CN114480247A - 一种固定化生物炭复合材料及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物材料技术领域，公开了一种固定化生物炭复合材料，其是在生物炭的基础上制备微球，然后通过生物酶解制备微载体。本发明制备的微载体复合材料具备较好的生物相容性，而且没有毒性，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种固定化生物炭复合材料及其应用。
背景技术
生物炭是紧密层叠、高度变形的芳香环组成的片状结构，生物炭表面常常分布着密集的微孔，因此比表面积较大，这些性质就使得生物炭具有良好的吸附性能。我国秸秆资源呈现出总量缓慢增长的特点。其中作物秸秆所占比例最大秸秆资源具有可再生性和清洁性，自然界中储量大，并且每年都在不断积累，为人类社会可持续发展提供了资源保障。实现秸秆资源高效利用，同时避免环境污染，是现代社会可持续发展面临的重要问题。作物秸秆可用来制备生物炭，是作物秸秆资源利用的一个有效途径。
微载体培养其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使贴壁细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。它将细胞的贴壁培养变为悬浮培养，这样可以大大增加细胞生长的表面积以提高细胞的生长密度。
细胞附着微载体一般为无机材料，附着力较差，细胞存活力不高。近年来，也有将有机材料包被来解决上述问题，但是往往需要进行交联剂来进行交联，然而，传统的化学交联虽然可以有效改善材料的机械性能和稳定性，但是由于常用的甲醛，戊二醛等，环氧化合物组分和碳化二亚胺等往往具有细胞毒性。现有技术也有将明胶来包被的记载，但是明胶对细胞的粘附能力相对较差，不利于细胞的贴壁培养。
发明内容
为了克服现有技术存在的技术缺陷，本发明旨在提供一种固定化生物炭复合材料。
本发明的又一目的在于提供上述固定化生物炭复合材料的应用。
为达到上述目的，本发明是通过如下技术方案来实现的。
一种固定化生物炭复合材料，其按照如下步骤制备而得：步骤1)制备复合溶液，步骤2)制备生物炭，步骤3)制备生物炭微球，步骤4)制备酪氨酸酶溶液，步骤5)制备复合材料。具体地，所述固定化生物炭复合材料按照如下步骤制备而得：
步骤1)制备复合溶液：
将氯化钙、氨基葡萄糖依次添加到水中，50-500rpm搅拌5-30min，停止搅拌，得到复合溶液；
步骤2)制备生物炭：
将玉米秸秆晾干，粉碎，然后放入炭化炉中，通入氮气，进行炭化，升温至400-600℃，保温1-5h，冷却至室温后取出，过120-300目筛，得到生物炭；
步骤3)制备生物炭微球：
取生物炭加入到海藻酸钠溶液中，搅拌10-60min，充分混合后，将混合液缓慢挤入到CaCl2溶液中，并将得到的凝胶微球在室温下放置1-3h后，去离子水冲洗，再加入复合溶液浸没微球于4℃下交联10-40h，取出微球，用去离子水进行清洗，得到生物炭微球；
步骤4)制备酪氨酸酶溶液：
将酪氨酸酶溶解到pH为7.0的PBS缓冲液中，得到酪氨酸酶溶液；
步骤5)制备复合材料：
将生物炭微球和牛血清白蛋白添加到酪氨酸酶溶液中，升温至25-35℃，搅拌反应10-60min，然后烘干至恒重，最后置于密闭容器无菌保存。
优选地，
所述步骤1)中，
氯化钙∶氨基葡萄糖∶水的比例为2-6g∶40-70g∶1000ml。
优选地，
所述步骤3)中，生物炭和海藻酸钠溶液的比例为1-3g∶20ml。
优选地，
所述海藻酸钠溶液的质量分数为1-3％.
