CN114502542A - 包含限制性脂质的纳米材料及其用途 - Google Patents

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詹姆斯·埃弗雷特·达尔曼
科里·戴恩·萨戈
甘祖保
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Georgia Tech Research Corp
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Abstract

提供了用于将核酸递送至细胞或组织微环境的组合物。在一个实施方案中，所述组合物是被配制成具有降低的脾和肝清除率的脂质纳米颗粒组合物。已经发现脂质纳米颗粒的化学组成显著影响脂质纳米颗粒的自然运输。更具体地，已经发现构象上限制性可电离脂质可以改变脂质纳米颗粒的向性和清除特性，而不需要靶向配体。还已经发现所公开的脂质纳米颗粒的向性与大小无关。

Description

包含限制性脂质的纳米材料及其用途
通过引用并入任何优先权申请
本申请要求2019年7月29日提交的题为“包含限制性脂质的纳米材料及其用途”的美国临时申请第62/879,731号的权益，其全部内容通过引用并入本文。
领域
本文所述的主题通常涉及药物递送系统及其使用方法。
引用序列表
本申请与电子序列表一起提交。电子序列表以名为GUIDE005WO.txt的文件形式提供，在2020年7月4日创建并进行最后修改，其大小为6,977字节。电子序列表的电子格式中的信息通过引用整体并入本文。
背景
T淋巴细胞调节免疫应答，使其成为用于开发新药的重要药物靶标。例如，阻断细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD1)或PD1配体1(PDL1)信号传导的抗体疗法已经驱动有效的抗肿瘤应答(Khalil,D.N.,et al.,Nat Rev Clin Oncol,13:273-290(2016)；Sharma,P.&Allison,J.P.,Science,348:56–61(2015))。然而，大量的患者对这些药剂没有反应，并且许多有反应的患者最终复发(Jenkins,T,et al.,BJC,118:9-16(2018))。另外，抗体疗法仅可抑制“可药化(druggable)”蛋白的活性，其被认为构成总蛋白编码基因组的约15％(Dixon,S.and Stockwell,B.,Curr Opin Chem Biol,13(5-6):549-555(2009))。
在疾病病理学中起重要作用的一些蛋白质是“不可药化的”。新创术语“不可药化的”以描述不能被药理学靶向的蛋白质(Cang,C.V.,et al.,Nature Reviews Cancer,17:502-508(2017))。今天，有许多被认为是不可药化的癌症靶(Cang,C.V.,et al.,NatureReviews Cancer,17:502-508(2017))。不可药化的蛋白质的实例包括细胞内蛋白质和缺乏容易被小分子药物结合的结构域的蛋白质。
抗体疗法限于可药化的蛋白质，因为抗体必须能够结合蛋白以发挥其治疗作用。siRNA可用于抑制任何基因的翻译，所述基因包括编码不可药化蛋白的基因。在T细胞活性中已经鉴定了几个不可药化蛋白靶标。因此，siRNA可用于治疗大量的由“不可药化的”蛋白引起的疾病，包括涉及T细胞的疾病。不幸的是，临床上相关的siRNA递送至肝细胞以外的细胞(Adams,D.,et al.,N Engl J Med,379:11-21(2018))仍然具有挑战性(Lorenzar,C.,etal.,J Control Release,203:1-15(2015))。尽管在T细胞siRNA递送中已经取得了若干进展，但仍存在若干障碍。例如，使用与带正电荷的肽连接的单链抗体将siRNA递送至T细胞；这导致靶基因在5mg/kg(高剂量)下沉默(Kumar,P.,et al.,Cell,134:577-586(2008))。在第二个实例中，用抗-CD4抗体包被纳米颗粒，导致在1mg/kg剂量下20％的体内靶基因沉默(Ramishetti,S.,et al.,ACS Nano,9:6706-6716(2015))。最近，靶向肝细胞的脂质纳米颗粒(LNP)通过用CD4抗体包被它们而重新靶向T细胞，导致在6mg/kg剂量下50％的体内T细胞基因沉默(Kedmi,R.,et al.,Nat Nanotechnol,13:214-219(2018))。所有这些疗法共有两个重要的共性。首先，它们需要超过1mg/kg siRNA以实现50％基因沉默，其高于目前批准用于人类的siRNA剂量(Adams,D.,et al.,N Engl J Med,379:11-21(2018))。其次，它们使用基于肽、蛋白质或适配体的靶向配体实现T细胞递送。
使用靶向配体，纳米药物经常被运输到细胞(Cheng,S.,et al.,Science,338:903-910(2012))。然而，唯一的FDA批准的RNA纳米颗粒疗法利用被自然运输至肝细胞的简单的脂质混合物(Adams,D.,et al.,N Engl J Med,379:11-21(2018))。自然运输未显示出促进纳米颗粒递送至免疫细胞。由于目前对纳米颗粒递送至T细胞的选择需要高剂量的核酸以实现基因沉默并依赖于用于细胞递送的靶向配体，因此需要改进的纳米颗粒组合物用于递送至T细胞。
因此，本发明的目的是提供可以将核酸递送至免疫细胞的递送媒介物及其使用方法。
本发明的另一个目的是提供调节免疫细胞功能的方法。
发明概述
提供了用于将核酸递送至特定细胞或组织微环境的组合物。在一个实施方案中，所述组合物是被配制成具有降低的脾和肝清除率的脂质纳米颗粒组合物。已经发现脂质纳米颗粒的化学组成显著影响脂质纳米颗粒的自然运输。更具体地，已经发现构象上限制性(conformationally constrained)可电离脂质可以改变脂质纳米颗粒的向性(tropism)和清除特性，而不需要靶向配体。还发现所公开的脂质纳米颗粒的向性与大小无关。
一个实施方案提供了具有构象上限制性可电离脂质、磷脂、聚乙二醇-脂质；胆固醇，和任选的核酸的可电离脂质纳米颗粒。在一个实施方案中，限制性可电离脂质具有根据式I的结构：
Figure BDA0003557997900000031
其中：
R1为
Figure BDA0003557997900000032
Figure BDA0003557997900000041
以及
R2为
Figure BDA0003557997900000042
在另一个实施方案中，限制性可电离脂质含有金刚烷尾部。在一些实施方案中，限制性可电离脂质是3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯。在一些实施方案中，磷脂是1-2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)或1-2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一些实施方案中，PEG-脂质是C14PEG2000或C18PEG2000。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒含有固醇。在一些实施方案中，固醇是胆固醇。核酸可以是RNA、DNA、单链RNA、单链DNA、双链RNA、双链DNA、三链DNA、siRNA、shRNA、sgRNA、mRNA、miRNA、反义DNA或它们的组合。
在一些实施方案中，核酸编码RNA引导的DNA内切核酸酶，包括但不限于Cas9、CasX、CasY、Cas13或Cpf1。
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒含有约30mol％至约70mol％构象上限制性可电离脂质，约5mol％至约25mol％磷脂，约25mol％至约45mol％胆固醇和约0.1mol％至约5mol％PEG-脂质。在其它实施方案中，构象上限制性可电离脂质可以以35、45、50或65摩尔百分比存在。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有约30nm至约170nm的流体力学直径。在另一个实施方案中，脂质纳米颗粒具有50nm至100nm的平均直径。
所公开的脂质纳米颗粒可以被配制成药物组合物，其任选地含有药学上可接受的赋形剂或药学上可接受的载体。
一个实施方案提供了脂质纳米颗粒，其中C14PEG2000以2.0至3.0摩尔％存在，DSPC以15至17摩尔％存在，胆固醇以45至47摩尔％存在，并且限制性脂质以33至36摩尔％存在。
另一个实施方案提供了将治疗剂或预防剂递送至有需要的个体的方法，该方法通过向个体施用一种或多种所公开的载有治疗性核酸，例如编码治疗性蛋白质的核酸，或抑制性核酸或酶核酸的脂质纳米颗粒组合物来进行。所述方法可进一步包括施用第二治疗剂。在一个实施方案中，纳米颗粒优先将货物递送至免疫细胞。免疫细胞可以是T细胞，例如CD8+T细胞，CD4+T细胞或T调节细胞。免疫细胞也可以是巨噬细胞或树突细胞。
一个实施方案提供了用于降低纳米颗粒组合物的脾或肝清除率的方法，其通过用有效量的构象上限制性可电离脂质配制该纳米颗粒以降低或抑制纳米颗粒的脾或肝清除率。
另一个实施方案提供了将核酸递送至有需要的个体的免疫细胞的方法，其通过向个体施用由3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯、DSPC、聚乙二醇-脂质、胆固醇和核酸组成的脂质纳米颗粒来实现，其中所述脂质纳米颗粒组合物任选地在不存在靶向配体的情况下将核酸递送至个体的免疫细胞。在一个实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。
另一个实施方案提供了用于在有需要的个体中减少免疫细胞中的基因表达的方法，其通过向个体施用由3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯、DSPC、聚乙二醇-脂质、胆固醇和和抑制性核酸组成的脂质纳米颗粒组合物来实现，其中所述脂质纳米颗粒组合物将所述抑制性核酸递送至所述个体的免疫细胞。
另一个实施方案提供了用于在有需要的个体中编辑免疫细胞中的基因的方法，其通过向个体施用包含第一脂质纳米颗粒群和第二脂质纳米颗粒群的脂质纳米颗粒组合物来实现，其中所述第一脂质纳米颗粒群由3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯、DSPC、聚乙二醇-脂质、胆固醇和对基因特异的sgRNA组成，并且其中第二脂质纳米颗粒群由3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯、DSPC、聚乙二醇-脂质、胆固醇和编码RNA引导的DNA内切核酸酶的mRNA组成。
附图的简要说明
图1A是可电离脂质骨架的结构，向其中加入了尾部变体(图1B所示的结构)和头基变体(图1C所示的结构)。图1D是显示用于配制104种不同LNP的可电离脂质、胆固醇、脂质-PEG和DSPC或DOPE的4个摩尔比的示意图。图1E是显示单独测量的所有配制的LNP的流体力学直径(nm)的点图。图1F是显示单独测量的所有配制的LNP的多分散性指数的点图。图1G-1I是显示作为可电离脂质类型(图1G)、可电离脂质的摩尔百分比(图1H)和磷脂类型(图1I)的函数绘制的LNP的流体力学直径的条形图。
图2A是显示配制成携带不同DNA条形码和siGFP的纳米颗粒的示意图。图2B是显示实验工作流程的示意图，该工作流程包括将100种稳定的LNP汇集在一起，将它们施用于表达GFP的小鼠，3天后分离GFP低细胞，并对该群体内的DNA条形码进行测序的步骤。图2C是显示9种细胞类型中GFP低细胞百分比的条形图。图2D是显示9种细胞类型中GFP MFI百分比的条形图。图2E是显示在肺内皮细胞、脾B细胞和脾T细胞以及肝免疫细胞中的归一化DNA递送的点图。图2F是显示含有DSPC的LNP在脾T细胞中富集的示意图。图2G是显示作为磷脂的函数绘制的LNP的归一化DNA递送的点图。双向T检验，**P<0.01。图2H是含有DSPC或DOPE的LNP的归一化DNA递送的配对分析。配对双向T检验，*P<0.05。图2I是显示13种可电离脂质中每一种的富集的条形图。图2J是显示用头基11和尾部L、S或A配制的LNP的归一化DNA递送的条形图。单向ANOVA、*P<0.05、**P<0.01。
图3A显示可电离脂质11-A的结构。图3B显示了性能最好的cLNP的摩尔组成。图3C是显示以1.5mg/kg的剂量携带siLuc的cLNP或以0.5mg/kg和1.5mg/kg的剂量携带siGFP的cLNP处理后72小时，脾CD3+T细胞中的GFP表达的流式细胞术直方图。图3D是显示在不同剂量下携带siLuc或siGFP的cLNP处理后72小时，脾CD3+T细胞中归一化的GFP MFI的条形图。图3E是显示在2.0mg/kg剂量下携带siGFP的cLNP处理后72小时，脾CD8+T细胞和CD4+T细胞中的归一化的GFP MFI的条形图。图3F是显示在2.0mg/kg剂量下携带sgRNA的cLNP处理后，脾CD3+T细胞以及CD8+T细胞和CD4+T细胞中归一化的GFP MFI的条形图。图3G是显示在2.0mg/kg剂量下携带sgRNA的cLNP处理后，GFP低CD8+T细胞百分比的条形图。
图4A显示了可电离脂质的头基的分子量与T-细胞中富集的关系图。图4B显示了可电离脂质的头基的LogP与T-细胞中富集的关系图。图4C显示了可电离脂质上的头基的极性表面积的LogP与T-细胞中富集的关系图。图4D显示了含有DSPC和可电离脂质的LNP的配对分析，它们仅相差一个尾部。图4E显示归一化DNA递送和LNP直径的比较。
