CN114487147A - 一种uplc-qtof-ms检测中药组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种利用UPLC‑QTOF‑MS检测中药组合物质量的方法，该方法包括分离鉴别组合物中35个化学成分并建立数据库，并结合化学成分数据库和特定的分析方法，快速、高效、准确的检测该组合物中主要化学成分，鉴别中药组合物复杂体系成分，实现对其物质群的全面控制。

Description

一种UPLC-QTOF-MS检测中药组合物的方法
技术领域
本发明涉及中药制剂的质量控制方法领域，具体涉及一种中药组合物的检测方法，并由此方法得到化学成分信息数据库。
背景技术
CN200810055636.0公开了一种治疗肝病的中药，它由黄芪、鳖甲、葛根、柴胡、灵芝、赤芍、丹参、三七、鸡骨草、叶下珠十味中药制成，该中药具有益气疏肝、活血软坚的功效，用于治疗慢性肝炎、肝纤维化、早期肝硬化，目前正在由盈科瑞(珠海)创新医药制造有限公司开展新药临床研究，属于中药一类新药。
由于该中药组合物的药效物质基础尚不明确，其质量控制手段主要有传统的生药学研究、薄层鉴别、单一成分(黄芪甲苷、葛根素、芍药苷)的含量测定，这些技术手段和方法难以全面系统的表征化学成分轮廓特征和控制该组合物的内在质量。目前，液质联用技术已广泛应用于中药及复方物质基础方面的研究，以液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)为代表的一类高分辨率、高灵敏度的液质联用技术在中药复杂体系成分快速鉴别领域的应用越来越多。
文献《UPLC-TOF-MS分析乐脉颗粒的化学成分》，姚万龙等。采用超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)对乐脉颗粒中的化学成分进行鉴定。利用UPLC-QTOF-MS的高分离度、高分辨率及精确的分子量信息，并结合药材化学成分数据库的检索与色谱峰药材来源的分析，共鉴定出化合物23个。
为了更全面的控制CN200810055636.0中治疗肝病的中药制剂的质量，揭示其临床疗效的物质基础。建立一种能快速、高效、准确的检测该组合物中主要化学成分的方法，实现对其物质群的全面控制，为该组合物质量评价提供科学实验依据，具有重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种检测治疗肝病的中药组合物中化学成分的检测方法，所述方法具有快速、准确、重复性良好的特点，该方法采用超高液相色谱与超高分辨飞行时质谱联用的技术(UPLC-QTOF-MS)对该组合物中的化学成分进行的鉴定，所述方法能更加全面的控制治疗肝病的中药组合物制剂的质量。
本发明提供了一种基于UPLC-QTOF-MS检测中药组合物化学成分的方法，包括如下步骤：
(1)样品溶液的制备：称取中药组合物，用溶剂超声提取，离心，滤过，取续滤液，即得到待测样品；
(2)测定：用超高效液相色谱和质谱，分离并检测步骤(1)中待测样品，得到成分物质峰，结合对照品化学成分信息数据库对色谱峰进行指认和归属。其中(2)超高液相色谱条件为：流动相为0.1％甲酸水溶液(A)和0.1％甲酸乙腈(B)；梯度程序：0～20min，3％～60％B；20～25min，60％～95％B；25～30 min，95％B；30～31min，95％～3％B；31～35min，3％B。
0～20min，3％～60％B；表示从0分钟至20分钟，0.1％甲酸水溶液(A) 从97％线性降低至40％，相应的0.1％甲酸乙腈(B)，从3％线性降低至60％。具体梯度洗脱程序如下表所示：
Figure BDA0003255593720000021
在一项实施方案中，为了获得更好的分离效果，洗脱系统的流动相为：流动相A的体积浓度为0.03～0.2％甲酸水溶液，优选为0.1％甲酸水溶液；流动相B体积浓度为0.03～0.2％甲酸乙腈，优选为0.1％甲酸乙腈溶液；
本发明的流速为0.1～0.5ml/min，从色谱分离效果考虑，本发明优选的流速为0.35ml/min；柱温为30～40℃，优选柱温为35℃±2℃；
本发明的进样量为0.5～3μL，考虑到色谱分离效果优选进样量为1μL；
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正、负离子模式扫描，扫描范围m/z 100～1700，MS采样速率2spectra/s，干燥气(N2)流速1～20L/min，优选为 10L/min；干燥气温度200～400℃，优选325℃；喷雾器压力0.28MPa，毛细管电压3.5kV，喷嘴电压正离子模式0.5KV、负离子模式1.5KV，数据处理：Agilent MassHunter workstation数据处理软件。
本发明考察了多种不同填料的色谱柱的分离效果，包括Waters ACQUITY UPLCBEH C18 Column，(规格为2.1×100mm，1.7μm)；或者 Waters ACQUITY UPLC HSS T3Column，(规格为2.1×100mm，1.7μm)；或者Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 Column(规格为2.1mm×150mm，1.8 μm)。本发明人发现Zorbax Eclipse Plus C18 Column(规格为2.1mm×150 mm，1.8μm)的色谱柱对该中药组合物的分析效果更高，保留时间适中，色谱柱对样品测定影响效果较小，耐用性良好。本发明采用超高液相色谱 (UPLC)相对于传统的HPLC分离效果更好，速度更快，非常合适中药组合物的快速检测。