优选地，
所述步骤3)中，CaCl2溶液的质量分数为2-5％。
优选地，
所述步骤5)中，
生物炭微球∶牛血清白蛋白∶酪氨酸酶溶液的比例为5-20g∶1-2g∶10-20ml。
进一步地，其按照如下步骤制备而得：
步骤1)制备复合溶液：
将4g氯化钙、50g氨基葡萄糖依次添加到1000ml水中，100rpm搅拌10min，停止搅拌，得到复合溶液；
步骤2)制备生物炭：
将玉米秸秆晾干，粉碎，然后放入炭化炉中，通入氮气，进行炭化，升温至500℃，保温2h，冷却至室温后取出，过200目筛，得到生物炭；
步骤3)制备生物炭微球：
取2g生物炭加入到20mL质量分数为2％的海藻酸钠溶液中，搅拌30min，充分混合后，将混合液缓慢挤入到质量分数为4％的CaCl2溶液中，将得到的凝胶微球在室温下放置1h后，去离子水冲洗，再加入步骤1)所得复合溶液浸没，于4℃下交联20h，取出，用去离子水进行清洗，得到生物炭微球；
步骤4)制备酪氨酸酶溶液：
将酪氨酸酶溶解到pH为7.0的PBS缓冲液中，得到酶活力为500U/ml的酪氨酸酶溶液；
步骤5)制备复合材料：
将步骤2)所得生物炭微球和牛血清白蛋白按照10g∶1g∶10ml的比例添加到步骤4)所得酪氨酸酶溶液中，升温至30℃，搅拌反应30min，然后烘干至恒重，最后置于密闭容器无菌保存，即得。
本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本发明通过研磨煅烧制得生物炭，制备成表面包被氨基葡萄糖的微球，酪氨酸酶能够氧化白蛋白中的酪氨酸残基，使得白蛋白上的酪氨酸残基与氨基葡萄糖上的碱性基团发生共价交联反应，从而将白蛋白吸附在微球表面，而白蛋白具备粘附能力强，对细胞友好等特点，可以用于粘附生物细胞，适合细胞的保存和培养，安全性能和稳定性能高，有利于提升细胞存活率。
氨基葡萄糖是参与人体组织和细胞膜中蛋白多糖合成的中间物质，细胞相容性好，并且具备一定的抗菌抑菌功能；氨基葡萄糖基团与细胞表面的糖敏感受体相互作用，能够实现与细胞的交流，有助于细胞增殖和细胞外基质的合成分泌，为细胞提供一个仿生智能微环境。
本发明微球表面包被均为生物分子，具备较好的生物相容性，而且没有细胞毒性，应用前景广阔。
本发明复合材料密度与培养基密度接近，处于悬浮状态，增加细胞生长的表面积以提高细胞的生长密度，有利于高密度快速培养动物工程细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明使用的方法，如无特殊说明均为常规方法。本发明使用的材料，如无特殊标注说明，均为现有常规材料，可以通过商业化购买获得。
实施例1
一种固定化生物炭复合材料，其按照如下步骤制备而得：
制备复合溶液：
将4g氯化钙、50g氨基葡萄糖依次添加到1000ml水中，100rpm搅拌10min，停止搅拌，得到复合溶液；
制备生物炭：
将玉米秸秆晾干，粉碎，然后放入炭化炉中，通入氮气，进行炭化，升温至500℃，保温2h，冷却至室温后取出，过200目筛，得到生物炭；
制备微球：
取2g生物炭加入到20mL质量分数为2％的海藻酸钠溶液中，搅拌30min，充分混合后，将混合液缓慢挤入到质量分数为4％的CaCl2溶液中，并将得到的凝胶微球在室温下放置1h后，去离子水冲洗，再加入复合溶液浸没微球于4℃下交联20h，取出微球，用去离子水进行清洗，得到生物炭微球；
制备酪氨酸酶溶液：
将酪氨酸酶(TYR，CAS：9002-10-2)溶解到pH为7.0的PBS缓冲液中，得到酶活力为500U/ml的酪氨酸酶溶液；
制备复合材料：
将生物炭微球和牛血清白蛋白按照10g∶1g∶10ml的比例添加到酪氨酸酶溶液中，升温至30℃，搅拌反应30min，然后烘干至恒重，最后置于密闭容器无菌保存，即为复合材料微球。
实施例2
一种固定化生物炭复合材料，其按照如下步骤制备而得：
制备复合溶液：
将4g氯化钙、40g氨基葡萄糖依次添加到1000ml水中，200rpm搅拌5min，停止搅拌，得到复合溶液；
制备生物炭：
将玉米秸秆晾干，粉碎，然后放入炭化炉中，通入氮气，进行炭化，升温至500℃，保温1h，冷却至室温后取出，过250目筛，得到生物炭；
制备微球：
