CN114480403B - 一种多瘤种结合核酸适配体及其肿瘤检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多瘤种结合核酸适配体及其肿瘤检测中的应用，核酸适配体，为一段长度为40bp的核苷酸序列，SYL‑6序列（SEQ ID）：1，5’‑CTAGGAGTGGTTATAAGGCGTAGGGGAAGGCGGGTCCA GG‑3’，应用于制备肿瘤检测试剂中。本发明基于Cell‑SELEX技术，筛选获得多瘤种结合核酸适配体，为多种癌症的早期诊断和治疗奠定一定的技术基础，也为不同类型的肿瘤提供一种普适的早期诊断分子识别工具，后续可制备为通用肿瘤检测试剂，一种试剂能检测多种类型的肿瘤，为肿瘤检测的便利化和低成本化提供可能。

Description

一种多瘤种结合核酸适配体及其肿瘤检测中的应用
技术领域
本发明属于癌症的生物医学诊治技术领域，具体涉及一种多瘤种结合核酸适配体及其肿瘤检测中的应用。
背景技术
近年来,癌症的发病率逐年增加,是导致人类死亡的主要原因之一，对人类健康和生命构成极大威胁。然而癌症早期的体征和症状不明显，各种肿瘤标志物也较少，难以实现早期诊断，因此，筛选具有高灵敏度的分子识别探针对各种癌症的早期诊断、转移和疗效评估等具有很重要的意义。
核酸适配体是一段能够高特异性、高亲和力结合靶标的单链DNA或RNA，由体外指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选获得，核酸适配体具有易合成、成本低、低毒性、穿透性强及修饰可控且化学稳定性好等优势，且易于与各种材料偶联，为各种癌症的特异识别、早期诊断、病理分型，肿瘤靶向治疗等提供了非常有效的方法。例如，将核酸适配体与荧光基团、放射性同位素等指示剂偶联后，可用于肿瘤细胞的成像与检测，从而用于提示肿瘤类型和病变程度等信息。
目前，针对单一瘤种的核酸适配体已有了较多报道，但是能够结合多种肿瘤细胞的核酸适配体鲜有报道，为此，我们提出一种多瘤种结合核酸适配体及其肿瘤检测中的应用，为不同类型的肿瘤提供一种普适的早期诊断分子识别工具。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种多瘤种结合核酸适配体及其肿瘤检测中的应用，筛选获得多瘤种结合核酸适配体，为多种癌症的早期诊断和治疗奠定一定的技术基础，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种多瘤种结合核酸适配体，为一段长度为40bp的核苷酸序列，具体如下：
SYL-6序列（SEQ ID）：
5’-CTAGGAGTGGTTATAAGGCGTAGGGGAAGGCGGGTCCAGG-3’。
一种多瘤种结合核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：
步骤一 文库的构建及相关引物设计
筛选所用文库为单链DNA文库，每条单链DNA总长度为80nt，中间为40nt的随机序列，5’端与3’端各有20nt的引物序列，每条DNA单链可表示为：
5’-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-40nt-TGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’；
文库制备过程中，所有DNA单链正向引物的5’端均带有FAM染料，以便后续使用流式细胞仪测定结合情况，可表示为：
5’-FAM-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-3’；
所有DNA单链反向引物的5’端均带有生物素标记，以便于通过链霉亲和素修饰的琼脂糖微珠分离正义链与反义链，从而用于后续筛选，可表示为：
5’-Biotin-TACTTCCGCACCCTCCTACA-3’；
文库构建及引物合成均由生工生物技术有限公司(中国上海)完成和提供；
步骤二 Cell-SELEX筛选