图5A-F是PBS处理的小鼠中的归一化GFP蛋白MFI，以及用含有限制性脂质的LNP给药的那些小鼠，所述LNP递送si荧光素酶和siGFP(以1.5mg/kg和0.5mg/kg)至肝细胞、肝免疫细胞、肝库普弗细胞、肝内皮细胞、脾单核细胞和脾B细胞。图5G是sgGFP上的序列和化学修饰。
详细说明
I.定义
应当理解，本公开不限于本文所述的组合物和方法以及所述的实验条件，因为它们可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述某些实施方案的目的，而不旨在限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求书限制。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。与本文所述类似或等同的任何组合物、方法和材料可用于本发明的实践或测试。所提及的所有出版物的全部内容通过引用并入到本文中。
在描述当前要求保护的发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用术语“a”、“an”、“所述”和类似的指代应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。
应理解，在本文所述的具有一个或多个手性中心的任何化合物中，如果没有明确指明绝对立体化学，则每个中心可以独立地为R-构型或S-构型或其混合物。因此，本文提供的化合物可以是对映体纯的、对映体富集的、外消旋混合物、非对映体纯的、非对映体富集的或立体异构体混合物。此外，应理解，在本文所述的具有一个或多个双键的产生可被定义为E或Z的几何异构体的任何化合物中，每个双键可独立地为E或Z及其混合物。
除非本文另有说明，本文中数值的范围的叙述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独的数值的速记方法，并且每个单独的数值被并入本说明书中，就好像其在本文中被单独地叙述一样。
术语“约”的使用旨在描述在约+/-10％的范围内高于或低于所述值的值；在其它实施方案中，所述值的范围可以为在约+/-5％的范围内高于或低于所述值的值；在其它实施方案中，所述值的范围可以为在约+/-2％的范围内高于或低于所述值的值；在其它实施方案中，所述值的范围可以为在约+/-1％的范围内高于或低于所述值的值。前述范围旨在通过上下文变得清楚，并且不暗示进一步的限制。本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地示例性说明本发明，并且除非另有声明，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的语言不应被解释为表示任何未要求保护的元素对本发明的实践是必要的。
如本文所用，“RNA”是指天然或非天然存在的核糖核酸。例如，RNA可以包括修饰的和/或非天然存在的组分，例如一种或多种核碱基、核苷、核苷酸或连接子。RNA可以包括帽结构、链终止核苷、茎环、poly A序列和/或多腺苷酸化信号。RNA可以具有编码所关注的多肽的核苷酸序列。例如，RNA可以是信使RNA(mRNA)。编码特定多肽的mRNA的翻译，例如哺乳动物细胞内mRNA的体内翻译，可以产生所编码的多肽。RNA可以选自由小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer酶-底物RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、mRNA、单导RNA(sgRNA)、cas9mRNA及它们的混合物组成的非限制性组。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以互换使用，是指通过肽键连接在一起的至少三个氨基酸的串。肽可以指单个肽或肽的集合。肽可含有天然氨基酸、非天然氨基酸(即，在自然界中不存在但可掺入多肽链中的化合物)和/或氨基酸类似物。此外，肽中的一个或多个氨基酸可以被修饰，例如，通过添加化学实体，如碳水化合物基团、磷酸基团、法呢基、异法呢基、脂肪酸基团、用于缀合、功能化或其它修饰的连接子等。修饰可包括肽的环化、D-氨基酸的掺入等。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”和“治疗用途”是指消除、减轻或改善疾病或病症的一种或多种症状。如本文所用，“治疗有效量”是指足以介导这类症状的临床相关的消除、减轻或改善的治疗剂的量。如果效果的大小足以影响接受者个体的健康或预后，则效果是临床相关的。治疗有效量可以指足以延迟或最小化疾病发作(例如延迟或最小化癌症扩散)的治疗剂的量。治疗有效量还可以指在疾病的治疗或管理中提供治疗益处的治疗剂的量。
如本文所用，术语“预防剂”是指在检测到病症或疾病的任何症状之前可用于预防所述病症或疾病的药剂。“预防有效”量是足以介导这种保护的预防剂的量。预防有效量还可以指在疾病的预防中提供预防益处的预防剂的量。
如本文所用，术语“个体”、“宿主”、“对象”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指哺乳动物，包括但不限于人，啮齿动物如小鼠和大鼠，以及其它实验动物。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”涵盖了任何标准的药物载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液，例如油/水或水/油乳液，和各种类型的润湿剂。
如本文所用，术语“构象上限制性脂质”是指其分子结构主要在一种架构中的脂质，例如金刚烷，其形状类似于“扶手椅”。
术语“PEG-脂质”是指用聚乙二醇修饰的脂质。示例性的PEG-脂质包括但不限于C14PEG350、C14PEG1000、C14PEG2000、C14PEG3000和C18PEG2000。
术语“寡核苷酸”是指含有相对少量核苷酸的短DNA、RNA或DNA/RNA分子或寡聚物。
本文所述的一些实施方案涉及式(I)化合物：
Figure BDA0003557997900000111
其中R1为：
Figure BDA0003557997900000112
R2为：
Figure BDA0003557997900000113
其中X为
Figure BDA0003557997900000121
以及
R3和R4各自独立地为
Figure BDA0003557997900000122
Figure BDA0003557997900000123
一些实施方案涉及式(III)化合物：
Figure BDA0003557997900000124
其中：
R8为–H或
Figure BDA0003557997900000125
R5、R6、R7和R9各自独立地为：-C8H17、-C10H21、-C12H25、-C13H27、-C14H29、C16H33或金刚烷基，
m和n各自独立地为0、1、2、3或4；
A为
Figure BDA0003557997900000126
Figure BDA0003557997900000127
R10和R11各自独立地为–H或
Figure BDA0003557997900000128
以及
R12为-C10H21。
一些实施方案涉及化合物，其中R2为
Figure BDA0003557997900000131
Figure BDA0003557997900000132
一些实施方案涉及脂质纳米颗粒组合物，其包含：构象上限制性可电离脂质；磷脂；聚乙二醇-脂质；胆固醇；和任选的核酸。一些实施方案涉及脂质纳米颗粒，其中构象上限制性可电离脂质包含根据本文所述结构的结构。一些实施方案涉及脂质纳米颗粒组合物，其中基于总摩尔数，构象上限制性可电离脂质的量以约35摩尔％至约65摩尔％存在。
一些实施方案涉及脂质纳米颗粒组合物，其中构象上限制性可电离脂质具有根据以下的结构
Figure BDA0003557997900000133
一些实施方案涉及脂质纳米颗粒组合物，其中构象上限制性可电离脂质具有根据以下的结构
Figure BDA0003557997900000134
一些实施方案涉及脂质纳米颗粒组合物，其中磷脂是1-2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。一些实施方案涉及脂质纳米颗粒组合物，其中聚乙二醇-脂质是C14PEG2000或C18PEG2000。
一些实施方案涉及脂质纳米颗粒组合物，其中所述组合物包含约30mol％至约70mol％构象上限制性可电离脂质、约5mol％至约25mol％磷脂、约25mol％至约45mol％胆固醇和约0.1mol％至约5mol％聚乙二醇-脂质。
一些实施方案涉及脂质纳米颗粒组合物，其中核酸包括RNA、DNA、单链RNA、单链DNA、双链RNA、双链DNA、三链DNA、siRNA、shRNA、sgRNA、mRNA、miRNA、反义DNA或它们的组合。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物是其中核酸编码蛋白质的组合物。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物是其中核酸编码RNA引导的DNA内切核酸酶的组合物。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物是其中RNA引导的DNA内切核酸酶是Cas9、CasX、CasY、Cas13或Cpf1的组合物。
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是其中脂质纳米颗粒具有约30nm至约170nm的流体力学直径的组合物。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物包含：构象上限制性可电离脂质，其包含金刚烷尾部；1-2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；C14PEG2000；胆固醇；和siRNA。在脂质纳米颗粒的一些实施方案中，构象上限制性可电离脂质是3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯。
在脂质纳米颗粒的一些实施方案中，C14PEG2000以约2.0至约3.0摩尔％存在，DSPC以约15至约17摩尔％存在，胆固醇以约45至约47摩尔％存在，构象上限制性可电离脂质以约33至约36摩尔％存在，并且siRNA以总脂质与siRNA的5至20质量比存在。在一些实施方案中，C14PEG2000以约2.5摩尔％存在，DSPC以约16摩尔％存在，胆固醇以约46.5摩尔％存在，并且构象上限制性可电离脂质以约35摩尔％存在。
一些实施方案涉及包含如本文所述的脂质纳米颗粒组合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
一些实施方案涉及将核酸递送至有需要的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用如本文所述的脂质纳米颗粒组合物或药物组合物。一些实施方案还包括向个体施用第二治疗剂。
一些实施方案涉及将核酸递送至有需要的个体的免疫细胞的方法，所述方法包括：向所述个体施用由3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯；DSPC；聚乙二醇-脂质；胆固醇；和核酸组成的脂质纳米颗粒组合物，其中所述脂质纳米颗粒组合物将所述核酸递送至所述个体的免疫细胞。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物不包含将脂质纳米颗粒组合物靶向免疫细胞的靶向配体。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是T调节细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+。在一些实施方案中，免疫细胞是巨噬细胞、树突细胞或肝脏免疫细胞。
一些实施方案涉及用于降低纳米颗粒组合物的脾或肝清除率的方法，所述方法包括用一定量的构象上限制性可电离脂质配制所述纳米颗粒组合物，所述可电离脂质在施用于个体时有效地降低或抑制所述纳米颗粒组合物的脾或肝清除率。在一些实施方案中，构象上限制性可电离脂质包含如本文所述的结构。
一些实施方案涉及用于增加纳米颗粒组合物向个体中的非肝细胞的细胞递送的方法，所述方法包括将所述纳米颗粒组合物配制成包含一定量的构象上限制性可电离脂质，所述可电离脂质在施用于所述个体时有效地增加所述纳米颗粒组合物向非肝细胞的细胞的递送。在一些实施方案中，构象上限制性可电离脂质包含如本文所述的结构。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是脂质纳米颗粒药物组合物。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒药物组合物包含磷脂、聚乙二醇-脂质、胆固醇和任选的第一核酸。在一些实施方案中，非肝细胞的细胞是脾B细胞、脾T细胞、肺内皮细胞和肝免疫细胞中的至少一种。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物还包含以约0.5mg/kg至约2.0mg/kg的量递送至个体的第二核酸。在一些实施方案中，递送至个体的第二核酸的量小于约1.0mg/kg。
一些实施方案涉及用于在有需要的个体中减少免疫细胞中的基因表达的方法，所述方法包括：向所述个体施用由3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯；DSPC；聚乙二醇-脂质；胆固醇；和抑制性核酸组成的脂质纳米颗粒组合物，其中所述脂质纳米颗粒组合物将所述抑制性核酸递送至所述个体的免疫细胞。在一些实施方案中，抑制性核酸是siRNA。在一些实施方案中，施用于个体的抑制性核酸的量小于约1.0mg/kg。在一些实施方案中，向个体施用的抑制性核酸的量为约0.5mg/kg。
