PL233741B1 - Kompozycja lipidowa sluzaca do wytworzenia kierowanego za pomoca przeciwcial liposomowego nosnika lekow genetycznych oraz jej zastosowanie - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja lipidowa służąca do wytworzenia kierowanego za pomocą przeciwciał liposomowego nośnika leków genetycznych w postaci asODN, siRNA, miRNA, rybozymowego RNA oraz DNazymu, charakteryzująca się tym, że zawiera od 35,2% do 45,7% wagowych fosfatydylocholiny (PC), od 12,3% do 19,1% wagowych dioleilofosfatydyloetanolaminy (DOPE), od 4,9% do 6,4% wagowych 3ß-N-dimetyloetanokarbamoilocholesterolu (DC-CHOL), od 10,7% do 16,6% wagowych DSPE-PEG, od 4,6% do 6,2% wagowych maleimidowej pochodnej DSPE-PEG (DSPE-PEG-Mal) oraz od 10,6% do 25,7% wagowych soli trimetyloaminowej 1,2-dioleilopropanu (DOTAP) oraz jej zastosowanie.

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja lipidowa służąca do wytworzenia kierowanego za pomocą przeciwciał liposomowego nośnika leków genetycznych mająca zastosowanie w szczególności w leczeniu przewlekłej białaczki limfocytowej. Prace badawcze były wykonywane na Uniwersytecie Wrocławskim na Wydziale Biotechnologii w Zakładzie Cytobiochemii oraz na Uniwersytecie Medycznym we Wrocławiu w Klinice Hematologii i Chorób Rozrostowych Krwi.