第一轮至第三轮的初步筛选过程中，首先将单链DNA文库溶解于结合缓冲液（Binding Buffer，BB）中，95℃加热5 min使其变性，之后与靶细胞KYSE450/PTX在4℃孵育60 min；孵育完成后，使用洗涤缓冲液（Washing Buffer，WB）洗脱未与靶细胞结合的DNA单链，收集结合的DNA单链；
第四轮以及之后的复筛过程中，首先使用对照细胞KYSE450进行反筛选，与DNA文库在4℃孵育30 min，之后使用WB洗脱与对照细胞结合的DNA单链，收集未结合的DNA单链；筛选产物得到富集后，将筛选出的DNA单链进行克隆并测序；
步骤三 筛选富集过程中的监测
筛选富集过程中，对于筛选或富集结果的监测，利用流式细胞检测技术，通过检测文库与细胞结合的FAM荧光值来进行监测判定；
步骤四 筛选富集结果
随着正筛选和反筛选的逐步进行，在筛选富集轮数增加的同时，与KYSE450/PTX细胞特异性结合的ssDNA也逐渐在文库中富集，在筛选富集至第15轮时，对部分轮次筛选富集产物与KYSE450/PTX和KYSE450细胞结合的情况作图，根据图中数据判断文库中与食管癌KYSE410细胞结合的ssDNA富集是否达到饱和。
进一步地，步骤二中，为了获得高亲和力高特异性的核酸适配体，实验过程中逐步增加筛选压力，增加筛选压力方法为减少正筛选孵育时间，从60min逐步减少到30 min、增加反筛选孵育时间，从30min逐步增加到60 min或增加洗涤时间，从30 s逐步增加到80 s。
进一步地，步骤三中，当需要判定富集效果时，将靶细胞KYSE450/PTX细胞与对照细胞KYSE450细胞分别与250nM的DNA文库在4℃孵育45 min，之后洗脱于结合缓冲液中，以初始文库的荧光值为对照，然后流式检测文库与细胞结合的FAM荧光值。
进一步地，将筛选富集产物进行高通量测序，得到测序结果后，通过重复数分析、同源性分析和进化树分析，综合挑选确定SYL-6作为目的核酸适配体，具体序列如下：
SYL-6（40bp）：5’-CTAGGAGTGGTTATAAGGCGTAGGGGAAGGCGGGTCCAGG-3’。
进一步地，通过NUPACK软件对上述确定的SYL-6的结构进行分析模拟。
一种多瘤种结合核酸适配体的应用，应用于制备肿瘤检测试剂中。
利用一种多瘤种结合核酸适配体的肿瘤细胞检测方法，包括如下步骤：
步骤S1 样品处理，对待测样品进行预处理；
步骤S2 孵育和检测判定，将核酸适配体与处理后待测样品进行共孵育，孵育结束后，流式检测或共聚焦成像。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本一种多瘤种结合核酸适配体及其肿瘤检测中的应用，具有以下好处：
本发明基于Cell-SELEX技术，筛选获得多瘤种结合核酸适配体，为多种癌症的早期诊断和治疗奠定一定的技术基础，也为不同类型的肿瘤提供一种普适的早期诊断分子识别工具，后续可制备为通用肿瘤检测试剂，一种试剂能检测多种类型的肿瘤，为肿瘤检测的便利化和家庭化提供可能。
附图说明
图1为本发明中筛选过程中文库富集监测结果对比图；
图2为本发明中SYL-6的二级结构示意图；
图3为本发明中SYL-6与KYSE450/PTX和KYSE450细胞结合能力考察对比图；
图4为本发明中激光共聚焦验证SYL-6与KYSE450/PTX和KYSE450细胞结合情况示意图；
图5为本发明中SYL-6与KYSE450/PTX和KYSE450细胞结合解离常数对比图；
图6为本发明中不同孵育温度情况下检测结果对比图；
图7为本发明中SYL-6与不同细胞结合考察对比图；
图8为本发明中SYL-6与不同病人肿瘤组织结合考察对比图；
图9为本发明中SYL-6结合靶点的初步鉴定示意图。
其中，图8中，A-F和M-R分别为食管癌组织、结肠癌组织、乳腺癌组织、肝细胞癌组织、前列腺癌组织和肾癌组织；G-L和S-X分别为相应的正常组织。SYL-6标记Cy5以进行共聚焦成像，Cy5标记的Library为对照探针。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-9，本实施例提供一种技术方案：
本发明的一个方面，实施例一
