CN114480666B - 一种利用issr分子标记区分黑鲷鱼及其两种杂交子代的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种区分黑鲷鱼及其两种杂交子代的ISSR分子标记方法，包括利用2个ISSR分子标记对黑鲷及2个杂交新品系的个体进行PCR扩增，根据对PCR产物的电泳条带检测，区分来自黑鲷、杂交子代及回交子代等3种鲷鱼的个体。本发明方法操作简便，费用低，准确度高且通用性好，能快速、有效地鉴别基于黑鲷的不同亲本组合所得的杂交种新品系，为黑鲷新品种培育研究和杂交新种质的鉴别研究提供技术帮助。
Description
技术领域
本发明属于鉴别黑鲷领域，特别涉及一种利用ISSR分子标记区分黑鲷鱼及其两种杂交子代的方法。
背景技术
黑鲷(Acanthopagrus schlegelii，AS)为鲷科(Sparidae)、棘鲷属(Acanthopagrus)中名贵经济鱼类。黑鲷具有广温性、抗病力强及味道鲜美等特点，为我国沿海养殖的重要鱼类。黑鲷的生长速度较慢制约了其养殖产业的发展；而同为鲷科的真鲷(Pagrus major)为赤鲷属(Pagrus)种类，其生长速度快且体色靓丽，也是我国沿海的重要养殖对象。为选育优良海水养殖新品种，我们利用黑鲷与真鲷进行的多个杂交育种组合取得了具有生长快、抗逆性强等目标性状优势的新种质，为鲷科鱼的养殖产业发展提供了多个优良新品系。
利用育种研究培育出杂交后代中，以黑鲷真鲷为亲本得到的杂交子代(黑鲷(♀)×真鲷(♂) 反交F1，HF1)及回交后代(黑鲷(♀)×HF1，BF1)等皆在江苏省海洋水产研究所养殖基地进行了养殖试验。但，HF1、BF1均与黑鲷的体形、外貌相似，从外观上无法进行这3个种类的区分，所以需要研究出简便易行的方法来辨别黑鲷与其杂交后代，以免产生种质混淆。杂种子代的种质鉴别，成为除了重点关注杂交鱼的生长速度、抗逆性等经济性状之外的一个重要研究内容。至今尚未有关可以同时鉴别黑鲷、BF1及HF1等3个种质的相关检测方法的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种区分黑鲷鱼及其两种杂交子代的ISSR分子标记方法，该方法操作简便，费用低，准确度高且通用性好，能快速、有效地鉴别基于黑鲷的不同亲本组合所得的杂交种新品系，为黑鲷新品种培育研究和杂交新种质的鉴别研究提供技术帮助。
本发明提供了一种区分黑鲷鱼及其两种杂交子代的ISSR分子标记方法，包括：
(1)分别提取黑鲷、回交及杂交子代3个种质个体的总DNA，4℃以下保存备用；
(2)采用ISSR-UBC846、ISSR-UBC847引物对上述总DNA进行PCR扩增；其中，所述ISSR-UBC846的序列为：CAC ACA CAC ACA CAC ART；所述ISSR-UBC847的序列为：CAC ACACAC ACA CAC ARC；
(3)凝胶电泳检测PCR产物的DNA条带情况，其中ISSR-UBC847的PCR扩增产物的电泳图谱中，属于黑鲷的个体在750～1000bp间有一扩增带，而其它两种鱼的个体在此处无扩增带(见图1中的样本1～9)；引物ISSR-UBC846的PCR扩增产物电泳图谱中，属于反交鱼的个体无扩增带(见图1中样本的11～19)，而其它两种鱼有，据此区分出黑鲷、回交及杂交子代。
所述步骤(2)中的PCR扩增反应体系为：10pmol/L引物1μl，DNA模板约1.5μl，Buffer 2.5μl，dNTP 0.5μl，Mg2+1.5μl，Taq聚合酶0.25μl，添加ddH2O至25μl。
所述步骤(2)中的PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，然后进入循环：94℃45s，56℃45s，72℃45s，共36个循环，最后一个循环结束后再在72℃继续延伸10min，4℃保存。
所述步骤(3)中的凝胶电泳检测条件为：制备浓度为1.5％琼脂糖凝胶后，吸取PCR产物3μl与1μl的溴酚蓝混匀，点入胶孔；同时，添加Marker标准分子量2μl一起跑胶；电压为110～120V，电泳时间为30～40min后，通过凝胶成像系统，结合Marker标准分子量条带分布，检测分析各个体的DNA条带情况。
在本实验的过程中，ISSR引物的扩增结果稳定性易受到Taq酶、Mg2+、引物、退火温度、 dNTP等条件的影响，因此，为保证结果的清晰、可靠和准确，必须严格按照反应体系的模板浓度、退火温度及循环次数等要求进行。
本发明研究结果为黑鲷等鲷鱼种类的种质鉴别与利用研究提供了行之有效的简便操作方法。本发明所用到的扩增引物除可用现有技术中的黑鲷等，还可用于其它鲷科鱼类该引物序列的扩增与表达分析。
有益效果
(1)本发明基于ISSR引物PCR反应体系得到了3个鲷鱼种质的特异性条带表达，拓宽了黑鲷及其杂交子代鉴别的技术体系，同时也为其它鲷科鱼类的种质鉴别提供了方法参考。
(2)本发明无须进行引物的设计，无须采用特别的机体组织或其它特殊要求，只要是是个体组织均可，仅须按照设计好的程序进行PCR反应，就可准确、高效进行黑鲷及其杂交子代的种质特异性条带鉴别。
(3)本发明方法操作简便，费用低，准确度高且通用性好，能快速、有效地鉴别基于黑鲷的不同亲本组合所得的杂交种新品系，为黑鲷新品种培育研究和杂交新种质的鉴别研究提供技术帮助。
附图说明