Białaczki obejmują ogromną heterologiczną grupę chorób o podłożu hematologicznym. Pluripotencjalne komórki macierzyste szpiku kostnego podczas hematopoezy ulegają proliferacji i różnicowaniu w dwie główne linie komórkowe: mieloidalną oraz limfoidalną. Komórki mieloidalne podczas dalszego różnicowania dojrzewają w erytrocyty, monocyty, granulocyty i płytki krwi. Komórki limfoidalne różnicują natomiast w limfocyty B i T. Zarówno limfo- jak i mieloidalna linia komórek macierzystych może nadmiernie proliferować w każdym z etapów procesu różnicowania dając ostrą lub przewlekłą formę białaczki. Ostra białaczka jest chorobą o gwałtownym postępie, gdzie zmienione komórki tracą swoje naturalne właściwości. Białaczka przewlekła charakteryzuje się znacznie wolniejszym rozwojem. Ostre formy stanowią ok. 50-60% wszystkich zachorowań na białaczki, 20-30% przypada na przewlekłe białaczki limfocytowe, a 15-20% na przewlekłe białaczki szpikowe. Przewlekła białaczka limfocytowa jest najczęstszą formą białaczki u osób dorosłych w Europie oraz Ameryce Północnej. W Polsce najczęstszym typem białaczki jest ostra białaczka szpikowa (AML, około 1600 zachorowań rocznie) oraz występująca z podobną częstotliwością przewlekła białaczka limfatyczna CLL stanowiąca około 1300 zachorowań rocznie. Standardową metodą leczenia tego typu białaczki jest chemioterapia, jednakże około 20% przypadków pozostaje oporne na działanie cytostatyków. W komórkach białaczkowych wykazano znaczną nadekspresję genu Bcl-2 i stwierdzono związek pomiędzy wysokim poziomem ekspresji genu Bcl-2 a niską skutecznością chemioterapii. W wyniku translokacji chromosomowej t(14; 18), w której umiejscowienie genu Bcl-2 (18q21) w sąsiedztwie locus IgH (14q32) powoduje zaburzenia transkrypcji genu Bcl-2, wzrost poziomu mRNA i syntezy białka Bcl-2. Na tej podstawie określamy przewlekłą białaczkę B-komórkową jako chorobę o podłożu genetycznym. W przypadku chorób o podłożu genetycznym jedyną najbardziej obiecującą metodą leczenia wydaje się terapia genowa. Terapia genowa polega na wprowadzeniu do chorej komórki prawidłowego genu, bądź też włączenie lub wyłączenie funkcji jakiegoś genu leżącego u podłoża danej choroby. Najdogodniejsze do zastosowania w praktyce klinicznej wydają się metody polegające na eliminacji lub przynajmniej ograniczeniu ekspresji genu odpowiadającego za lekooporność lub za oporność na czynniki proapoptotyczne za pomocą antysensownych oligonukleotydów (asODN), siRNA, miRNA oraz DNAzymów. Zatem potencjalną metodą leczenia białaczek zależnych od nadekspresji Bcl-2 jest zastosowanie leku genetycznego w postaci antysensownych oligonukleotydów (asODN), które przyłączając się do komplementarnego docelowego mRNA indukują jego degradację przez rybonukleazy, a tym samym obniżają poziom tego białka w komórce. Jednakże największym problemem w skuteczności terapii genowej jest efektywne dostarczenie leku genetycznego do miejsca docelowego. Lek genetyczny to cząsteczka DNA bądź RNA, która zasadniczo nie jest zdolna do pokonania bariery błony komórkowej. Istotnym problemem jest wrażliwość „nagich” cząsteczek kwasów nukleinowych na enzymy nukleolityczne występujące w osoczu i innych płynach tkankowych. Ze względu na swoją budowę cząsteczka kwasu nukleinowego posiada wysoki wypadkowy ładunek ujemny promujący opsonizację i usuwanie z krwiobiegu przez makrofagi układu retikuloendotelialnego. Konieczne jest więc zastosowanie odpowiedniego nośnika, który dostarczy lek genetyczny do komórki docelowej pokonując wcześniej wymienione bariery. Przeglądu istotnych rozwiązań dotyczących liposomowych nośników leków dokonano w artykule Stebelskiej i in. „Charakterystyka i medyczne zastosowania konstrukcji liposomowych” Adv. Clin. Exp. Med. 11(2002)229-242, w którym opisano kationowe liposomy znajdujące zastosowanie jako wektory w terapii genowej oraz immunoliposomy, których powierzchnia modyfikowana jest białkami rozpoznawanymi i wiązanymi przez receptory lub antygeny zlokalizowane na powierzchni komórek docelowych. Z międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 2009/031911 oraz należącego do tej samej rodziny patentowej polskiego patentu PL208054B1 znana jest kompozycja lipidowa do wytwarzania liposomów, zawierająca naturalne oraz syntetyczne fosfolipidy, którą stanowi fosfatydylocholina jajeczna 38,7% wagowych, dioleilofosfatydylocholina 13,5% wagowych, DC-Cholesterol 5,4% wagowych, polietylenoglikolowa (PEG2000) pochodna distearoilofosfatydyloetanolaminy 15,3% wagowych oraz 27% wagowych soli trimetyloaminowej 1,2-dioleilopropanu (DOTAP). Kompozycja ta natomiast, ze względu na brak odpowiedniej modyfikacji umożliwiającej przyłączenie ligandu, nie jest przeznaczona do selektywnego dostarczania leku genetycznego

