使纤维头伸出针管并置于样品上部空间（顶空方式）以萃取，萃取时间约30分钟。紧接着，将SPME针管插入GC-MS仪（Agilent Technologies 7890AGC System、Agilent Technologies 5975C MS）进样口，推手柄杆，伸出纤维头，热脱附样品进色谱柱；
色谱条件：HP5石英毛细管柱（30m×0.32mm×0.25μm）；载气为99.999%的氦气；升温程序：初温为50℃，保持5min，以5℃/min的速率升至250℃，保持5min；进样口温度250℃；进样量1μL；
质谱条件：电子轰击（EI）离子源；电子能量70eV；离子源温度200℃；气相色谱质谱接口温度280℃；相对质量扫描范围m/z30-500；
由物质的分析可知，其中含有不少具有驱蚊虫作用的物质，尤其是其中的桉树脑和苯乙醇是较好的驱蚊植物精油（见表1），表1是发酵菌液的挥发性物质分析；
Figure 796850DEST_PATH_IMAGE001
实施例4：喷剂的驱蚊效果实测
将实施例2中的最终发酵液制作成喷剂，经大量志愿者测试有较好的驱蚊效果，未出现皮肤过敏现象。喷一次的有效驱蚊虫时间是半小时以上。统计其中10个志愿者，分别在两个手臂上一次性喷与不喷发酵液，统计数据如表2；
Table2（表2）最终发酵液喷洒皮肤驱蚊效果
志愿者 0.5h蚊咬次数 1h蚊咬次数
喷的手臂 不喷的手臂 喷的手臂 不喷的手臂
志愿者1 0 3 3 5
志愿者2 0 2 1 4
志愿者3 0 3 2 3
志愿者4 0 3 2 5
志愿者5 0 5 4 6
志愿者6 0 3 3 6
志愿者7 0 5 1 5
志愿者8 0 4 2 5
志愿者9 0 5 1 7
志愿者10 0 5 4 6
实施例5：喷剂的皮肤过敏现象实测
将实施例2中的最终发酵液制作成喷剂，经大量志愿者测试皮肤过敏现象。酵素液喷涂部位为前臂内侧皮肤，观察1h、2h、4h、24h，未见皮肤过敏现象。统计其中20个志愿者，数据如表3；
Table3（表3）最终发酵液喷洒前臂内侧皮肤24h过敏现象实测：
志愿者 1h 2h 4h 24h
志愿者1 0 0 0 0
志愿者2 0 0 0 0
志愿者3 0 0 0 0
志愿者4 0 0 0 0
志愿者5 0 0 0 0
志愿者6 0 0 0 0
志愿者7 0 0 0 0
志愿者8 0 0 0 0
志愿者9 0 0 0 0
志愿者10 0 0 0 0
实施例6：生物安全性测试
将实施例2中的最终发酵液经冷冻干燥后，莱驰MM400研磨仪粉碎，-20℃保存备用，使用时用水制成悬浮液；
毒性测试：
按照参照中华人民共和国国家标准GB/T 15670.2-2017 农药登记毒理学试验方法第2部分：急性经口毒性试验（霍恩氏法），对一种有机农药急性毒性研究，进行剂量达5000mg/kg体重以上的限量试验，初步考察急性经口毒性分级。具体来说，一天内分2次灌胃给药，连续观察14天，观察结束后，解剖动物进行各脏器大体肉眼观察，各脏器体积、颜色、质地等；
以5000mg/kg体重的剂量，一天内分2次灌胃给药，连续观察14天，未见任何中毒症状，未出现死亡。观察结束后，解剖动物进行各脏器大体肉眼观察，各脏器体积、颜色、质地等均未见异常。本试验条件下，上述两个菌株未表现出任何急性毒性；
给药后24h（特别在给药后30min内和第一个4h）以及14d的观察期内，各大鼠的中枢神经系统、神经肌肉系统、植物神经系统、呼吸系统、泌尿生殖系统、皮肤和毛、眼、消化系统等均正常，无任何异常表现，未出现死亡；
研究结果表明，本发明的两个菌株sj18和15B1利用农作物加工残余物作为发酵底物生产具有驱蚊虫效用的酵素，不仅无污染无残留，对环境友好，具有显著驱蚊虫效果，且未发现对动植物的毒副作用，对生产驱蚊剂等生物驱虫试剂具有重要意义。

Claims (4)

1.一种环保酵素及其快速制备方法，由保藏号为CGMCC No.12780的炭角菌科真菌（Xylaria radix）sj18菌株和保藏号为CGMCC No.19317的发酵毕赤酵母菌（Pichia fermentans）15B1菌株利用米糠和木屑作为发酵底物依次发酵后，灭活发酵液制得。
2.权利要求1所述的依次发酵，其特征在于先利用炭角菌科真菌（Xylaria radix）sj18菌株发酵米糠和木屑5-6天，经过滤菌丝后其发酵液再用发酵毕赤酵母菌（Pichia fermentans）15B1菌株发酵1-2天，获得最终发酵产物及酵素。
3.权利要求1所述的灭活，其特征是指将发酵液在70℃以上处理30-60min，灭活sj18菌株和15B1菌株。
4.权利要求1所述的一种环保酵素的应用，其特征在于该发酵液灭活后可以喷洒在皮肤表面，用于驱离蚊虫。
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