图1为引物847和引物846的鉴别电泳图谱；
图2为采用不同DNA浓度的电泳图谱；
其中，回交鱼样本：1～3及11～13，反交鱼样本：4～6及14～16，黑鲷鱼样本：7～9及17～19； M：标准分子量。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1)从黑鲷及杂交子代、回交子代的各随机取健康个体3尾。切取一粒绿豆大小的鱼肉(或其它体组织)，用剪刀剪碎放入1.5mL的离心管中；采用动物细胞/组织基因组DNA提取试剂盒或酚氯仿法，分别提取各个体的总DNA后，4℃保存。
2)ISSR引物：采用加拿大哥伦比亚大学(UBC)的第9套引物ISSR (http://www.biotech.ubc.ca/services/naps/primers/Primers.pdf)中的UBC847、UBC846，引物(UBC847序列：CAC ACA CAC ACA CAC ARC，UBC846－CAC ACA CAC ACA CAC ART) 由上海生工合成。
3)黑鲷、杂交子代及回交子代等3个种类的ISSR引物的PCR反应总体积为25μl，包括：1 μl引物(10pmol/L)，DNA模板约1～1.5μl(15～20ng)，Buffer 2.5μl，dNTP 0.5μl，Mg2+1.5μl， Taq聚合酶0.25μl，添加ddH2O补足到25μl。PCR扩增参数为：94℃预变性5min，然后进入循环：94℃45s，56/54℃45s，72℃45s，共36个循环，最后一个循环结束后再在72℃继续延伸10min。
ISSR反应体系的制备(10个反应离心管体积进行配制)
| 试剂 | ddH2O | 10*buffer | Mg2+ | dNTP | Taq酶 | 引物 | DNA模板 |
| 体积/μl | 177.5 | 25 | 15 | 5 | 2.5 | 10 | 15 |
3)PCR扩增产物的凝胶电泳条件：制备好1.5％琼脂糖凝胶后；吸取3μl的PCR产物，与1μl 的溴酚蓝混匀，点入胶孔，同时加点2μl标准marker分子量一起跑胶；电压为110～120V，电泳时间为30～40min后；通过凝胶成像系统，检测PCR产物的DNA条带分布。
4)黑鲷、杂交子代及回交子代的鉴别：由引物UBC847的PCR扩增产物电泳结果中，黑鲷在分子量750～1000bp处有一特异性条带，而其它两个种类的个体没有此扩增带；采用引物 UBC846，反交样本没有任何扩增条带，由此可以把黑鲷、回交、反交等3个种中个体分别鉴别出来(图1)。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省海洋水产研究所
<120> 一种区分黑鲷鱼及其两种杂交子代的ISSR分子标记方法
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cacacacaca cacacart 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cacacacaca cacacarc 18
Claims (2)
1.一种区分黑鲷鱼及其两种杂交子代的ISSR分子标记方法，包括：
（1）分别提取黑鲷、回交及杂交子代3个种质个体的总DNA，4℃以下保存备用；其中，杂交子代为黑鲷♀×真鲷♂反交F1，记作HF1；回交后代为黑鲷♀×HF1，记作BF1；
（2）采用ISSR-UBC846、ISSR-UBC847引物对上述总DNA进行PCR扩增；其中，所述ISSR-UBC846的序列为：CAC ACA CAC ACA CAC ART；所述ISSR-UBC847的序列为：CAC ACA CACACA CAC ARC；
所述PCR扩增反应体系为：10 pmol/L引物1 μl，DNA 模板1.5 μl，Buffer 2.5 μl，dNTP0.5 μl，Mg2+ 1.5 μl，Taq 聚合酶0.25 μl，添加ddH2O至25 μl；
所述PCR扩增反应条件为：94 ℃预变性5 min，然后进入循环：94 ℃ 45 s，56 ℃ 45s，72 ℃ 45 s，共36个循环，最后一个循环结束后再在72 ℃继续延伸10 min，4℃保存；
（3）凝胶电泳检测PCR产物的DNA条带情况，其中引物ISSR-UBC847的PCR扩增产物的电泳图谱中，黑鲷个体在750~1000 bp间仅有一扩增带，而其它两种鱼的个体无此扩增带；而在引物ISSR-UBC846的PCR扩增产物的电泳图谱中，反交鱼个体无扩增带，其它两种有，据此鉴别出黑鲷、回交或杂交子代的个体。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的凝胶电泳检测条件为：制备浓度为1.5%琼脂糖凝胶后，吸取PCR产物3 μl与1 μl的溴酚蓝混匀，点入胶孔；同时，添加Marker标准分子量2 μl一起跑胶；电压为110~120V，电泳时间为30~40 min后，通过凝胶成像系统，结合Marker标准分子量条带分布，分析各个体DNA条带情况。
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| GR01 | Patent grant | ||
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