PL 233 741 B1 tylko do komórek docelowych. Z kolei z międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 2008/120914 oraz należącego do tej samej rodziny patentowej amerykańskiego zgłoszenia patentowego US 2010 203 112 A1 znana jest kompozycja lipidowa wykorzystywana jako efektywny nośnik leków genetycznych zawierająca EDOPC, DC-cholesterol, DPhPE oraz kompleks kwasu nukleinowego liposomów. Cytowana kompozycja jednak wykazuje mniejszą „ładowność” leku genetycznego w stosunku do naszego rozwiązania i wynosi odpowiednio 2 do 20 μg siRNA/ODN na 1 μmol lipidów otoczki liposomowej oraz 11 do 32 μg/μmol. Dodatkowo przedstawiony nośnik charakteryzuje się bardzo szerokim zakresem wartości średnicy cząstek 30-450 nm, szczególnie tak duże cząstki jak > 100 nm nie są pożądane podczas dożylnej aplikacji nośnika. Kwas nukleinowy znajduje się na powierzchni liposomów, zatem nie jest chroniony przed atakiem nukleaz. Ponadto brak eksperymentów potwierdzających efektywne dostarczenie leków genetycznych za pomocą tego nośnika do komórek docelowych. Autorzy doniesienia przetestowali jedynie efektywność niekierowanego wariantu nośnika przy bezpośredniej iniekcji do guza. Z kolei z publikacji naukowej Rothdiener M., et al.: „Targeted delivery of SiRNA to CD33-positive tumor cells with liposomal carrier system” J Control Release opisano skoniugowane z fragmentami przeciwciał liposomy kapsułkujące siRNA, w których siRNA zamykany jest w liposomie pasywnie w postaci wolnej lub skompleksowanej z PEI. Fragmenty przeciwciał związane z maleimidową pochodną DSPE-PEG w postaci miceli wbudowane są do utworzonych uprzednio liposomów tworząc część dwuwarstwy liposomalnej. Ten krok może się wiązać z obniżeniem aktywności preparatu, a nawet sytuacją, w której każdy jego element działa oddzielnie. Skuteczność terapeutyczną tych immunoliposomów oceniano tylko in vitro, na etapie wyciszenia ekspresji docelowego genu oraz formowania kolonii. W publikacji naukowej Deng L., et al.: „Comparison of anti-EGFR-Fab' conjugated immunoliposomes modified with two different conjugation linkers for sina delivery in SMMC-7721 cells” Int J Nanomedicine ujawniono skoniugowane z fragmentami przeciwciał liposomy kapsułkujące siRNA, w których fragmenty przeciwciał w postaci miceli wbudowano do utworzonych uprzednio liposomów. Nie zweryfikowano skuteczności immunoliposomów w warunkach in vivo. W amerykańskim zgłoszeniu patentowym US 2013 202 687 ujawniono skoniugowane z fragmentami przeciwciał liposomy kapsułkujące siRNA, w których fragmenty przeciwciał w postaci miceli wbudowano do utworzonych uprzednio liposomów. W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO2009/120247 oraz w publikacji naukowej Yo B., et al.: „Targeted nanoparticle delivery overcomes off-target immunostimulatory effects of oligonucleotides and improves therapetic efficacy of chronic tymphocytic leukemia” Blood ujawniona została kompozycja lipidów jako nośnik leków genetycznych, która umożliwia aktywne dostarczenie leku genetycznego do komórki docelowej dzięki przyłączeniu holotransferyny do powierzchni wymienionych nanocząsteczek. Jednakże w oparciu o dane literaturowe należy w tym miejscu zaznaczyć iż, wiązanie wolnej transferyny (holotransferyny) z receptorem transferynowym (TfR) charakteryzuje się wysoką stałą dysocjacji Kd, a tym samym bardzo niskim powinowactwem. Wykorzystanie tego typu liganda nie rokuje dobrze na selektywność i efektywność dostarczenia leku genetycznego do komórki docelowej w warunkach in vivo. Autor powyższego zgłoszenia patentowego wykorzystuje również przeciwciała monoklonalne, w tym Rituximab anty-CD20, charakteryzujące się bardzo niską stałą dysocjacji rzędu 1 nM, aczkolwiek poprzestaje na testowaniu kierowanego nośnika tylko na poziomie badań in vitro. W warunkach in vivo na modelu mysim z wszczepioną podskórnie białaczką L1210, analizuje akumulację niekierowanego nośnika w wytworzonych guzach z dużym powodzeniem (skuteczność preparatu na poziomie 80%). Jednakże siłą napędową takowej dystrybucji jest nie docelowe dostarczanie za pomocą liganda lecz bierna akumulacja wspierana przez występowanie zjawiska EPR (Enhanced Penetration and Retention) w obszarze tkanek nowotworowych. Przeciwciało związane jest jednak z maleimidową pochodną DSPE-PEG i w postaci miceli wbudowane do utworzonych uprzednio liposomów. Preparat oligonukleotydu wykorzystany we wskazanych publikacjach jest komercyjnym preparatem Oblimersen sodium®, a zatem modyfikowanym chemicznie oligodeoksynukleotydem. Jest to niezbędne, ponieważ nie ma pewności, czy oligonukleotyd został dokładnie opłaszczony w gotowych nanocząstkach lipidowych. W świetle stanu techniki wciąż brak jest opracowanych skutecznych kompozycji do wytwarzania kierowanych, liposomowych nośników umożliwiających dostarczenie leku genetycznego do komórek nowotworowych w celu wyciszenia ekspresji genu odpowiedzialnego za powstawanie jednostki chorobowej oraz które chroniłyby lek genetyczny przed degradacją enzymatyczną. Celem niniejszego wynalazku jest stworzenie kierowanego liposomowego nośnika, który z powodzeniem mógłby być stosowany w terapii genowej wykorzystującej np. antysensowe oligonukleotydy. Nośnik ten musi wykazywać właściwości ochronne względem zamkniętego w nim leku genetycznego i jednocześnie nie zmieniać jego właściwości terapeutycznych. Wykorzystanie wynalazku będzie pozwalało na selektywne i efektywne dostarczanie leków do komórek docelowych,