一些实施方案涉及用于在有需要的个体中编辑免疫细胞中的基因的方法，所述方法包括：向所述个体施用包含第一脂质纳米颗粒群和第二脂质纳米颗粒群的脂质纳米颗粒组合物，其中所述第一脂质纳米颗粒群由3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯、DSPC、聚乙二醇-脂质、胆固醇和对该基因特异的sgRNA组成，并且其中第二脂质纳米颗粒群由3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯、DSPC、聚乙二醇-脂质、胆固醇和编码RNA引导的DNA内切核酸酶的mRNA组成。在一些实施方案中，RNA引导的DNA内切核酸酶选自Cas9、CasX、CasY、Cas13和Cpf1。在一些实施方案中，施用于个体的sgRNA和mRNA中的一种或两种的量小于约1.0mg/kg。在一些实施方案中，施用于个体的sgRNA和mRNA中的一种或两种的量为约0.5mg/kg。
II.脂质纳米颗粒
生物活性物质如小分子药物、蛋白质和核酸的有效靶向递送是医学领域的持续挑战。核酸的相对不稳定性和低细胞渗透性使得核酸的特异性递送变得困难。已经发现，具有限制性脂质的脂质纳米颗粒可以更有效地将核酸递送至体内的特定组织。在一个实施方案中，可以通过将核酸与构象上限制性可电离脂质、PEG-脂质、磷脂、胆固醇和任选的核酸混合来配制脂质纳米颗粒。示例性的脂质纳米颗粒制剂包括构象上限制性可电离脂质3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯、PEG-脂质、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒不包含靶向配体。在一些实施方案中，在不存在靶向配体的情况下所公开的脂质纳米颗粒相比于肝细胞优先靶向T细胞。
脂质纳米颗粒的大小是不同的。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒可具有约30nm-约170nm的流体力学直径。脂质纳米颗粒可具有约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm、155nm、160nm、165nm或170nm的直径。在另一个实施方案中，纳米颗粒具有50nm至100nm的直径。
A.可电离脂质
在一个实施方案中，所公开的脂质纳米颗粒包括可电离脂质。可电离脂质通常包括在头基上含有胺。在一个实施方案中，可电离脂质是构象上限制性可电离脂质。在一些实施方案中，构象上限制性脂质以35、45、50或65摩尔％存在。在另一个实施方案中，构象上限制性脂质以约33mol％至约36mol％存在。在另一个实施方案中，构象上限制性脂质以35mol％存在。一个实施方案提供了含有具有式I结构的脂质的LNP：
Figure BDA0003557997900000171
其中R1是脂质尾部，其选自：
Figure BDA0003557997900000181
Figure BDA0003557997900000182
以及
R2是头基，其选自：
Figure BDA0003557997900000183
Figure BDA0003557997900000191
另一个实施方案提供了具有式II结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000192
3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯或含有式II的可电离脂质的LNP。
另一个实施方案提供了式I的可电离脂质，其中R1是尾部L，并且R2是化合物(1)，或包含所述可电离脂质的LNP。
又一个实施方案提供了式I的可电离脂质，其中R1是尾部L，并且R2是化合物(2)，或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000193
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000201
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000202
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000203
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000204
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000211
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000212
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案是根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000213
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000214
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000221
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000222
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000223
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000224
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000225
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000231
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000232
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000233
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000234
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000241
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000242
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000243
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000244
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000245
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000251
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000252
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000253
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000254
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000255
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000261
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000262
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000263
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案是根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000264
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000265
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000271
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000272
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000273
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000274
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000281
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000282
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000283
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000291
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000292
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000293
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000294
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000301
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000302
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000303
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000304
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000311
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000312
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000313
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000321
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000322
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000323
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000324
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000331
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000332
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000333
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000334
或包含所述可电离脂质的LNP。
一个实施方案提供了根据以下结构的可电离脂质：
Figure BDA0003557997900000335
或包含所述可电离脂质的LNP。
B.固醇
在一些实施方案中，所公开的脂质纳米颗粒包括一种或多种固醇。在一个实施方案中，固醇是胆固醇，或其变体或其衍生物。在一些实施方案中，胆固醇被修饰，例如被氧化。未修饰的胆固醇可以被酶作用以形成侧链-或环-被氧化的变体。胆固醇可以在β-环结构上或在烃尾结构上被氧化。认为可用于所公开的脂质纳米颗粒的示例性胆固醇包括但不限于25-羟基胆固醇(25-OH)、20α-羟基胆固醇(20α-OH)、27-羟基胆固醇、6-酮基-5α-羟基胆固醇、7-酮基胆固醇、7β-羟基胆固醇、7α-羟基胆固醇、7β-25-二羟基胆固醇、β-谷固醇、豆固醇或它们的组合。在一个实施方案中，相对于其它胆固醇变体，侧链被氧化的胆固醇可增强货物递送。在一个实施方案中，胆固醇是未修饰的胆固醇。
C.PEG-脂质