一种多瘤种结合核酸适配体，为一段长度为40bp的核苷酸序列，具体如下：
SYL-6序列（SEQ ID）：
5’-CTAGGAGTGGTTATAAGGCGTAGGGGAAGGCGGGTCCAGG-3’。
一种多瘤种结合核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：
步骤一 文库的构建及相关引物设计
筛选所用文库为单链DNA文库，每条单链DNA总长度为80nt，中间为40nt的随机序列，5’端与3’端各有20nt的引物序列，每条DNA单链可表示为：
5’-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-40nt-TGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’；
文库制备过程中，所有DNA单链正向引物的5’端均带有FAM染料，以便后续使用流式细胞仪测定结合情况，可表示为：
5’-FAM-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-3’；
所有DNA单链反向引物的5’端均带有生物素标记，以便于通过链霉亲和素修饰的琼脂糖微珠分离正义链与反义链，从而用于后续筛选，可表示为：
5’-Biotin-TACTTCCGCACCCTCCTACA-3’；
文库构建及引物合成均由生工生物技术有限公司(中国上海)完成和提供；
步骤二 Cell-SELEX筛选
第一轮至第三轮的初步筛选过程中，首先将单链DNA文库溶解于结合缓冲液（Binding Buffer，BB）中，95℃加热5 min使其变性，之后与靶细胞KYSE450/PTX在4℃孵育60 min；孵育完成后，使用洗涤缓冲液（Washing Buffer，WB）洗脱未与靶细胞结合的DNA单链，收集结合的DNA单链；
第四轮以及之后的复筛过程中，首先使用对照细胞KYSE450进行反筛选，与DNA文库在4℃孵育30 min，之后使用WB洗脱与对照细胞结合的DNA单链，收集未结合的DNA单链；筛选产物得到富集后，将筛选出的DNA单链进行克隆并测序；
为了获得高亲和力高特异性的核酸适配体，实验过程中逐步增加筛选压力，增加筛选压力方法为减少正筛选孵育时间，从60min逐步减少到30 min、增加反筛选孵育时间，从30min逐步增加到60 min或增加洗涤时间，从30 s逐步增加到80 s；
步骤三 筛选富集过程中的监测
筛选富集过程中，对于筛选或富集结果的监测，利用流式细胞检测技术，通过检测文库与细胞结合的FAM荧光值来进行监测判定；当需要判定富集效果时，将靶细胞KYSE450/PTX细胞与对照细胞KYSE450细胞分别与250nM的DNA文库在4℃孵育45 min，之后洗脱于结合缓冲液中，以初始文库的荧光值为对照，然后流式检测文库与细胞结合的FAM荧光值；
步骤四 筛选富集结果
随着正筛选和反筛选的逐步进行，在筛选富集轮数增加的同时，与KYSE450/PTX细胞特异性结合的ssDNA也逐渐在文库中富集，在筛选富集至第15轮时，对部分轮次筛选富集产物与KYSE450/PTX和KYSE450细胞结合的情况作图，如图1所示，根据图中数据判断文库中与食管癌KYSE410细胞结合的ssDNA富集是否达到饱和。
分析结果可以看出，随着筛选轮数增加，文库与KYSE450/PTX细胞结合测得的荧光值不断增加，在第8轮时已有明显升高，但在第15轮时已基本饱和，且在KYSE450细胞中也观测到了同样的文库富集过程，说明在筛选过程中，与KYSE450/PTX细胞及KYSE450细胞结合的核酸适配体已经得到了充分富集。
基于上述第15轮筛选富集后结果，可以基本认为文库中与食管癌KYSE450/PTX和KYSE450细胞结合的ssDNA富集已经达到饱和。
将筛选富集产物进行高通量测序，得到测序结果后，通过重复数分析、同源性分析和进化树分析，综合挑选确定SYL-6作为目的核酸适配体，具体序列如下：
SYL-6（40bp）：5’-CTAGGAGTGGTTATAAGGCGTAGGGGAAGGCGGGTCCAGG-3’。