PL 233 741 B1 obniży ekspresję wybranych genów np. antyapoptotycznych, i uwrażliwi zmienione chorobowo komórki na działanie małych dawek leków cytotoksycznych. Celem wynalazku jest również uzyskanie nośnik a o niskiej nieswoistej aktywności cytotoksycznej i hemolitycznej. Nieoczekiwanie wspomniane problemy techniczne rozwiązał prezentowany wynalazek.

Pierwszym przedmiotem wynalazku jest kompozycja lipidowa służąca do wytworzenia kierowanego za pomocą przeciwciał liposomowego nośnika leków genetycznych w postaci asODN, miRNA, charakteryzująca się tym, że zawiera od 35,2% do 42,5% wagowych fosfatydylocholiny (PC), od 12,3% do 14,8% wagowych dioleilofosfatydyloetanolaminy (DOPE), od 4,9% do 5,9% wagowych 33-N-dimetyloetanokarbamoilo-cholesterolu (DC-CHOL), od 10,7% do 16,6% wagowych DSPE-PEG, od 4,6% do 6,2% wagowych maleimidowej pochodnej DSPE-PEG (DSPE-PEG-Mal), od 19,8% do 25,7% wagowych soli trimetyloaminowej 1,2-dioleilopropanu (DOTAP) , 8±1,4 μg przeciwciał anty-CD20/mg lipidu oraz 9 μg kwasów nukleinowych/mg lipidu.

Korzystniej, kompozycja według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera 42,5% wagowych PC, 14,8% wagowych DOPE, 5,9% wagowych DC-CHOL, 12,6% wagowych DSPE-PEG, 5,4% wagowych DSPE-PEG-Mal oraz 19,8% wagowych DOTAP.

Równie korzystnie, kompozycja według wynalazku, charakteryzuje się tym, że uzyskane na jej bazie liposomy mają średnicę 118±5 nm oraz potencjał zeta wynoszący 22,5±8 mV.

Drugim przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji lipidowej do wytwarzania liposomowego nośnika leków genetycznych do leczenia białaczki.

Powstała w ten sposób struktura liposomowa zapewnia ochronę leku genetycznego przed degradacją. Ponadto nośnik leku genetycznego pozwala na efektywne i selektywne dostarczenie leku do zmienionej chorobowo komórki przez co możliwe jest zminimalizowanie efektów ubocznych terapii. Warunek ten może być spełniony przez przyłączenie ligandu kierującego nośnik do komórki docelowej. Charakterystyczna zawartość grup maleimidowych modyfikowanego lipidu DSPE-PEG-Mal umożliwia przyłączenie tiolowanych białek i peptydów, w tym przypadku przeciwciał zapewniających kierowanie leku genetycznego do komórek docelowych. Efektywne przyłączenie przeciwciał do powierzchni liposomów o składzie według wynalazku uwarunkowane jest obecnością grup tiolowych w cząsteczce przeciwciała (uzyskiwane w reakcji tiolacji grup aminowych za pomocą odczynnika Trauta) oraz odpowiednim stosunkiem molowym IgG do reszt maleimidowych w dwuwarstwie nośnika. Istotnym jest również to, że uzyskane liposomy nie tworzą agregatów w zawiesinie. Otrzymane preparaty liposomowe nie wykazują również aktywności hemolitycznej w stosunku do ludzkich erytrocytów. Kierowany nośnik liposomowy o kompozycji lipidowej według wynalazku wykazuje właściwości ochronne względem zamkniętego w nim leku genetycznego.