在一些实施方案中，所公开的纳米颗粒组合物还包括一种或多种PEG或PEG-修饰的脂质。这种物质也可以被称为PEG化的脂质或PEG-脂质。包含PEG化脂质可用于增强脂质纳米颗粒的体外胶体稳定性和体内循环时间。在一些实施方案中，PEG化是可逆的，因为PEG部分在血液循环中被逐渐释放。示例性的PEG-脂质包括但不限于与具有C6-C20的长度的饱和或不饱和烃基链缀合的PEG。PEG-修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG-修饰的磷脂酸、PEG-修饰的神经酰胺(PEG-CER)、PEG-修饰的二烷基胺、PEG-修饰的二酰基甘油(PEG-DAG)、PEG-修饰的二烷基甘油及它们的混合物。例如，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPE、PEG-DSG或PEG-DSPE脂质。
在一个实施方案中，PEG脂质是DMPE-PEG2000或DSPE-PEG2000。
D.磷脂
纳米颗粒的磷脂组分可以包括一种或多种磷脂，例如一种或多种(多)不饱和脂质。磷脂可以组装成一个或多个脂质双层。在一些实施方案中，磷脂可以包括磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。
在一些实施方案中，磷脂部分包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂。在一些实施方案中，脂肪酸部分包括但不限于月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻油酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山嵛酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。也考虑非天然物种，其包括具有包括支化、氧化、环化和炔烃在内的修饰和取代的天然物种。例如，磷脂可以用一个或多个炔烃(例如，其中一个或多个双键被叁键替代的烯基基团)官能化或与该炔烃交联。在合适的反应条件下，炔基基团在暴露于叠氮化物时可以经历铜催化的环加成。此类反应可用于功能化纳米颗粒组合物的脂质双分子层以促进膜渗透或细胞识别，或用于将纳米颗粒组合物缀合至有用的组分如靶向部分或成像部分(例如染料)。
示例性的磷脂包括但不限于1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二十一烷酰基-sn-甘油基-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-0-十八碳烯基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0DietherPC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、1,2-二二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酰基-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂，磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，磷脂酸，棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)。在优选的实施方案中，磷脂是DSPC。
E.货物
在一个实施方案中，所公开的脂质纳米颗粒组合物包括对个体的治疗剂或预防剂。在一些实施方案中，治疗剂或预防剂被脂质纳米颗粒包封。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒载有一种或多种核酸。
代表性的核酸包括但不限于脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)RNA、DNA、单链RNA、单链DNA、双链RNA、双链DNA、三链DNA、siRNA、shRNA、sgRNA、mRNA、miRNA和反义DNA。
基于CRISPR(规律间隔性成簇短回文重复序列)的基因编辑需要两个组分：向导RNA和CRISPR相关的内切核酸酶蛋白(Cas)。向导RNA将Cas核酸酶引导至特定的靶DNA序列。然后Cas在该位点的DNA中产生双链断裂。在一个实施方案中，所公开的脂质纳米颗粒可用于携带基于CRISPR的基因编辑所需的组分。在一种脂质纳米颗粒中，核酸货物是向导RNA。在这样的实施方案中，第二脂质纳米颗粒可以含有编码RNA引导的内切核酸酶的核酸货物。两种脂质纳米颗粒可以一起施用。示例性的RNA引导的内切核酸酶包括但不限于Cas9、CasX、CasY、Cas13或Cpf1。
在一个实施方案中，货物是siRNA。短干扰RNA(siRNA)是可以诱导序列特异性转录后基因沉默，从而降低或甚至抑制基因表达的双链RNA。在一个实例中，siRNA触发在siRNA和靶RNA两者之间的序列一致性区域内的同源RNA分子如mRNA的特异性降解。例如，WO02/44321公开了当与3'突出端(overhanging end)碱基配对时能够序列特异性降解靶mRNA的siRNA，在此通过引用方式引入制备这些siRNA的方法。序列特异性基因沉默可以在哺乳动物细胞中使用模拟由酶dicer产生的siRNA的合成的、短的双链RNA来实现(Elbashir,etal.(2001)Nature,411:494 498)(Ui-Tei,et al.(2000)FEBS Lett 479:79-82。
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒含有少于1.0mg/kg的抑制性核酸。纳米颗粒可以含有1.0、0.9、0.8、0.7、0.6或0.5mg/kg抑制性核酸。在另一个实施方案中，脂质纳米颗粒含有0.5mg/kg抑制性核酸。这是优于现有技术的优点，在现有技术中，纳米颗粒需要高剂量的核酸(>1mg/kg)来实现基因沉默，其剂量对于人类递送是不批准的。所公开的技术可以在不包括靶向配体的脂质纳米颗粒中使用0.5mg/kg抑制性核酸实现基因沉默。
在一些实施方案中，核酸(包括但不限于寡核苷酸)被修饰或包括一个或多个修饰的核苷酸以增加稳定性、半衰期和核酸酶敏感性。为了限制核酸酶敏感性，天然的磷酸二酯寡脱氧核糖核苷酸、天然的磷酸二酯寡核糖核苷酸、核糖核苷酸聚合物和脱氧核糖核苷酸聚合物可以包括一种或多种不同的修饰。示例性的修饰包括但不限于硫代磷酸酯(PS)键、2”-O甲基(2’OMe)、2’-氟碱基、反向的dT和ddT、寡核苷酸的3'端的磷酸化、锁核酸、并包括亚磷酰胺C3间隔基。
硫代磷酸酯键用硫原子代替在寡核苷酸的磷酸酯骨架中的非桥接的氧。大约50％的时间(由于可形成的2种所得立体异构体)，PS修饰使核苷酸间键合更耐核酸酶降解。在一些实施方案中，核酸包括一个或多个PS键，例如在5'和3'寡核苷酸末端的至少3个PS键以抑制外切核酸酶降解。一些核酸包括遍及整个寡核苷酸的PS键以帮助减少内切核酸酶的攻击。
在tRNA和其它小RNA中发现了RNA,2’OMe的天然存在的转录后修饰。在一些实施方案中，直接合成核酸或寡核苷酸以含有2'OMe。这种修饰增加了RNA:RNA双链体的Tm，但仅导致RNA:DNA稳定性的小变化。它防止被单链内切核酸酶攻击，但不防止外切核酸酶消化。在一些实施方案中，这些核酸或寡核苷酸也被末端封闭。包括这种修饰的DNA寡核苷酸通常比未修饰的DNA少5至10倍的对DNases的易感性。2'OMe修饰通常用于反义寡核苷酸作为增加稳定性和与靶转录物的结合亲和力的手段。
2'-氟碱基具有氟修饰的核糖，其与天然RNA相比增加了结合亲和力(Tm)并且还赋予一些相对的核酸酶抗性。在一些实施方案中，核酸或寡核苷酸包括与PS-修饰的键结合的2'氟碱基。
可以在寡核苷酸的3'端掺入反向的dT，导致3’-3’连接，其将抑制3'外切核酸酶的降解和DNA聚合酶的延伸。此外，在寡核苷酸的5'端放置反向的2′,3′双脱氧-dT碱基(5'反向的ddT)防止假结扎，并可以防止一些形式的酶降解。
一些实施方案提供了包括亚磷酰胺C3间隔基的核酸或寡核苷酸。可以在内部引入亚磷酰胺C3间隔基，或者在寡聚物的任一端引入亚磷酰胺C3间隔基以引入用于连接荧光团或其它侧基的长的亲水性间隔臂。C3间隔基也可用于抑制3'外切核酸酶的降解。
在一些实施方案中，核酸或寡核苷酸包括锁核酸。锁核酸包括修饰的RNA核苷酸，其中核糖的2'-O和4'-C原子通过亚甲基桥连接。这种附加的桥限制了通常与环相关的柔性，基本上将结构锁定在刚性构象中。
可将LNA插入RNA和DNA寡核苷酸中。
可通过所公开的纳米颗粒递送的其它类型的货物包括但不限于化学治疗剂、细胞毒性剂、放射性离子、小分子、蛋白质、多核苷酸和核酸。
代表性的化学治疗剂包括但不限于安吖啶、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、克瑞他酶(crisantaspase)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素、柔红霉素、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、亚叶酸、多柔比星脂质体、道诺霉素脂质体、洛莫司汀、美法仑、巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、喷司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、赛特铂、链脲佐菌素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、替尼泊苷、噻替派、硫鸟嘌呤、拓扑替康、曲奥舒凡、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨或它们的组合。代表性的促细胞凋亡剂包括但不限于氟达拉滨、taurosporine、放线菌酮、放线菌素D、乳糖神经酰胺、15d-PGJ(2)及它们的组合。
F.示例性脂质纳米颗粒制剂
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒制剂包含约30mol％至约70mol％构象上限制性可电离脂质、约5mol％至约25mol％磷脂、约25mol％至约45mol％胆固醇和约0mol％至约5mol％PEG-脂质。在另一个实施方案中，脂质纳米颗粒制剂包含约35mol％构象上限制性可电离脂质、约16mol％磷脂、约46.5mol％胆固醇和约2.5mol％PEG-脂质。在另一个实施方案中，脂质纳米颗粒制剂包含约50mol％构象上限制性可电离脂质、约10mol％磷脂、约38.5mol％胆固醇和约1.5mol％PEG-脂质。
一个实施方案提供了脂质纳米颗粒制剂，其包含约33mol％至约36mol％的具有金刚烷尾部的构象上限制性可电离脂质、约15mol％至约17mol％的1-2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、约2mol％至约3mol％的C14PEG2000和约45mol％至约47mol％的胆固醇，基于这四种成分的总摩尔数。
另一个实施方案提供了脂质纳米颗粒制剂，其包含35mol％的具有金刚烷尾部的构象上限制性可电离脂质、16mol％的1-2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱和2.5mol％的C14PEG2000、46mol％的胆固醇，基于这四种成分的总摩尔数。
另一个实施方案提供了脂质纳米颗粒制剂，其中(可电离脂质、胆固醇、脂质-PEG和磷脂)：siRNA的质量比为约2:1至20:1。
在另一个实施方案中，脂质纳米颗粒制剂包括3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯、DSPC、聚乙二醇-脂质、胆固醇和抑制性核酸。
一个实施方案提供了脂质纳米颗粒组合物，其包含3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯、DSPC、聚乙二醇-脂质、胆固醇和对基因特异的sgRNA。另一个实施方案提供了脂质纳米颗粒，其包含3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯、DSPC、聚乙二醇-脂质、胆固醇和编码RNA引导的DNA内切核酸酶的mRNA。
G.药物组合物
提供了包含所公开的脂质纳米颗粒的药物组合物。脂质纳米颗粒组合物可以全部地或部分地配制为药物组合物。药物组合物可以包括一种或多种纳米颗粒组合物。例如，药物组合物可以包括一种或多种纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物包括一种或多种不同的治疗剂和/或预防剂，所述治疗剂和/或预防剂包括但不限于一种或多种不同类型的核酸或编码不同药剂的核酸。在一些实施方案中，药物组合物包括一种或多种药学上可接受的赋形剂或辅助成分，包括但不限于药学上可接受的载体。
含有纳米颗粒的药物组合物可以被配制成通过肠胃外的(肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、经皮的(被动的或使用离子电渗或电穿孔)或经粘膜的(鼻、阴道、直肠或舌下)给药途径施用，或使用生物溶蚀性插入物施用，并且可以配制成适于每种给药途径的剂型。
在一些体内方法中，本文公开的纳米颗粒组合物以治疗有效量施用于个体。本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或缓解所治疗的病症的一种或多种症状或以其它方式提供所需的药理学和/或生理学作用的剂量。精确剂量将根据多种因素而变化，例如个体依赖性变量(例如，年龄、免疫系统健康等)、疾病和进行的治疗。
对于所公开的纳米颗粒，如进行进一步的研究时，将出现关于在各种患者中治疗各种病况的适当剂量水平的信息，并且普通技术人员，考虑接受者的治疗背景、年龄和一般健康状况，将能够确定适当的剂量。所选择的剂量取决于所需的治疗效果，给药途径和所需的治疗持续时间。对于所公开的纳米颗粒，通常每日以0.001mg核酸/kg体重至5mg核酸/kg体重的剂量水平施用于哺乳动物。更具体地，所公开的纳米颗粒的优选剂量为0.01mg/kg至0.25mg/kg。对于所公开的纳米颗粒，通常以0.2mg至100mg的四种组分(可电离脂质、胆固醇、PEG-脂质和磷脂)/kg体重的剂量水平施用于哺乳动物。更具体地，所公开的纳米颗粒的优选剂量是0.05mg/kg至0.5mg/kg的四种组分/kg体重。