在一项实施方案中，待测样品可以中药组合物的干膏粉或者该中药组合物的配方颗粒、片剂、胶囊剂。将中药组合物制剂0.05～0.2g，研细，精密称定，加入25％～75％甲醇，称定重量；样品进行超声处理(功率220W，频率 50～60kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用25％～75％甲醇补足减失的重量，溶液摇匀，离心(4000r/min，10min)，滤过，取续滤液，即得到待测样品。根据该中药组合物的化学成分的溶解性，优选地，加入50％甲醇溶液溶解。
该方法还包括建立对照品化学成分信息数据库，步骤如下：
S1，对照品溶液的制备：依次取没食子酸、丹参素、原儿茶醛、隐绿原酸、绿原酸、葛根素、柯里拉京、芍药苷、芦丁、鞣花酸、异槲皮苷、三七皂苷R1、迷迭香酸、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、槲皮素、人参皂苷Rb1、三七皂苷R2、芹菜素、20(S)-人参皂苷Rg2、20(R)-人参皂苷 Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、黄芪甲苷、人参皂苷Rd、灵芝酸A、七叶胆苷ⅩⅦ、柴胡皂苷A、人参皂苷F2、20(S)-人参皂苷Rg3、 20(R)-人参皂苷Rg3、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA对照品，精密称定，置于10mL量瓶中，加甲醇超声使溶解，冷却至室温后定容至刻度，摇匀，制成10mg/L-1对照品溶液。
S2，按所述超高效液相色谱条件和质谱条件对上述混合对照品溶液进行测定，基于Chemspider和PubChem数据库检索工具及对照品化学成分信息建立对照品化学成分信息数据库。
其中步骤(2)测定还包括：(a)从质谱总离子流图中提取出物质峰，得到精确的分子量；(b)将物质峰的类别、分子量、保留时间与得到对照品化学成分信息数据库进行匹配，再结合相应药材的化学成分和单味药质谱信息，得到化合物的结构和来源。通过以上方法共鉴定出35个化合物。
优选地，质谱数据分析结合Dictionary of Natural Products(DNP)，ChemSpider，PubChem等数据库中质谱信息及文献，采用Masshunter (B.06.00)软件采集和处理数据。
优选地，本发明的重要组合物可以采用实施例1-14的方法进行制备；
优选地，本发明的中药组合物是这样制备的：
取鳖甲300g、灵芝150g，用水进行提取，固液比为1:8(即450g饮片加入3600ml体积的水)加水8倍量，提取3次，每次3小时，滤过，合并滤液，备用；取黄芪500g、葛根300g、丹参300g，用体积分数70％的乙醇，固液比为1:8(即1100g饮片加入8800ml体积的乙醇)，加热回流提取3次，每次1小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，浓缩液备用；取柴胡300g、赤芍300g、三七150g、鸡骨草300g、叶下珠500g，用水进行提取，固液比为1:8(即1550g饮片加入12400ml体积的水)，加热回流提取3次，每次1 小时，滤过，滤液与前述浓缩液合并，减压浓缩至相对密度为1.30～1.35(50℃) 的浸膏，干燥，粉碎成干膏粉。上述干膏粉、糊精及阿司帕坦等，混匀，制粒，即制成颗粒剂。加入辅料约为干膏粉重量的20％-50％。
优选地，本发明的中药组合物可以制备成任何一种常用剂型，包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、微丸剂、软胶囊、滴丸、分散片、泡腾片等。
附图说明
图1为供试品溶液的基峰正离子色谱图(BPC)。
图2为供试品溶液的基峰负离子色谱图(BPC)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域的普通技术人员应该理解，所述方法可以用于测定该中药化合物的一种或多种化学成分。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
步骤一，供试品的制备：取组合物颗粒剂0.1g，研细，精密称定，加入 50％甲醇10mL，称定重量；样品进行超声处理(功率220W，频率50～60kHz) 30min，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，溶液摇匀，离心(4000r/min，10min)，滤过，取续滤液，即得到待测样品。
步骤二，对照品溶液的制备：分别取没食子酸、丹参素、原儿茶醛、隐绿原酸、绿原酸、葛根素、柯里拉京、芍药苷、芦丁、鞣花酸、异槲皮苷、三七皂苷R1、迷迭香酸、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、槲皮素、人参皂苷Rb1、三七皂苷R2、芹菜素、20(S)-人参皂苷Rg2、20(R)-人参皂苷 Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、黄芪甲苷、人参皂苷Rd、灵芝酸A、七叶胆苷ⅩⅦ、柴胡皂苷A、人参皂苷F2、20(S)-人参皂苷Rg3、 20(R)-人参皂苷Rg3、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，置于10mL量瓶中，加甲醇超声使溶解，冷却至室温后定容至刻度，摇匀，制成10mg/L的对照品溶液。