通过NUPACK软件对上述确定的SYL-6的结构进行分析模拟，其二级结构图如图2所示。
本发明中，生物材料：食管癌耐药细胞KYSE450/PTX、食管癌细胞KYSE450及实施例中其他类型细胞系均由郑州大学基础医学院病理生理学系提供。本实验以紫杉醇耐药食管癌细胞系KYSE450/PTX和非耐药食管癌细胞系KYSE450作为筛选对象筛选核酸适配体。
本发明的另一方面，一种多瘤种结合核酸适配体的应用，应用于制备肿瘤检测试剂中。
利用一种多瘤种结合核酸适配体的肿瘤细胞检测方法，包括如下步骤：
步骤S1 样品处理，对待测样品进行预处理；
步骤S2 孵育和检测判定，将核酸适配体与处理后待测样品进行共孵育，孵育结束后，流式检测或共聚焦成像。
实验例一
对SYL-6核酸适配体的具体性能进行了进一步测定分析，相关实验过程及结果如下。
（一）SYL-6与原始文库结合能力的区别
根据实施例一中的筛选富集监测方法，对实施例一中确定的SYL-6核酸适配体和原始文库Library与细胞的结合能力进行进一步检测，流式检测结果如图3所示；从3可以看出，与原始文库Library进行对比，SYL-6核酸适配体与KYSE450/PTX和KYSE450细胞结合的荧光强度显著升高，说明SYL-6能很好的与KYSE450/PTX和KYSE450细胞结合。
（二）激光共聚焦实验的直观验证
将细胞传代至激光共聚焦培养皿中培养24h，用PBS洗涤两遍后，分别与250nM的Library、SYL-6在结合缓冲液中于冰上孵育45min，孵育完成后，用PBS洗涤两次以去除未结合的Library、SYL-6，随后进行共聚焦成像。
利用激光共聚焦显微镜（FV1000, Olympus，Japan）可以清晰显示和观察SYL-6链以及对照链Library与KYSE450/PTX和KYSE450细胞结合情况。结果如图4所示，分析可以看出，与Library相比，SYL-6链与KYSE450/PTX和KYSE450细胞均有明显结合。
（三）SYL-6与KYSE450/PTX和KYSE450细胞解离常数Kd（即，核酸适配体的亲和力）测定
将KYSE450/PTX和KYSE450细胞与八个不同浓度（浓度梯度分别为：0nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、500nM）的不同的SYL-6分别在4℃（冰上）孵育45 min；孵育完成后使用流式细胞术对荧光值进行检测。
以流式细胞仪测出的Mean-FI值为纵坐标，浓度为横坐标，利用单点吸附方程Y=BmaxX/(Kd+X）模拟解离曲线，测出核酸适配体与靶细胞结合的平衡解离常数。
具体解离曲线图和Kd值结果如下（如图5所示）：
SYL-6与KYSE450/PTX细胞结合拟合出的方程为Y=5288*X /（690.9+X），解离常数Kd值为690.9±269.3nM；
SYL-6与KYSE450细胞结合拟合出的方程为Y=3631*X /（226.9+X），解离常数Kd值为226.9±76.6nM。
（四）Aptamer结合温度考察
实验过程中，孵育温度也会对细胞与核酸适配体的结合情况构成直接影响。为此，发明人对SYL-6与KYSE450/PTX细胞结合时的孵育温度进行了考察。
现有技术中（如前所示筛选富集过程），细胞与核酸适配体孵育时，通常是在4℃（冰上）孵育以避免内吞现象的发生。本实验中，我们将细胞收集到离心管中后，加入核酸适配体，在4℃、25℃、37℃以及40℃条件下进行孵育，45min后离心洗去没有结合的核酸适配体，在流式细胞仪上进行信号测量。
对不同孵育温度（4℃、25℃、37℃及40℃）情况下流式细胞检测结果进行作图，结果如图6所示。
可以看出，在不同温度下，SYL-6均与KYSE450/PTX细胞保留了很好的结合能力。尤其是在37℃下，SYL-6可较好地与KYSE450/PTX细胞结合，表明该核酸适配体具有活体应用的潜力。
（五）SYL-6异性考察