Przykładowe realizacje wynalazku przedstawiono na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia wykres ilustrujący rozkład wielkości średnicy cząstek liposomów w preparacie wyjściowym oraz po 12 miesięcznym przechowywaniu w postaci zawiesiny w temperaturze 4°C, fig. 2 przedstawia wykres ilustrujący rozkład wartości potencjału zeta liposomów po 12 miesiącach przechowywania w postaci zawiesiny w temperaturze +4°C, fig. 3 przedstawia wykres ilustrujący zmiany zawartości leku genetycznego w liposomach podczas 12 miesięcznego przechowywania w postaci zawiesiny w temperaturze +4°C, fig. 4 przedstawia wykres ilustrujący właściwości hemolityczne liposomów względem ludzkich erytrocytów, fig. 5 przedstawia wynik analizy elektroforetycznej zamkniętego w nośniku plazmidowego DNA, fig. 6 przedstawia wykres ilustrujący cytotoksyczność liposomów, fig. 7 przedstawia wykres ilustrujący efektywność przyłączania przeciwciał do liposomów, fig. 8 przedstawia wykresy ilustrujące selektywność i efektywność immunoliposomów względem wybranych linii komórkowych: L1210, Jurkat T oraz Daudi, fig. 9 przedstawia drogę wnikania oraz selektywność immunoliposomów, fig. 10 przedstawia skuteczność wyciszenia ekspresji genu Bcl-2 przez immunoliposomy w białaczkowej linii komórkowej Raji (CD20+), fig. 11 przedstawia krzywe przeżywalności komórek Daudi (CD20+) w funkcji stężenia dodawanych immunoliposomów, fig. 12 przedstawia wykres ilustrujący efektywność leczenia za pomocą immunoliposomów zawierających asODN przeciw genowi Bcl-2 myszy SCID z guzami powstałymi w wyniku podskórnego wszczepienia komórek Daudi CD20+.

P r z y k ł a d

Celem uzyskania 1 ml kompozycji lipidowej w postaci zawiesiny liposomowej 100-300 μg oligonukleotydów (asODN, scODN, miRNA) zawieszano w 150 μl wody dejonizowanej ddH2O. Do wodnej mieszaniny DNA dodawano 300 μl chloroformu. W celu uzyskania jednej fazy dodawano 300 μl metanolu, a następnie miareczkowano po kropli dodając metanol aż do uzyskania klarownej mieszaniny (<100 μl dodatkowo). Do klarownej mieszaniny dodawano 150 μl chloroformowego roztworu DOTAP zawierającego 1 mg tego lipidu. Delikatnie mieszano, uzyskując jedną fazę. Odstawiano na 30-40 minut

PL 233 741 B1 w temperaturze pokojowej. Po tym czasie do mieszaniny dodawano 600 μΙ chloroformu, mieszano, a następnie dodawano taką samą objętość wody ddH2O. Pozostawiano na 1 minutę do ustalenia równowagi pomiędzy fazami organiczną i nieorganiczną. Następnie odwirowywano w warunkach 800 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po wirowaniu usuwano fazę górną, a fazę dolną dodawano do chloroformowej mieszaniny roztworów lipidów: 4,3 mg PC, 1,8 mg DOPE, 0,6 mg DC-CHOL, 1,19 mg DSPE-PEG, 0,51 mg DSPE-PEG-Mal, a następnie dodawano 250 μl buforu PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4). Zawiesinę poddawano dezintegracji ultradźwiękami przez 1 minutę przy jednoczesnym schładzaniu próbki w łaźni lodowej. Po uzyskaniu mlecznobiałej emulsji w wyniku sonikacji odparowywano rozpuszczalniki organiczne w strumieniu azotu, a następnie dodatkowo w wyparce próżniowej przez 2 h do usunięcia pozostałości rozpuszczalników organicznych. Powstały żel uwadniano przez uzupełnienie buforem PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4) do objętości 1 ml. Zawiesinę kalibrowano w ekstruderze ciśnieniowym (wartość przyłożonego ciśnienia: 1,2-2,0 kPa) przez poliwęglanowe filtry (MilliPore, Whatman) o średnicy porów 400, 200 i 100 nm, przez każdy filtr przynajmniej dziesięciokrotnie.