步骤三，按超高液相色谱条件和质谱条件对供试品溶液和对照品溶液进行测定，得到对照品化学成分信息数据库。色谱条件：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(2.1mm×150mm，1.8μm)，流动相0.1％甲酸水溶液(A) -0.1％甲酸乙腈(B)梯度洗脱(0～20min，3％～60％B；20～25min，60％～95％B； 25～30min，95％B；30～31min，95％～3％B；31～35min，3％B)，流速0.35 mL/min，柱温35℃，进样量1μL。
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正、负离子模式扫描，扫描范围m/z 100～1 700，MS采样速率2spectra/s，干燥气(N2)流速10L/min，干燥气温度325℃，喷雾器压力0.28MPa，毛细管电压3.5kV，喷嘴电压正离子模式0.5KV、负离子模式1.5KV，Agilent MassHunterworkstation软件进行数据处理。
步骤四，将色谱峰的精确分子量与对照品化学成分信息库进行比对，结合对照品、保留时间和单味药质谱信息对色谱峰进行指认和归属。
UPLC-QTOF-MS鉴定中药组合物各色谱峰的保留时间、鉴定结果及其来源归属如下：
Figure BDA0003255593720000061
Figure BDA0003255593720000071
Figure BDA0003255593720000081
Figure BDA0003255593720000091
Figure BDA0003255593720000101
Figure BDA0003255593720000111
注：*表示根据对照品定位鉴定
供试品溶液的基峰离子色谱图(BPC)见图1-2。

Claims (4)

1.一种UPLC-QTOF-MS检测中药组合物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)样品溶液的制备：称取中药组合物，用溶剂超声提取，离心，滤过，取续滤液，即得到待测样品；
(2)测定：用超高效液相色谱和质谱，分离并检测步骤(1)中待测样品，得到成分物质峰，结合对照品、保留时间和单味药质谱信息对色谱峰进行指认和归属；
其中步骤(2)超高液相色谱条件为：流动相为0.03～0.2％甲酸水溶液(A)和0.03～0.2％甲酸乙腈(B)；梯度程序：0～20min，3％～60％B；20～25min，60％～95％B；25～30min，95％B；30～31min，95％～3％B；31～35min，3％B；
流速：0.1～0.5ml/min；柱温30～40℃；
质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，正、负离子模式扫描，干燥气(N2)流速1～20L/min,干燥气温度200～400℃，喷雾器压力0.2～0.4MPa；
其中，所述中药组合物中含有下述化学成分的一种或多种：没食子酸、丹参素、原儿茶醛、隐绿原酸、绿原酸、葛根素、柯里拉京、芍药苷、芦丁、鞣花酸、异槲皮苷、三七皂苷R1、迷迭香酸、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、槲皮素、人参皂苷Rb1、三七皂苷R2、芹菜素、20(S)-人参皂苷Rg2、20(R)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、黄芪甲苷、人参皂苷Rd、灵芝酸A、七叶胆苷ⅩⅦ、柴胡皂苷A、人参皂苷F2、20(S)-人参皂苷Rg3、20(R)-人参皂苷Rg3、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA。
2.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述流动相为0.1％甲酸水溶液(A)和0.1％甲酸乙腈(B)；流速为0.35ml/min；柱温为35℃±2℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对照品化学成分信息数据库是这样建立的，
S1，对照品溶液的制备：依次取没食子酸、丹参素、原儿茶醛、隐绿原酸、绿原酸、葛根素、柯里拉京、芍药苷、芦丁、鞣花酸、异槲皮苷、三七皂苷R1、迷迭香酸、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、槲皮素、人参皂苷Rb1、三七皂苷R2、芹菜素、20(S)-人参皂苷Rg2、20(R)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、黄芪甲苷、人参皂苷Rd、灵芝酸A、七叶胆苷ⅩⅦ、柴胡皂苷A、人参皂苷F2、20(S)-人参皂苷Rg3、20(R)-人参皂苷Rg3、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA对照品，精密称定，置于10mL量瓶中，加甲醇超声使溶解，冷却至室温后定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液；
S2，按权利要求1所述超高效液相色谱条件和质谱条件对上述混合对照品溶液进行测定，得到对照品的保留时间和质谱信息。
4.权利要求1至3任一项所述的方法用于鉴定化学成分、中药组合物或药材的用途，其特征在于，所述化学成分为权利要求1中所列化学成分的一种或多种，所述中药组合物、药材包含权利要求1中所列化学成分的一种或多种。
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