在某些实施方案中，脂质纳米颗粒组合物例如通过直接注射到待治疗的部位而局部施用。通常，注射引起脂质纳米颗粒组合物的增加的局部浓度，其大于通过全身给药可以实现的浓度。脂质纳米颗粒组合物可以与如上所述的基质组合以通过减少多肽被动扩散到待治疗的部位外来帮助产生多肽组合物的增加的局部浓度。
1.用于肠胃外施用的制剂
在一些实施方案中，本文公开的纳米颗粒组合物，包括含有脂质纳米颗粒的那些组合物，在水溶液中通过肠胃外注射施用。制剂也可以是悬浮液或乳液的形式。通常，提供了包含有效量的脂质纳米颗粒的药物组合物，并且其任选地包含药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。这样的组合物任选地包括一种或多种以下物质：稀释剂、无菌水、具有各种缓冲内容物、pH和离子强度的缓冲盐水(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)；和添加剂，例如洗涤剂和增溶剂(例如，TWEEN 20(聚山梨醇酯-20)、TWEEN 80(聚山梨醇酯-80))、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)和防腐剂(例如，硫柳汞、苄醇)和填充物质(例如，乳糖、甘露糖醇)。非水溶剂或媒介物的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油和玉米油)、明胶和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。制剂可以是冻干的并在使用前立即再溶解/再悬浮。制剂可以通过例如通过细菌截留过滤器过滤、通过向组合物中加入杀菌剂、通过照射组合物、或通过加热组合物来灭菌。
2.受控递送聚合物基质
本文公开的脂质纳米颗粒也可以以控释制剂的形式给药。可以在植入聚合物装置(棒、圆柱体、膜、盘)或注射(微粒)后，制备用于长期全身释放的控制释放聚合物装置。基质可以是微粒如微球的形式，其中药剂分散在固体聚合物基质或微囊中，其中核是与聚合物壳不同的材料，并且肽分散或悬浮在核中，其在性质上可以是液体或固体。除非本文特别定义，否则微粒、微球和微囊可互换使用。或者，可以将聚合物浇铸成纳米至4厘米的薄块或薄膜，通过研磨或其它标准技术生产的粉末，或甚至凝胶如水凝胶。
不可生物降解的或可生物降解的基质可用于递送脂质纳米颗粒，尽管在一些实施方案中可生物降解的基质是优选的。这些可以是天然的或合成的聚合物，尽管由于降解和释放曲线的更好表征，合成聚合物在一些实施方案中是优选的。基于期望释放的时间段选择聚合物。在一些情况下，线性释放可能是最有用的，尽管在其它情况下脉冲释放或“大量释放”可提供更有效的结果。聚合物可以是水凝胶的形式(通常吸收至多约90重量％的水)，并且可以任选地与多价离子或聚合物交联。
基质可以通过溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂萃取和本领域技术人员已知的其它方法形成。生物溶蚀性微球可以使用为制备用于药物递送的微球而开发的任何方法来制备，例如，如Mathiowitz and Langer,J.Controlled Release,5:13-22(1987)；Mathiowitz,etal.,Reactive Polymers,6:275-283(1987)；和Mathiowitz,et al.,J.Appl.PolymerSci.,35:755-774(1988)中所述。
所述装置可配制用于局部释放以治疗植入或注射区域，其通常递送的剂量远小于用于整个身体的治疗的剂量-或全身递送。这些可以植入或皮下注射入肌肉、脂肪或被吞咽。
III.制造脂质纳米颗粒的方法
制备脂质纳米颗粒的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，使用微流控术制造所公开的脂质纳米颗粒。对于使用微流控术形成脂质纳米颗粒的示例性方法，参见Leung,A.K.K,et al.,J Phys Chem,116:18440-18450(2012),Chen,D.,et al.,J Am ChemSoc,134:6947-6951(2012),and Belliveau,N.M.,et al.,Molecular Therapy-NucleicAcids,1:e37(2012)。简而言之，在一种缓冲液中制备货物，例如寡核苷酸或siRNA。在另一种缓冲液中制备其它脂质纳米颗粒组分(可电离脂质、PEG-脂质、胆固醇和DSPC)。注射泵将这两种溶液引入到微流体装置中。两种溶液在微流体装置内接触以形成包封货物的脂质纳米颗粒。
在国际专利申请第PCT/US/2018/058171号中公开了筛选所公开的脂质纳米颗粒的方法，其通过引用的方式以其整体并入本文中。筛选方法表征媒介物递送制剂以鉴定具有所需向性的并将功能性货物递送至特定细胞的细胞质的制剂。筛选方法使用具有在被递送至细胞时可被检测到的功能的报道分子(reporter)。检测细胞中报道分子的功能表明递送媒介物的制剂将向细胞递送功能性货物。在每种不同的递送媒介物制剂中包括化学组成标识符，以跟踪对于每种不同的递送媒介物制剂特异的化学组成。在一个实施方案中，化学组成标识符是核酸条形码。核酸条形码的序列与用于配制装载核酸条形码于其中的递送媒介物的化学组分配对，从而当核酸条形码被测序时，递送条形码的递送媒介物的化学组成被鉴定。代表性的报道分子包括但不限于siRNA、mRNA、核酸酶蛋白、核酸酶mRNA、小分子、表观遗传修饰剂和表型修饰剂。
IV.使用方法
本文公开了使用所公开的脂质纳米颗粒将货物(例如核酸)递送至特定细胞或器官的方法。在一些实施方案中，在不存在靶向配体的情况下纳米颗粒将治疗剂或预防剂递送至有需要的个体的特定细胞或器官。在另一个实施方案中，所公开的脂质纳米颗粒可用于治疗或预防有需要的个体的疾病。
在一些实施方案中，所公开的纳米颗粒被直接递送至个体。在其它实施方案中，脂质纳米颗粒与细胞离体接触，并且将经处理的细胞施用于个体。细胞可以是自体细胞，例如免疫细胞，包括但不限于T细胞或分化成T细胞的细胞。在一些实施方案中，所公开的脂质纳米颗粒可用作过继细胞转移的媒介物。
A.递送货物至细胞的方法
本文提供了将治疗性和/或预防性核酸递送至有需要的个体的方法。
在一些实施方案中，所公开的脂质纳米颗粒组合物靶向特定类型或类别的细胞(例如，特定器官或其系统的细胞)。例如，可以将包含感兴趣的治疗剂和/或预防剂的纳米颗粒组合物特异性递送至个体的免疫细胞。示例性的免疫细胞包括但不限于CD8+、CD4+或CD8+CD4+细胞。在其它实施方案中，脂质纳米颗粒可以被配制成在不存在靶向配体的情况下被递送至哺乳动物的肝免疫细胞、脾T细胞或肺内皮细胞。向特定类别或特定类型的细胞的特异性递送表明较高比例的脂质纳米颗粒被递送至目标类型或目标类别的细胞。在一些实施方案中，特异性递送可导致相对于每1g目标目的地的组织，治疗剂和/或预防剂的量增加超过2倍、5倍、10倍、15倍或20倍。
B.基因调控方法
本文提供了使用所公开的脂质纳米颗粒进行基因调控的方法。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒可用于降低有需要的个体的靶细胞中的基因表达。在这样的实施方案中，向个体施用由3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯、DSPC、聚乙二醇-脂质、胆固醇和抑制性核酸组成的脂质纳米颗粒组合物。脂质纳米颗粒可以在没有靶向配体的情况下将抑制性核酸递送至个体的靶细胞。抑制性核酸可以是siRNA。
另一个实施方案提供了使用所公开的脂质纳米颗粒在有需要的个体的细胞中编辑基因的方法。在这样的实施方案中，向个体施用两种脂质纳米颗粒群。第一群包括具有包含金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯、DSPC、聚乙二醇-脂质、胆固醇和对所靶向的基因特异的sgRNA的制剂的脂质纳米颗粒。第二脂质纳米颗粒群包括具有包含金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯、DSPC、聚乙二醇-脂质、胆固醇和编码RNA引导的DNA内切核酸酶的mRNA的制剂的脂质纳米颗粒。RNA引导的DNA内切核酸酶可以是Cas9、CasX、CasY、Cas13或Cpf1。
在一个实施方案中，被靶向用于基因调控的细胞是免疫细胞。免疫细胞可以是T细胞，例如CD8+T细胞，CD4+T细胞，或T调节细胞。用于基因编辑的其它示例性免疫细胞包括但不限于巨噬细胞、树突细胞或肝免疫细胞。
可以靶向的示例性基因包括但不限于T细胞受体、B细胞受体、CTLA4、PD1、FOXO1、FOXO3、AKTs、CCR5、CXCR4、LAG3、TIM3、杀伤免疫球蛋白样受体、GITR、BTLA、LFA-4、T4、LFA-1、Bp35、CD27L受体、TNFRSF8、TNFRSF5、CD47、CD52、ICAM-1、LFA-3、L-选择素、Ki-24、MB1、B7、B70、M-CSFR、TNFR-II、IL-7R、OX-40、CD137、CD137L、CD30L、CD40L、FasL、TRAIL、CD257、LIGHT、TRAIL-R1、TRAILR2、TRAIL-R4、TWEAK-R、TNFR、BCMA、B7DC、BTLA、B7-H1、B7-H2、B7-H3、ICOS、VEGFR2、NKG2D、JAG1、GITR、CD4、CCR5、GATA-3、MTORC1、MTORC2、RAPTOR、GATOR、FOXP3、NFAT、IL2R和IL7。
可被T细胞识别并预期用于靶向的示例性肿瘤相关抗原包括但不限于MAGE1、MAGE3、MAGE6、BAGE、GAGE、NYESO-1、MART1/Melan A、MC1R、GP100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、PSA、CEA、Cyp-B、Her2/Neu、hTERT、MUC1、PRAME、WT1、RAS、CDK-4、MUM-1、KRAS、MSLN和β-联蛋白。
C.待治疗的个体
在一些实施方案中，所治疗的个体是经历癌症、自身免疫病、感染性疾病、器官移植、器官衰竭或它们的组合的哺乳动物。在一些实施方案中，本文所述的方法可引起T细胞呈递用于治疗癌症或自身免疫病的特异性抗原。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于T细胞引发。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于递送引起T细胞呈递MHC-肽复合物的DNA或mRNA。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于将DNA、siRNA或mRNA中的一种或多种递送至T细胞以避免无反应。
实施例
实施例1.限制性脂质的制备
Figure BDA0003557997900000461
在氮气气氛下，在25℃下向亚油酸1(4.0g,14.2mmol)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(0.4g,2.9mmol)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(3.7mL,20.5mmol)和2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇(1.5g,14.2mmol)的无水CH2Cl2(40mL)溶液中加入N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(4.1g,20.5mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，通过TLC监测，亚油酸1完全消耗。然后将反应混合物在减压下直接浓缩。经由硅胶快速柱色谱法(梯度洗脱：1-30％的EtOAc/己烷)纯化粗残余物，得到呈无色油状的化合物2(2.3g,44％产率)和化合物3(1.7g,30％产率)。
在氮气气氛下，向化合物2(150mg,0.41mmol)、DMAP(10mg,0.1mmol)、DIPEA(0.1mL,0.6mmol)和金刚烷(79mg,0.41mmol)的无水CH2Cl2(2mL)溶液中加入EDCI(114mg,0.6mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，通过TLC监测化合物2完全消耗。然后将反应混合物在减压下直接浓缩。经由硅胶快速柱色谱法(梯度洗脱：0-20％EtOAc/己烷)纯化粗残余物，得到呈无色油状的化合物4(103mg,53％产率)。
在氮气气氛下，向化合物4(76mg,0.16mmol)和DMAP(45mg,0.37mmol)的无水CH2Cl2(2mL)溶液中加入氯甲酸4-硝基苯酯(65mg,0.32mmol)。在室温下搅拌1小时后，将3-二乙基氨基-1-丙醇(0.44mL,0.96mmol)加入到反应混合物中，然后在室温下搅拌1小时。将反应混合物在减压下直接浓缩。经由硅胶快速柱色谱法(梯度洗脱：0-4％的MeOH/DCM)纯化粗残余物，得到呈无色油状的化合物1-1(32mg,29％产率)。HRMS(ESI,m/z)对于C42H72NO7[M+H]+计算值：702.5303，实测值702.5277。
通过与本实施例中描述的步骤类似的方法制备其它脂质。
实施例2.含有构象上限制性脂质的脂质纳米颗粒可以形成稳定的LNP.