W celu przyłączenia przeciwciał do liposomowego nośnika przygotowywano je następująco: reakcję tiolacji wolnych grup aminowych przeprowadzano używając 3 mg przeciwciał (tu RituximabR) rozpuszczonych w 300 μl buforu cytrynianowego (C6HsO7Na3«2H2O, NaCl, NaOH, Polisorbat80 (Monolaurynian polioksyetylenosorbitolu)) oraz 0,6 mg odczynnika Trauta w obecności EDTA (20 mM) w pH 7,4, a następnie całość mieszaniny reakcyjnej inkubowano 4 h w temperaturze +4°C z delikatnym mieszaniem. Po tym czasie usuwano nadmiar odczynnika Trauta w dializie do buforu PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4). Tak przygotowany roztwór przeciwciał mieszano z 1 ml wcześniej przygotowanego preparatu liposomowego opisanego powyżej. Reakcję przyłączania przeciwciał do liposomów przeprowadzano w temperaturze +4°C przez 24 h. Niezwiązane przeciwciała oddzielano od immunoliposomów poprzez sączenie molekularne na złożu Sepharose 4B (kolumna o wymiarach 25 x 1,2 cm zrównoważona buforem PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4) w temperaturze +4°C. Zawartość przeciwciał we frakcji liposomowej oznaczano za pomocą testu ELISA.

Doświadczenie na modelu zwierzęcym:

Myszom szczepu NOD/SCID wszczepiono podskórnie komórki białaczkowe linii Daudi (CD20+). Do przeszczepiania drogą podskórną zastosowano zawiesinę komórek pochodzących z hodowli in vitro w liczbie 1*10⁶/mysz. Po utworzeniu podskórnego guza, myszom zaaplikowano roztwory leków w postaci zawiesiny liposomów według wynalazku oraz wodnego mitoksantronu. Do tego eksperymentu wykorzystano 5 grup, po 8 zwierząt każda. Spośród 5 analizowanych grup 3 z nich stanowiły grupy kontrolne w celu wykluczenia terapeutycznego działania oddzielnie małej dawki mitoksantronu 0,1 mg/kg m.c., immunoliposomów według wynalazku ale zawierających sekwencję „wymieszaną” („scrambled”) oraz buforu PBS. W pozostałych 2 grupach analizowano działanie terapeutyczne proponowanego tutaj leku w postaci immunoliposomów według wynalazku kierowanych przeciwciałami Rituximab zawierające asODN anty- Bcl-2 oddzielnie oraz w terapii skojarzonej z małą dawką mitoksantronu (0,1 mg/kg m.c.).

Roztwory leków przygotowywano bezpośrednio przed użyciem. Preparaty podawano w objętości 200-300 μl (10 μ^1 g m.c.), gdzie każdorazowo dawka zawierała dla preparatu immunoliposomów: 800 μg/kg m.c. ODN, 88 mg/kg m.c. lipidów, 650 μg/kg m.c. przeciwciał Rituximab lub 0,1 mg/kg m.c. mitoksantronu w przypadku leku przeciwnowotworowego. Roztwory wstrzykiwano do żyły ogonowej bocznej po unieruchomieniu zwierzęcia. Efektywność leczenia przedstawiono w postaci wykresu zależności wzrostu guza od czasu trwania terapii dla każdego z podawanych preparatów zilustrowanym na fig. 12, na którym wyraźnie widoczna jest remisja guzów nowotworowych w grupie traktowanej immunoliposomami według wynalazku zawierających asODN anty-Bcl-2 oraz tymi samymi immunoliposomami w połączeniu z małą dawką mitoksantronu. Eksperyment wykazał wysoką skuteczność preparatu immunoliposomów według wynalazku zawierających asODN anty-Bcl-2 w terapii guzów (CD20+) zarówno w zastosowaniu osobnym jak i skojarzonym z niską dawką cytostatyku.