选取一系列的食管癌细胞（KYSE450/PTX、KYSE410/PTX、KYSE70/PTX、KYSE450、KYSE410、KYSE70、KYSE150、KYSE30）以及乳腺癌细胞MCF-7、胃癌细胞HGC27、肺癌细胞EBC-1、结肠癌细胞HCT116、肝癌细胞HepG2、正常肝细胞HL-7702和食管上皮细胞Het-1A，对SYL-6的特异性进行考察。即分别将各种细胞于培养箱中培养，生长至90%时，用无酶消化液消化细胞，收集至离心管中，每种细胞都与SYL-6于冰上（4℃）孵育45min，离心后洗涤两次去除未结合的核酸适配体，使用流式细胞仪测定荧光强度并计算出信背比（SBR）。
结果如图7所示，SYL-6与KYSE450/PTX、KYSE410/PTX、KYSE70/PTX、KYSE450、KYSE410、KYSE70、KYSE30、HCT116、HGC27、EBC-1细胞有明显的结合，而与正常肝细胞HL-7702和食管上皮细胞Het-1A无明显结合，结果表明所得SYL-6具备识别不同瘤种的肿瘤细胞的能力。
（六）SYL-6识别病人不同肿瘤组织能力考察
以12对病人不同癌组织和正常组织为检测对象，以Cy5标记的SYL-6为检测探针，Cy5标记的Library为对照探针，对SYL-6与病人不同癌组织的检测能力进行考察，即将病人石蜡组织切片进行预处理，以修复抗原，然后与SYL-6在结合缓冲液中于4℃孵育45min，用PBS洗涤两次去除未结合的SYL-6，使用共聚焦显微镜进行成像检测。
结果如图8所示，SYL-6可明显地结合食管癌组织、结肠癌组织、乳腺癌组织、肝细胞癌组织、前列腺癌组织和肾癌组织，而基本不结合相应的正常组织，表明SYL-6核酸适配体具备良好的不同癌种组织检测能力，为发展一种广谱的肿瘤检测探针提供基础支持。
（七）SYL-6结合靶点的初步鉴定
以细胞为靶标的核酸适配体的筛选最显著的一个优点就是可以在对细胞表面所有分子都未知的条件下进行筛选。在筛选出SYL-6之后，我们拟对SYL-6结合肿瘤细胞表面的靶点进行初步鉴定。实验中，对SYL-6与靶细胞结合的靶点是否为蛋白质进行验证，主要使用胰蛋白酶（Trypsin）和蛋白酶K（PK）处理细胞以破坏细胞表面蛋白质，随后考察处理后的细胞是否仍与SYL-6结合，若结合受到影响，则证明SYL-6的结合靶点为蛋白质。
首先，我们使用胰蛋白酶细胞消化液与无胰酶细胞消化液处理细胞，将结果进行对比，结果如图9所示，在使用胰蛋白酶消化液处理细胞后，流式细胞术检测出的荧光值大幅下降。
之后，我们使用蛋白酶K处理细胞与非处理组的结果进行对比，如图9所示，使用蛋白酶K处理细胞后，不论是处理3min或是10min，SYL-6与细胞结合都大幅减弱。
根据以上实验结果，可以初步确定SYL-6结合肿瘤细胞表面的靶点为蛋白质，具备作为一种广谱肿瘤靶点蛋白的潜能。
实验过程中，所用细胞系均使用RIMP1640培养基或DMEM培养基培养（根据实验设计及需要，常规添加10%胎牛血清和100U/mL青霉素-链霉素），均在含5% CO2的培养箱中37℃条件下培养。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 郑州大学
<120> 一种多瘤种结合核酸适体及其肿瘤检测应用
<130> 无
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
CTAGGAGTGGTTATAAGGCGTAGGGGAAGGCGGGTCCAGG 40

Claims (2)

1.一种多种肿瘤细胞结合核酸适配体，其特征在于，为一段长度为40bp的核苷酸序列，具体如下：
SYL-6序列：5’-CTAGGAGTGGTTATAAGGCGTAGGGGAAGGCGGGTCCAGG-3’，所述肿瘤细胞选自KYSE450，KYSE410，KYSE30，KYSE70，HCT116，EBC-1或HGC27。
2.根据权利要求1所述的一种多种肿瘤细胞结合核酸适配体在制备肿瘤检测试剂中的应用，所述肿瘤选自KYSE450，KYSE410，KYSE30，KYSE70，HCT116，EBC-1或HGC27细胞所致肿瘤。
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