材料和方法：
纳米颗粒制剂.使用如前所述的微流体装置配制纳米颗粒。简而言之，将核酸(siRNA和DNA条形码)在柠檬酸盐缓冲液中稀释，而脂质-胺化合物、烷基尾部的PEG、胆固醇和DSPC在乙醇中稀释。PEG、胆固醇和DSPC购自Avanti Lipids。柠檬酸盐相和乙醇相通过注射泵在微流体装置中合并。
纳米颗粒表征.使用读板器格式化的动态光散射机(Wyatt)测量LNP流体动力学直径。将LNP在无菌的1X PBS中稀释至～0.06μg/mL的浓度并分析。仅在如果LNP形成直径为20nm至200nm的单分散群体的情况下才包括LNP。用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS,Invitrogen)透析符合这些标准的颗粒，并用0.22μm过滤器无菌过滤。
结果：
合成了13种含有胺的化学上不同的脂质。构建文库以研究(i)胺和(ii)脂质尾部的结构是否影响递送。纯化含有不饱和脂质亚油酸酯和两个酯键的“支架”脂质(图1A)。这种支架没有任何胺。将胺变体连接到反应位点，以产生化学多样性(图1A)。在反应位点1，具有不同结构的3个脂质尾部(图1B)通过酯化加入。对照尾部L是亚油酸酯，其产生具有两个相同脂质尾部的构建体。脂质S含有两个脂质尾部，使得尾部的总数达到3。最后，尾部A含有金刚烷，一种具有确定的“扶手椅”结构的限制性脂质。在反应位点2，通过酯化加入11种含胺的头基，得到分别通过酯键或碳酸酯键连接的头基。基于先前的报道选择头基，所述报道是具有类似结构的小分子具有生物活性。合成后，使用高分辨率质谱或1H-NMR确认所有13种脂质的化学结构。为清楚起见，每种可电离脂质用命名法,头基号-尾部字母(例如1-L、11-A)命名。
研究13种可电离脂质形成稳定的LNP的能力(图1A-C)。测量携带化学修饰的靶向GFP的siRNA(siGFP)(Paunovska,et al.,ACS Nano,12:8341-8349(2018))以及DNA条形码(Sago et al.,Nano Lett,(2018))的LNP的流体力学直径。使用微流控术配制LNP(Chen,D.,et al.,J Am Chem Soc,134:6948-6951(2012))。添加先前验证的化合物以降低结果受添加至LNP的其它成分影响的机会。先前验证的化合物是C14PEG2000、未修饰的胆固醇以及1-2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)或1-2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)(图1D)。作为对照以确保结果不受4种组分的摩尔比的影响，每种脂质用2种磷脂和4种摩尔比配制，共计104种LNP(图1D)。值得注意的是，100种LNP形成小的单分散群体，这通过流体力学直径和多分散性指数来证明。各LNP的直径在30nm和170nm之间变化，平均为76nm(图1E)以及平均PDI为0.15(图1F)。作为可电离脂质(图1G)、四种成分的摩尔比(图1H)和添加到制剂中的磷脂类型(DSPC/DOPE)(图1I)的函数来分析流体力学直径。在所有情况下，平均直径在50nm和100nm之间变化。这些数据表明，非传统的脂质形成其流体力学直径类似于脂蛋白和天然病毒的LNP。
实施例3.用于体内活性的高通量siRNA筛选揭示具有限制性脂质的LNP在T细胞中具有生物活性
材料和方法：
DNA条形编码.配制每种化学上不同的LNP以携带其自身独特的DNA条形码和siRNA。例如，LNP1携带DNA条形码1和siICAM2，而化学上不同的LNP2携带DNA条形码2和siGFP。单链DNA序列购自Integrated DNA Technologies(IDT)。为了确保每个序列的相等扩增，我们包括通用的正向引物区域和反向引物区域。使用独特的8个核苷酸序列区分每个条形码。8个核苷酸序列可产生65,536个不同的条形码。使用在Illumina MiniSeq测序机上156个不同的被设计用于防止序列“漂白”的序列。
动物实验.根据Georgia Institute of Technology(佐治亚理工学院)的IACUC进行所有动物实验。C57BL/6J(#000664)、GFP(#003291)和组成型SpCas9(#026179)小鼠购自The Jackson Laboratory，并在5-12周龄之间使用。在所有实验中，使用N＝3-5只小鼠/组。小鼠经侧尾静脉被静脉内注射。使用NanoDrop(Thermo Scientific)测定纳米颗粒浓度。
细胞分离和染色.除非另有说明，在注射LNP后72小时分离细胞(用于筛选)或在注射LNP后120小时分离细胞(用于体内基因编辑)。通过右心房向小鼠灌注20mL的1X PBS。如前所述(Dahlman,et al.,Nat Nano,9:648-655(2014)；Paunovska,K.,et al.,Nano Lett,18:2148-2157(2018))，切割组织，并在37℃下将其置于具有I型胶原酶(Sigma Aldrich)、胶原酶XI(Sigma Aldrich)和透明质酸酶(Sigma Aldrich)的消化酶溶液中45分钟。用于心脏的消化酶包括胶原酶IX。将细胞悬浮液通过70μm网筛过滤并裂解红细胞。将细胞染色以鉴定群体，并使用the Georgia Institute of Technology Cellular Analysis Core中的BD FacsFusion进行分选，用于体内实验。使用的抗体克隆是：抗-CD31(390、BioLegend)、抗-CD45.2(104、BioLegend)、抗-CD19(6D5、Biolegend)、抗-CD3(17A2、Biolegend)、抗-CD8a(53-6.7、Biolegend)和抗-CD4(GK1.5、Biolegend)。
用于Illumina测序的PCR扩增.将所有样品扩增并使用巢式PCR进行制备用于测序。将2μL引物加入到5μL的Kapa HiFi2X反应混合物(master mix)中，并加入3μL模板DNA/水。第二次PCR，添加Nextera XT chemistry，索引和i5/i7适配子(adapter)区域。在2％琼脂糖凝胶上运行双-索引的样品以确保在汇集和凝胶纯化之前发生PCR反应。
深度测序.在Georgia Institute of Technology’s Molecular Evolution core中进行Illumina测序。在Illumina Miniseq上实施运行。基于Nextera XT适配子序列设计引物。
条形码测序归一化.将每种细胞类型的每种颗粒的计数归一化为施用于细胞或注射到小鼠中的条形码LNP混合物。
TNS测定.如先前所述(Dahlman,J.E.,et al.,Nat Nano,9:648-655(2014))测量7C1和BM1的pKa。简而言之，制备10mM HEPES(Sigma)、10mM MES(Sigma)、10mM乙酸钠(Sigma)和140nM氯化钠(Sigma)的储备溶液，并用氯化氢和氢氧化钠将pH调节至pH 4-pH10。对于每种pH下的每种纳米颗粒使用4个重复，将140μL的pH调节的缓冲液添加到96孔板中，然后添加5μL的2-(对甲苯胺基)-6-萘磺酸(60μg/mL)。向每个孔中加入5μL的每个纳米颗粒。在温和振荡下孵育5分钟后，使用325nm的激发波长和435nm的发射波长测量荧光吸光度。
RNA干扰.在2'位化学修饰siRNA以增加稳定性和负免疫刺激。注射后72小时，分离组织并通过流式细胞术测定蛋白表达。PBS处理的小鼠中的GFP平均荧光强度被归一化为100％。
体内Cas9编辑.向组成性表达SpCas9的小鼠注射携带2mg/kg的sgGFP的cLNP。注射后5天，通过FACS分离细胞。通过TIDES测量得失位(indels)。
结果：
评价在体内siRNA向靶细胞(在这种情况下，T淋巴细胞)以及8种非靶细胞类型的LNP递送。使用经化学修饰以减少免疫刺激并通过优先的反义RISC加载增强中靶沉默的siGFP(图S2A)。研究1LNP/组，并使用5只小鼠/组，该筛选将需要>500只小鼠和显著的时间/流式细胞术资源。因此，开发了基于DNA条形码的筛选以评价在单个小鼠中在靶细胞的任何组合中超过100种LNP如何功能性递送siGFP(图2A)。配制具有化学结构1的LNP-1以携带siGFP和DNA条形码1。分别配制具有化学结构N的LNP-N以携带siGFP和DNA条形码N。还包括裸条形码作为实验对照(Paunovska,K.,et al.,Nano Lett,18:2148-2157(2018))，因为DNA不容易穿过细胞双层。将LNP汇集在一起，并静脉内注射到在CAG启动子下组成性表达GFP的小鼠中(图2B)。GFP用作功能性递送读数。据推测，将siGFP功能性递送到细胞质中的LNP将具有较低的GFP蛋白表达。因此，在注射小鼠后3天，使用荧光激活细胞分选法(FACS)分离GFP低细胞，并深度测序以定量所有的N种LNP将条形码递送到细胞中的效率。使用归一化的递送，即，通过该样品内的条形码计数的总数归一化的每个单独条形码的条形码的数目。归一化的递送可用于分析条形编码的LNP数据集并且类似于RNAseq实验中的每百万计数(Lokugamage,M.P.,et al.,Current Opinion in Biomedical Engineering,7:1-8(2018))。由于GFP在所有细胞类型中都表达，因此该测定可以(i)比较在中靶/脱靶细胞的任何组合中的GFP敲落，和(ii)快速鉴定共位于GFP低细胞中的LNP，所有都在单个动物中。
在将1.5mg/kg的总剂量注射到小鼠(100种不同的LNP，平均为0.015mg/kg/颗粒)后三天，在9种细胞类型中定量GFP沉默。与PBS处理的小鼠相比，存在增加数量的GFP低脾B细胞和脾T细胞(图2C)。通过平均荧光强度定量的平均GFP蛋白沉默在脾T细胞中最高，随后是肝免疫细胞、脾B细胞和肺内皮细胞(图2D)。令人惊讶的是，在肝细胞中没有发现沉默的证据，肝细胞是被大多数LNP优先靶向12-15的细胞类型(图2C,D)。为了检查该数据集的质量，对GFP低肺脾T细胞测序，作为进一步的检查，还对肺内皮细胞、脾B细胞和肝免疫细胞测序。在所有4种细胞类型中，两个阴性对照(裸条形码)的归一化递送低于由LNP递送的条形码，如所预期的(图2E)。
然后进行使用DNA测序数据的大规模体内结构功能分析，以评价任何纳米颗粒材料性质是否促进向脾T细胞的递送。计算了对于不同纳米颗粒性质的富集。富集是指具有特定性质的纳米颗粒分别偶然出现在(i)表现在前10％的颗粒中的几率，和(ii)表现在后10％的颗粒中的几率，并进行计算。用DSPC配制的纳米颗粒富集在有效颗粒中，而用DOPE配制的纳米颗粒富集在表现差的颗粒中(图2F)。为了证实这些结果，比较分别用DSPC和DOPE配制的所有LNP的归一化递送。包含DSPC的LNP优于包含DOPE的LNP(图2G)。最后，计算“配对的”LNP的归一化递送，即，具有相同摩尔比和可电离脂质(但不同磷脂)的LNP。鉴定了显著优于其配对的含有DOPE的LNP的特定DSPC LNP(图2H)。基于这些数据，推断LNP内所含的磷脂影响脾T细胞递送。已经观察到磷脂的影响，未来的化学分析限于含有DSPC的制剂。
对13种可电离脂质进行相同的富集分析，对脂质尾部和头基进行相同的富集分析。富集了3种可电离脂质(图2I)。为了阐明可电离脂质的头基是否影响富集，绘制了每个头基的富集与头基分子量、疏水性(LogP)和极性表面积的关系图(图4A-4C，表1)。在这些化学性状和富集之间没有观察到相关性。最富集的脂质11-A含有构象上限制性金刚烷尾部。将11-A的富集与11-L和11-S(两种脂质具有相同的头基(11)但不同的第二脂质尾部)进行比较。为了确定富集的差异是否是由于第二脂质尾部的结构转化，分析每种脂质的归一化DNA递送。11-A导致比11-L和11-S明显更多的递送(图2J)。使用具有相同摩尔比的化合物进行配对分析。含有金刚烷的尾部优于其它尾部结构(图4D)。将归一化的T细胞递送相对于LNP大小作图，并且没有发现关系(图4E)。总之，这些数据表明，对于流体力学直径为30nm至170nm的单分散LNP，LNP化学结构比尺寸更影响递送。
表1：具有不同头基的LNP的富集
Figure BDA0003557997900000531
实施例4.cLNP递送在CD8+T细胞中改变基因表达的小RNA
材料和方法：
参见上文的材料和方法部分。
结果：
与所有高通量筛选系统一样，siGFP/DNA条形码测定的值与其进行预测的能力有关。基于测序数据，选择纳米颗粒用于进一步研究(图3A-3B)。基于富集分析，该cLNP含有限制性脂质以及DSPC。在几个实验的过程中，用靶向萤光素酶(siLuc)的对照siRNA或siGFP配制LNP，并以0.5mg/kg至2.0mg/kg的剂量静脉内注射到小鼠中(图3C,D)。与从用PBS或siLuc处理的小鼠中分离的T细胞相比，从用siGFP处理的小鼠中分离的T细胞具有降低的GFP表达。值得注意的是，在低至0.5mg/kg的剂量下观察到强的蛋白质沉默(图3C,D)。在T细胞亚群(即CD4+和CD8+)中测量GFP蛋白表达，在CD8+T细胞中观察到更有效的蛋白沉默(图3E)。另外，在肝和脾中的6种非靶细胞类型中定量GFP沉默。在0.5mg/kg和1.5mg/kg的剂量下没有观察到显著的沉默(图S4A-F)，这表明这些cLNP优先沉默脾CD8+T细胞中的基因。
为了证实具有基因编辑有效载荷的新cLNP的效力，以2.0mg/kg的剂量将携带靶向GFP的sgRNA的先导cLNP注射到组成性表达Cas9和GFP的小鼠中(Platt,R.J.,et al.,Cell,159:440-445(2014))。5天后，测量在CD3+T细胞以及CD4+T细胞和CD8+T细胞中的GFP表达。与用siRNA观察到的CD8+向性相似，在CD8+中观察到比在CD4+T细胞中更有效的蛋白沉默(图3F)。另外，GFP表达的这种降低与GFP低CD8+T细胞的增加相结合(图3G)。总之，这些数据得出结论：没有靶向配体的cLNP可以以低于1mg/kg的剂量将siRNA递送至脾T细胞。在所有实验中，在siRNA和sgRNA的剂量下cLNP是良好耐受的，正如通过在施用后24小时没有观察到体重减轻所表明的。