Zastosowanie przedstawionej kompozycji lipidowej do wytworzenia liposomowego nośnika leku genetycznego w postaci asODN, siRNA lub miRNA gwarantuje uzyskanie stabilnych rozmiarowo liposomów o średnicy około 118+/-5 nm o niskiej dynamice wzrostu podczas rocznego przechowywania w postaci zawiesiny lub liofilizatu jak ilustruje to wykres przedstawiony na fig. 1, których wielkość mierzono techniką dynamicznego rozpraszania światła. Istotnym jest również to, że uzyskane liposomy nie tworzą agregatów w zawiesinie. Uzyskany preparat liposomowy wykazuje również stabilność pod

PL 233 741 B1 względem wartości potencjału zeta ok. 23 mV (Fig. 2) mierzonego za pomocą kombinacji elektroforezy i techniki LDV Laser Doppler Velocimetry, oraz zawartości leku genetycznego w granicach 95-98% (Fig. 3). Otrzymane preparaty liposomowe nie wykazują również aktywności hemolitycznej w stosunku do ludzkich erytrocytów. Uzyskane wartości hemolizy do 7% mieszczą się w granicach błędu metody (Fig. 4). Aktywność hemolityczną nośnika oceniano badając wypływ hemoglobiny z wyizolowanych z ludzkiej krwi erytrocytów po inkubacji z liposomami. Erytrocyty w liczbie 7*107 inkubowano ze wzrastającą ilością 0,5-4 μg pDNA/ml zamkniętego w liposomowym nośniku według wynalazku. Próbę ślepą stanowiły erytrocyty zawieszone w PBS i inkubowane jak próby badane. Za całkowitą hemolizę przyjęto 7*107 komórek zawieszonych w dejonizowanej wodzie i inkubowanych jak powyżej. Wyciek hemoglobiny z erytrocytów liposomów był indykatorem aktywności hemolitycznej liposomów. Absorbancję hemoglobiny mierzono przy długości fali 570 nm po 2 h inkubacji w 37°C.

Kierowany nośnik liposomowy w kompozycji lipidowej według wynalazku wykazuje właściwości ochronne względem zamkniętego w nim leku genetycznego. Liposomowy nośnik zawierający plazmidowe DNA inkubowano z DNAzą przez 2 h w temperaturze +37°C, a następnie właściwości ochronne liposomów badano poprzez analizę elektroforetyczną zamkniętego w nośniku plazmidowego DNA (Fig. 5).

W przykładzie wykonania przetestowano szeroki zakres zawartości pochodnej polietylenoglikolowej lipidu, DSPE w granicach 10,7-16,6% wagowych, co w znacząco wpłynęło na obniżenie niespecyficznej aktywności cytotoksycznej liposomów (Fig. 6). W celu sprawdzenia nieswoistej aktywności cytotoksycznej preparatów liposomowych testowano je wobec szerokiego spektrum linii komórkowych (model białaczki limfoblastycznej Jurkat T, białaczki mieloidalnej HL 60 oraz komórki HEL należące do linii erytroidalnej). Preparaty liposomowe o kompozycji według wynalazku wykazują niską nieswoistą aktywność cytotoksyczną (Fig. 6). Aktywność cytotoksyczną liposomów mierzono przy użyciu testu MTT (MTT-formazan błękitu triazolowego, ang. Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, Sigma Aldrich). W metodzie tej wykorzystuje się oksydoredukcyjną aktywność mitochondriów. W wyniku działania mitochondrialnej dehydrogenazy żółta, rozpuszczalna w wodzie, sól tetrazolowa przekształcana jest do purpurowych, nierozpuszczalnych w wodzie kryształów formazanu. Ilość wytworzonych kryształów formazanu jest proporcjonalna do liczby żywych komórek.