取2g生物炭加入到20mL质量分数为2.5％的海藻酸钠溶液中，搅拌20min，充分混合后，将混合液缓慢挤入到质量分数为4％的CaCl2溶液中，并将得到的凝胶微球在室温下放置1h后，去离子水冲洗，再加入复合溶液浸没微球于4℃下交联30h，取出微球，用去离子水进行清洗，得到生物炭微球；
制备酪氨酸酶溶液：
将酪氨酸酶(TYR，CAS：9002-10-2)溶解到pH为7.0的PBS缓冲液中，得到酶活力为500U/ml的酪氨酸酶溶液；
制备复合材料：
将生物炭微球和牛血清白蛋白按照15g∶2g∶20ml的比例添加到酪氨酸酶溶液中，升温至30℃，搅拌反应30min，然后烘干至恒重，最后置于密闭容器无菌保存。
实施例3
一种固定化生物炭复合材料，其按照如下步骤制备而得：
制备复合溶液：
将5g氯化钙、40g氨基葡萄糖依次添加到1000ml水中，150rpm搅拌25min，停止搅拌，得到复合溶液；
制备生物炭：
将玉米秸秆晾干，粉碎，然后放入炭化炉中，通入氮气，进行炭化，升温至550℃，保温2h，冷却至室温后取出，过200目筛，得到生物炭；
制备微球：
取2g生物炭加入到20mL质量分数为3％的海藻酸钠溶液中，搅拌30min，充分混合后，将混合液缓慢挤入到质量分数为4％的CaCl2溶液中，并将得到的凝胶微球在室温下放置2h后，去离子水冲洗，再加入复合溶液浸没微球于4℃下交联25h，取出微球，用去离子水进行清洗，得到生物炭微球；
制备酪氨酸酶溶液：
将酪氨酸酶(TYR)溶解到pH为7.0的PBS缓冲液中，得到酶活力为500U/ml的酪氨酸酶溶液；制备复合材料：
将生物炭微球和牛血清白蛋白按照10g∶1.5g∶10ml的比例添加到酪氨酸酶溶液中，升温至28℃，搅拌反应20min，然后烘干至恒重，最后置于密闭容器无菌保存。
实施例4
一种固定化生物炭复合材料，其按照如下步骤制备而得：
制备复合溶液：
将5g氯化钙、60g氨基葡萄糖依次添加到1000ml水中，120rpm搅拌20min，停止搅拌，得到复合溶液；
制备生物炭：
将玉米秸秆晾干，粉碎，然后放入炭化炉中，通入氮气，进行炭化，升温至500℃，保温1h，冷却至室温后取出，过300目筛，得到生物炭；
制备微球：
取3g生物炭加入到20mL质量分数为3％的海藻酸钠溶液中，搅拌50min，充分混合后，将混合液缓慢挤入到质量分数为3％的CaCl2溶液中，并将得到的凝胶微球在室温下放置2h后，去离子水冲洗，再加入复合溶液浸没微球于4℃下交联20h，取出微球，用去离子水进行清洗，得到生物炭微球；
制备酪氨酸酶溶液：
将酪氨酸酶(TYR)溶解到pH为7.0的PBS缓冲液中，得到酶活力为500U/ml的酪氨酸酶溶液；制备复合材料：
将生物炭微球和牛血清白蛋白按照10g∶2.5g∶10ml的比例添加到酪氨酸酶溶液中，升温至29℃，搅拌反应20min，然后烘干至恒重，最后置于密闭容器无菌保存。
对比例1
参照实施例1，将牛血清白蛋白替换为等量的明胶。
对比例2
参照实施例1，将牛血清白蛋白替换为等量的多聚精氨酸。
实施例5
各组别制备的复合微球材料性能参数比较。
主要比较了粒径分布、平均粒径和密度等重要参数，具体见表1：
表1
结论：复合微球材料(微载体)的粒径200-250之间最合适动物细胞贴壁培养，实施例1的粒径控制在200-300nm之间，平均粒径为237nm，更适合动物细胞的贴壁。培养基的浓度略高于水，一般为1.1g/ml以内，考虑到搅拌因素，微载体密度为1.1g/ml左右悬浮效果更好，与对比例相比较，实施例1的微载体密度为1.08g/ml，分散状态更加均匀，适合动物细胞得高密度培养。
实施例6
细胞悬浮培养试验
实验细胞选用PK-15(porcine kidney cell)工程细胞。培养基选用DMEM培养基(添加10％小牛血清)。
通过常规方法对PK-15细胞复苏和种子放大培养，获得细胞密度为细胞接种液，然后接种到生物反应器中，控制生物反应器(100L)的装液体积为70L，微球的添加量为20g/L液体，通气量为2.5升/min，设定转速为80rpm/分钟，温度37℃；培养时间为72h。将细胞进行台盼蓝染色，血球计数板计算活、死细胞数，计算细胞存活率和细胞密度。具体结果见表2：
表2