众所周知难以设计靶向非肝细胞的细胞的纳米颗粒(Lorenzer,C.,et al.,JControl Release,203:1-15(2015))，大部分是因为没有高通量方法来研究纳米颗粒siRNA体内递送。纳米医学中的这个普遍问题减缓了所有RNA疗法的发展，因为科学家被迫进行高通量纳米颗粒体外测定，即使细胞培养不能概括所有的影响体内递送的因素(异源脉管系统(Augustin,H.G.,et al.,Science,357(2017)，复杂的微环境(MacParland,S.A.,etal.,ACS Nano,11:2428-2443(2017)，非靶细胞(Tavares,A.J.,et al.,PNAS,114:E10871-e10880(2017)，不同的血液流速(Tsoi,K.M.et al.,Nat Mater,15:1212-1221(2016))。值得注意的是，来自筛选的结果预期将发生优先的T细胞递送；用选自文库的LNP确认这些数据。这些数据提供了令人信服的证据，即，高通量体内siRNA筛选能快速鉴定具有新向性的纳米颗粒。
虽然在前面的说明书中，本发明已经关于其某些实施方案进行了描述，并且为了示例性说明的目的已经提出了许多细节，但是对于本领域的技术人员来说，显然，本发明是针对另外的实施方案，并且在不脱离本发明的基本原理的情况下，可以相当大地改变本文描述的某些细节。
本文引用的所有参考文献以它们的整体内容通过引用并入。在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本文所述主题可以以其它具体形式来实施，因此，应当参考所附权利要求书，而不是上述说明书，以指示本文所述主题的范围。
序列表
<110> 佐治亚技术研究公司(Georgia Tech Research Corporation)
<120> 包含限制性脂质的纳米材料及其用途
<130> GUIDE.005WO
<160> 1
<170> Patentin version 3.5
<210> 1
<211> 101
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 合成的; sgGFP
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<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基鸟苷
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<222> (2)..(2)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基鸟苷
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<222> (3)..(3)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基鸟苷
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<223> 具有硫代磷酸酯的腺苷
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<223> 具有硫代磷酸酯的2'-氟鸟苷
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<223> 具有硫代磷酸酯的2'-氟腺苷
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<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基腺苷
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<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基腺苷
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<223> 2'-O-甲基鸟苷
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<222> (82)..(82)
<223> 具有硫代磷酸酯的鸟苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> 2'-O-甲基胞苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基腺苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(85)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基胞苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (86)..(86)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基胞苷
<220>
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<222> (87)..(87)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基鸟苷
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<222> (88)..(88)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基腺苷
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<222> (89)..(89)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基鸟苷
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<222> (90)..(90)
<223> 具有硫代磷酸酯的'-O-甲基尿苷
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<222> (91)..(91)
<223> 2'-O-甲基胞苷
<220>
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<222> (92)..(92)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基鸟苷
<220>
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<222> (93)..(93)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基鸟苷
<220>
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<222> (94)..(94)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基尿苷
<220>
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<222> (95)..(95)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基鸟苷
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<222> (96)..(96)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基胞苷
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<222> (97)..(97)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基尿苷
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<222> (98)..(98)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基尿苷
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<222> (99)..(99)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基尿苷
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<222> (100)..(100)
<223> 具有硫代磷酸酯的2'-O-甲基尿苷
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<222> (101)..(101)
<223> 2'-O-甲基尿苷
<400> 1
nnncgnnnnn nunnucnncg nuuuuagnnn nnnnnnnnnn nnguunanan annnnnngun 60
nguuannaan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn n 101
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.脂质纳米颗粒组合物，其包含：
具有以下结构之一的构象上限制性可电离脂质：
Figure FDA0003557997980000011
磷脂；
聚乙二醇-脂质；
胆固醇；和任选的
核酸。
2.如权利要求1所述的脂质纳米颗粒组合物，其中存在的所述构象上限制性可电离脂质的量为基于总摩尔数的约35摩尔％至约65摩尔％。
3.如权利要求1或2所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述磷脂为1-2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述聚乙二醇-脂质为C14PEG2000或C18PEG2000。
5.如权利要求1和3-4中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述组合物包含约30mol％至约70mol％的构象上限制性可电离脂质、约5mol％至约25mol％的磷脂、约25mol％至约45mol％的胆固醇和约0.1mol％至约5mol％的聚乙二醇-脂质。
6.如权利要求1-5中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述核酸包括RNA、DNA、单链RNA、单链DNA、双链RNA、双链DNA、三链DNA、siRNA、shRNA、sgRNA、mRNA、miRNA、反义DNA或它们的组合。
7.如权利要求1-6中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述核酸编码蛋白质。
8.如权利要求1-7中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述核酸编码RNA引导的DNA内切核酸酶。
9.如权利要求8所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述RNA引导的DNA内切核酸酶是Cas9、CasX、CasY、Cas13或Cpf1。
10.如权利要求1-9中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述脂质纳米颗粒具有约30nm至约170nm的流体力学直径。
11.脂质纳米颗粒组合物，其包含：
包含金刚烷尾部的构象上限制性可电离脂质；
1-2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；
C14PEG2000；
胆固醇；和
siRNA。
12.如权利要求11所述的脂质纳米颗粒，其中所述构象上限制性可电离脂质是3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯。
13.如权利要求11或12所述的脂质纳米颗粒，其中C14PEG2000以约2.0摩尔％至约3.0摩尔％存在，DSPC以约15摩尔％至约17摩尔％存在，胆固醇以约45摩尔％至约47摩尔％存在，所述构象上限制性可电离脂质以约33摩尔％至约36摩尔％存在，并且所述siRNA以总脂质与siRNA的5至20的质量比存在。
14.如权利要求11-13中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中C14PEG2000以约2.5摩尔％存在，DSPC以约16摩尔％存在，胆固醇以约46.5摩尔％存在，并且所述构象上限制性可电离脂质以约35摩尔％存在。
15.药物组合物，其包含权利要求1-14中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物和药学上可接受的赋形剂。
16.将核酸递送至有需要的个体的方法，其包括向所述个体施用权利要求1-14中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物或权利要求15所述的药物组合物。
17.如权利要求16所述的方法，其还包括向所述个体施用第二治疗剂。
18.将核酸递送至有需要的个体的免疫细胞的方法，其包括：
向所述个体施用脂质纳米颗粒组合物，所述脂质纳米颗粒组合物由
3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯；
DSPC；
聚乙二醇-脂质；
胆固醇；和
核酸组成，
其中所述脂质纳米颗粒组合物将所述核酸递送至所述个体的免疫细胞。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒组合物不包含将所述脂质纳米颗粒组合物靶向所述免疫细胞的靶向配体。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述T细胞是T调节细胞。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述T细胞是CD4+。
24.如权利要求18或19所述的方法，其中所述免疫细胞是巨噬细胞、树突细胞或肝免疫细胞。
25.用于降低纳米颗粒组合物的脾或肝清除率的方法，其包括将所述纳米颗粒组合物与一定量的构象上限制性可电离脂质一起配制，所述构象上限制性可电离脂质在施用于个体时有效地降低或抑制所述纳米颗粒组合物的脾或肝清除率，其中所述构象上限制性可电离脂质具有以下结构之一：