Otrzymany preparat immunoliposomów (kierowany za pomocą przeciwciał) wykazuje wysoką selektywność względem komórek docelowych eksponujących antygen powierzchniowy CD20. Selektywność immunoliposomów sporządzonych według wynalazku testowano in vitro wobec komórek L1210 (CD20-), Jurkat T (CD20-), HeLa (CD20-), Daudi (CD20+) oraz RPMI 8226 (CD20+) w oparciu o testy toksyczności MTT (Fig. 8) oraz obrazowania fluorescencji pochodzącej od znakowanych DiD (1,1'-Dioktadecyl-3,3,3',3'-Tetrametylindodikarbocyjanina, Invitrogen) immunoliposomów (Fig. 9a), jądra komórkowe wybarwione DAPI. Przy pomocy testu toksyczności MTT (wykonano jw.) wykazano, że immunoliposomy zawierające lek genetyczny w postaci asODN anty-Bcl-2 są selektywne i efektywne tylko względem komórek eksponujących antygen CD20 (Fig. 8), gdzie za miarę selektywności przyjęto toksyczność konstruktu tylko względem komórek docelowych CD20+. Dodatkowo przeprowadzono eksperymenty selektywności nośnika według wynalazku przy pomocy znakowanych barwnikiem DiD immunoliposomów względem komórek HeLa (adherentne o charakterystycznym kształcie, CD20-) i RPMI 8226 (o regularnym kształcie, CD20+). Immunoliposomy selektywnie docierają tylko do komórek CD20+, gdzie widoczna jest akumulacja znakowanych fluorescencyjnie barwnikiem DiD immunoliposomów w obrębie błony komórkowej komórek CD204 (Fig. 9b).

Kompozycja lipidowa immunoliposomów według wynalazku efektywnie obniża ekspresję genu Bcl-2 w komórkach Raji (CD20+), co zostało ocenione na podstawie analizy poziomu białka Bcl-2 w komórkach kontrolnych i traktowanych immunoliposomami za pomocą techniki Western Blot (Fig. 10).

Preparat liposomowy o składzie według wynalazku przewidziany jest również do stosowania w terapii genetycznej skojarzonej z cytostatykami, dlatego zbadano wpływ obniżenia ekspresji genu Bcl-2 na przeżywalność komórek Daudi CD20+ oraz na efektywność terapii skojarzonej. Obniżenie ekspresji genu Bcl-2 za pomocą asODN w immunoliposomach według wynalazku znacząco poprawia efektywność działania cytostatyku, tu mitoksantronu w dawce odpowiadającej IC 50 1,25 nM (Fig. 11).

Zastosowanie odpowiedniego składu lipidowego, a w szczególności zwiększenie zawartości DSPE-PEG, wykorzystanie modyfikowanego maleimidem DSPE-PEG, dobór proporcji ładunków pomiędzy lipidem kationowym a lekiem genetycznym w postaci asODN oraz przyłączenie przeciwciał „kierujących”, którymi w przypadku testowanego układu były humanizowane przeciwciała RituximabR (MabThera®) umożliwiają selektywne i efektywne dostarczenie leku genetycznego do komórek białaczkowych posiadających marker powierzchniowy CD20.

Claims (4)

1. Kompozycja lipidowa służąca do wytworzenia kierowanego za pomocą przeciwciał liposomowego nośnika leków genetycznych w postaci asODN, miRNA, znamienna tym, że zawiera od 35,2% do 42,5% wagowych fosfatydylocholiny (PC), od 12,3% do 14,8% wagowych dioleilofosfatydyloetanolaminy (DOPE), od 4,9% do 5,9% wagowych 33-N-dimetyloetanokarbamoilocholesterolu (DC-CHOL), od 10,7% do 16,6% wagowych DSPE-PEG, od 4,6% do 6,2% wagowych maleimidowej pochodnej DSPE-PEG (DSPE-PEG-Mal), od 19,8% do 25,7% wagowych soli trimetyloaminowej 1,2-dioleilopropanu (DOTAP), 8±1,4 μg przeciwciał antyCD20/mg lipidu oraz 9 μg kwasów nukleinowych/mg lipidu.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera 42,5% wagowych PC, 14,8% wagowych DOPE, 5,9% wagowych DC-CHOL, 12,6% wagowych DSPE-PEG, 5,4% wagowych DSPE-PEG-Mal oraz 19,8% wagowych DOTAP.

3. Kompozycja według zastrz. od 1 do 2, znamienna tym, że uzyskane na jej bazie liposomy mają średnicę 118±5 nm oraz potencjał zeta wynoszący 22,5±8 mV.

4. Zastosowanie kompozycji lipidowej określonej w którymkolwiek z zastrz. od 1 do 3 do wytwarzania liposomowego nośnika leków genetycznych do leczenia białaczki.