结论：与对比例1-2比较，PK-15细胞既能均匀的固定贴附于本发明实施例1微载体表面，使细胞快速生长，同时为后续生长的细胞预留充裕的生长表面积，细胞密度和存活率均优于对比例1-2；与商业化的微载体相比较，和Cytodexl在细胞密度差异不大，存活率略高，比Cotopore2相比较，本发明细胞密度更高，细胞存活率接近。上述培养试验表明本发明微载体适合PK-15工程细胞的规模化悬浮生长，可以替代现有商业化的微载体用于动物细胞的大规模培养。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种固定化生物炭复合材料，其按照如下步骤制备而得：步骤1)制备复合溶液，步骤2)制备生物炭，步骤3)制备生物炭微球，步骤4)制备酪氨酸酶溶液，步骤5)制备复合材料。
2.根据权利要求1所述的固定化生物炭复合材料，其特征在于，所述固定化生物炭复合材料按照如下步骤制备而得：
步骤1)制备复合溶液：
将氯化钙、氨基葡萄糖依次添加到水中，50-500rpm搅拌5-30min，停止搅拌，得到复合溶液；
步骤2)制备生物炭：
将玉米秸秆晾干，粉碎，然后放入炭化炉中，通入氮气，进行炭化，升温至400-600℃，保温1-5h，冷却至室温后取出，过120-300目筛，得到生物炭；
步骤3)制备生物炭微球：
取生物炭加入到海藻酸钠溶液中，搅拌10-60min，充分混合后，将混合液缓慢挤入到CaCl2溶液中，并将得到的凝胶微球在室温下放置1-3h后，去离子水冲洗，再加入复合溶液浸没微球于4℃下交联10-40h，取出微球，用去离子水进行清洗，得到生物炭微球；
步骤4)制备酪氨酸酶溶液：
将酪氨酸酶溶解到pH为7.0的PBS缓冲液中，得到酪氨酸酶溶液；
步骤5)制备复合材料：
将生物炭微球和牛血清白蛋白添加到酪氨酸酶溶液中，升温至25-35℃，搅拌反应10-60min，然后烘干至恒重，最后置于密闭容器无菌保存。
3.根据权利要求2所述的固定化生物炭复合材料，其特征在于，所述步骤1)中，
氯化钙∶氨基葡萄糖∶水的比例为2-6g∶40-70g∶1000ml。
4.根据权利要求2所述的固定化生物炭复合材料，其特征在于，所述步骤3)中，生物炭和海藻酸钠溶液的比例为1-3g∶20ml。
5.根据权利要求2所述的固定化生物炭复合材料，其特征在于，所述海藻酸钠溶液的质量分数为1-3％。
6.根据权利要求2所述的固定化生物炭复合材料，其特征在于，所述步骤3)中，CaCl2溶液的质量分数为2-5％。
7.根据权利要求2所述的固定化生物炭复合材料，其特征在于，所述步骤5)中，
生物炭微球∶牛血清白蛋白∶酪氨酸酶溶液的比例为5-20g∶1-2g∶10-20ml。
8.根据权利要求1所述的固定化生物炭复合材料，其特征在于，其按照如下步骤制备而得：
步骤1)制备复合溶液：
将4g氯化钙、50g氨基葡萄糖依次添加到1000ml水中，100rpm搅拌10min，停止搅拌，得到复合溶液；
步骤2)制备生物炭：
将玉米秸秆晾干，粉碎，然后放入炭化炉中，通入氮气，进行炭化，升温至500℃，保温2h，冷却至室温后取出，过200目筛，得到生物炭；
步骤3)制备生物炭微球：
取2g生物炭加入到20mL质量分数为2％的海藻酸钠溶液中，搅拌30min，充分混合后，将混合液缓慢挤入到质量分数为4％的CaCl2溶液中，将得到的凝胶微球在室温下放置1h后，去离子水冲洗，再加入步骤1)所得复合溶液浸没，于4℃下交联20h，取出，用去离子水进行清洗，得到生物炭微球；
步骤4)制备酪氨酸酶溶液：
将酪氨酸酶溶解到pH为7.0的PBS缓冲液中，得到酶活力为500U/ml的酪氨酸酶溶液；
步骤5)制备复合材料：
将步骤2)所得生物炭微球和牛血清白蛋白按照10g∶1g∶10ml的比例添加到步骤4)所得酪氨酸酶溶液中，升温至30℃，搅拌反应30min，然后烘干至恒重，最后置于密闭容器无菌保存，即得。
9.权利要求1-8所述的固定化生物炭复合材料在细胞悬浮培养中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细胞为动物细胞。
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