Figure FDA0003557997980000051
26.用于增加纳米颗粒组合物向个体的非肝细胞的细胞的递送的方法，其包括将所述纳米颗粒组合物配制成包含一定量的构象上限制性可电离脂质，所述构象上限制性可电离脂质在施用于所述个体时有效地增加所述纳米颗粒组合物向非肝细胞的细胞的递送，其中所述构象上限制性可电离脂质具有以下结构之一：
Figure FDA0003557997980000052
27.如权利要求26所述的方法，其中所述纳米颗粒组合物是脂质纳米颗粒药物组合物。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒药物组合物包含磷脂、聚乙二醇-脂质、胆固醇和任选的第一核酸。
29.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述非肝细胞的细胞是脾B细胞、脾T细胞、肺内皮细胞和肝免疫细胞中的至少一种。
30.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒组合物还包含第二核酸，其以约0.5mg/kg至约2.0mg/kg的量递送至所述个体。
31.如权利要求30所述的方法，其中递送至所述个体的所述第二核酸的量小于约1.0mg/kg。
32.用于在有需要的个体中降低免疫细胞中的基因表达的方法，其包括：
向所述个体施用脂质纳米颗粒组合物，所述脂质纳米颗粒组合物由
3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯；
DSPC；
聚乙二醇-脂质；
胆固醇；和
抑制性核酸组成，
其中所述脂质纳米颗粒组合物将所述抑制性核酸递送至所述个体的所述免疫细胞。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述抑制性核酸是siRNA。
34.如权利要求32或33所述的方法，其中对所述个体施用的所述抑制性核酸的量小于约1.0mg/kg。
35.如权利要求34所述的方法，其中对所述个体施用的所述抑制性核酸的量为约0.5mg/kg。
36.用于在有需要的个体中编辑免疫细胞中的基因的方法，其包括：
向所述个体施用包含第一脂质纳米颗粒群和第二脂质纳米颗粒群的脂质纳米颗粒组合物，
其中所述第一脂质纳米颗粒群由3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯、DSPC、聚乙二醇-脂质、胆固醇和对所述基因特异的sgRNA组成，以及
其中所述第二脂质纳米颗粒群由3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯、DSPC、聚乙二醇-脂质、胆固醇和编码RNA引导的DNA内切核酸酶的mRNA组成。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述RNA引导的DNA内切核酸酶选自Cas9、CasX、CasY、Cas13和Cpf1。
38.如权利要求36或37所述的方法，其中施用于所述个体的sgRNA和mRNA中的一种或两种的量小于约1.0mg/kg。
39.如权利要求38所述的方法，其中施用于所述个体的sgRNA和mRNA中的一种或两种的量为约0.5mg/kg。

Claims (47)

1.式(I)化合物：
Figure FDA0003557997890000011
其中：R1为：
Figure FDA0003557997890000012
R2为：
Figure FDA0003557997890000013
其中X为
Figure FDA0003557997890000021
以及
R3和R4各自独立地为
Figure FDA0003557997890000022
Figure FDA0003557997890000023
2.式(III)化合物：
Figure FDA0003557997890000024
其中
R8为–H或
Figure FDA0003557997890000025
R5、R6、R7和R9各自独立地为：-C8H17、-C10H21、-C12H25、-C13H27、-C14H29、C16H33或金刚烷基、
m和n各自独立地为0、1、2、3或4；
A为
Figure FDA0003557997890000026
Figure FDA0003557997890000027
-S-、
Figure FDA0003557997890000028
Figure FDA0003557997890000029
R10和R11各自独立地为–H或
Figure FDA0003557997890000031
以及
R12为-C10H21。
3.如权利要求1所述的化合物，其中R2为
Figure FDA0003557997890000032
Figure FDA0003557997890000033
4.脂质纳米颗粒组合物，其包含：
构象上限制性可电离脂质；
磷脂；
聚乙二醇-脂质；
胆固醇；和任选的
核酸。
5.如权利要求4所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述构象上限制性可电离脂质包含权利要求1或2所述的结构。
6.如权利要求4或5所述的脂质纳米颗粒组合物，其中存在的所述构象上限制性可电离脂质的量为基于总摩尔数的约35摩尔％至约65摩尔％。
7.如权利要求4-6中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述构象上限制性可电离脂质具有根据以下的结构
Figure FDA0003557997890000034
8.如权利要求4-6中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述构象上限制性可电离脂质具有根据以下的结构：
Figure FDA0003557997890000041
9.如权利要求4-8中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述磷脂为1-2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。
10.如权利要求4-9中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述聚乙二醇-脂质为C14PEG2000或C18PEG2000。
11.如权利要求4、5或7-10中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述组合物包含约30mol％至约70mol％的构象上限制性可电离脂质、约5mol％至约25mol％的磷脂、约25mol％至约45mol％的胆固醇和约0.1mol％至约5mol％的聚乙二醇-脂质。
12.如权利要求4-11中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述核酸包括RNA、DNA、单链RNA、单链DNA、双链RNA、双链DNA、三链DNA、siRNA、shRNA、sgRNA、mRNA、miRNA、反义DNA或它们的组合。
13.如权利要求4-12中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述核酸编码蛋白质。
14.如权利要求4-13中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述核酸编码RNA引导的DNA内切核酸酶。
15.如权利要求14所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述RNA引导的DNA内切核酸酶是Cas9、CasX、CasY、Cas13或Cpf1。
16.如权利要求4-12中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述脂质纳米颗粒具有约30nm至约170nm的流体力学直径。
17.脂质纳米颗粒组合物，其包含：
包含金刚烷尾部的构象上限制性可电离脂质；
1-2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；
C14PEG2000；
胆固醇；和
siRNA。
18.如权利要求17所述的脂质纳米颗粒，其中所述构象上限制性可电离脂质是3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯。
19.如权利要求17或18所述的脂质纳米颗粒，其中C14PEG2000以约2.0摩尔％至约3.0摩尔％存在，DSPC以约15摩尔％至约17摩尔％存在，胆固醇以约45摩尔％至约47摩尔％存在，所述构象上限制性可电离脂质以约33摩尔％至约36摩尔％存在，并且所述siRNA以总脂质与siRNA的5至20的质量比存在。
20.如权利要求17-19中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中C14PEG2000以约2.5摩尔％存在，DSPC以约16摩尔％存在，胆固醇以约46.5摩尔％存在，并且所述构象上限制性可电离脂质以约35摩尔％存在。
21.药物组合物，其包含权利要求4-20中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物和药学上可接受的赋形剂。
22.将核酸递送至有需要的个体的方法，其包括向所述个体施用权利要求4-20中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物或如权利要求21所述的药物组合物。
23.如权利要求22所述的方法，其还包括向所述个体施用第二治疗剂。
24.将核酸递送至有需要的个体的免疫细胞的方法，其包括：
向所述个体施用脂质纳米颗粒组合物，所述脂质纳米颗粒组合物由
3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯；
DSPC；
聚乙二醇-脂质；
胆固醇；和
核酸组成，
其中所述脂质纳米颗粒组合物将所述核酸递送至所述个体的免疫细胞。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒组合物不包含将所述脂质纳米颗粒组合物靶向所述免疫细胞的靶向配体。
26.如权利要求24或25所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述T细胞是T调节细胞。
29.如权利要求26所述的方法，其中所述T细胞是CD4+。
30.如权利要求24或25所述的方法，其中所述免疫细胞是巨噬细胞、树突细胞或肝免疫细胞。
31.用于降低纳米颗粒组合物的脾或肝清除率的方法，其包括将所述纳米颗粒组合物与一定量的构象上限制性可电离脂质一起配制，所述构象上限制性可电离脂质在施用于个体时有效地降低或抑制所述纳米颗粒组合物的脾或肝清除率。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述构象上限制性可电离脂质包括权利要求1或2所述的结构。
33.用于增加纳米颗粒组合物向个体的非肝细胞的细胞的递送的方法，其包括将所述纳米颗粒组合物配制成包含一定量的构象上限制性可电离脂质，所述构象上限制性可电离脂质在施用于所述个体时有效地增加所述纳米颗粒组合物向非肝细胞的细胞的递送。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述构象上限制性可电离脂质包括权利要求1或2所述的结构。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中所述纳米颗粒组合物是脂质纳米颗粒药物组合物。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒药物组合物包含磷脂、聚乙二醇-脂质、胆固醇和任选的第一核酸。
37.如权利要求33-36中任一项所述的方法，其中所述非肝细胞的细胞是脾B细胞、脾T细胞、肺内皮细胞和肝免疫细胞中的至少一种。
38.如权利要求33-37中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒组合物还包含第二核酸，其以约0.5mg/kg至约2.0mg/kg的量递送至所述个体。
39.如权利要求38所述的方法，其中递送至所述个体的所述第二核酸的量小于约1.0mg/kg。
40.用于在有需要的个体中降低免疫细胞中的基因表达的方法，其包括：
向所述个体施用脂质纳米颗粒组合物，所述脂质纳米颗粒组合物由
3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯；
DSPC；
聚乙二醇-脂质；
胆固醇；和
抑制性核酸组成，
其中所述脂质纳米颗粒组合物将所述抑制性核酸递送至所述个体的所述免疫细胞。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述抑制性核酸是siRNA。
42.如权利要求40或41所述的方法，其中对所述个体施用的所述抑制性核酸的量小于约1.0mg/kg。
43.如权利要求42所述的方法，其中对所述个体施用的所述抑制性核酸的量为约0.5mg/kg。
44.用于在有需要的个体中编辑免疫细胞中的基因的方法，其包括：
向所述个体施用包含第一脂质纳米颗粒群和第二脂质纳米颗粒群的脂质纳米颗粒组合物，
其中所述第一脂质纳米颗粒群由3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯、DSPC、聚乙二醇-脂质、胆固醇和对所述基因特异的sgRNA组成，以及
其中所述第二脂质纳米颗粒群由3-[(1-金刚烷基)乙酰氧基]-2-{[3-(二乙基氨基)丙氧基羰基氧基]甲基}丙基(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯酸酯、DSPC、聚乙二醇-脂质、胆固醇和编码RNA引导的DNA内切核酸酶的mRNA组成。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述RNA引导的DNA内切核酸酶选自Cas9、CasX、CasY、Cas13和Cpf1。
46.如权利要求44或45所述的方法，其中施用于所述个体的sgRNA和mRNA中的一种或两种的量小于约1.0mg/kg。
47.如权利要求46所述的方法，其中施用于所述个体的sgRNA和mRNA中的一种或两种的量为约0.5mg/kg。
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