CN110283730A - 溶液共混法包埋复合微生态制剂的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及固定化技术，以海藻酸钠(SA)、聚乙烯醇(PVA)为原料，氯化钙、硼酸为交联剂，添加少量改性沸石粉为载体，加入复合微生态制剂菌液，制备成PVA‑SA‑沸石粉共聚物微球包埋体。本发明生产工艺简单易于操作、生产原料高效、安全、可降解、易于推广和应用。在海参养殖中应用，可以提高复合微生态制剂的净水效果，延长水质净化时间，相比于菌液的产品形式更易于保存和运输，解决了微生态制剂在应用过程中存在的作用周期短、运输和储藏不便的问题。

Description

溶液共混法包埋复合微生态制剂的工艺
技术领域
本发明涉及固定化技术，特别是涉及一种复合微生态制剂固定化制备共聚物凝胶微球的方法。
背景技术
目前该复合微生态制剂已经用于水产养殖，主要是刺参养殖业中，可以直接泼洒到养殖水体中，也可作为饲料添加剂使用，有净化养殖水体水质、促进刺参生长、提高刺参肠道内消化酶活性的作用。但是在实际应用中存在运输不方便、保质期短、作用效果不稳定的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明采用溶液共混法以海藻酸钠(SA)、聚乙烯醇(PVA)为原料，氯化钙、硼酸为交联剂，添加少量沸石粉为载体，加入复合微生态制剂菌液，制备成PVA-SA-沸石粉共聚物微球。聚乙烯醇(PVA)无毒，有较好的传质性能和化学稳定性和可降解性，是一种理想的生物材料，海藻酸钠(SA)是从海藻的细胞膜中提取的一种天然多糖，它有着良好的生物相容性和生物可降解性，有无毒性和成本较低的特点，被广泛应用于药物输送与组织工程领域，这两种材料近年来被广泛用于生物及医药行业，特别是将这两种材料共混制成的PVA-SA复合材料，有弹性好、柔韧性大、含水量高的特点。将复合微生态制剂包埋于PVA-SA-沸石粉微球中，将菌固定于特定的区域，达到持续作用的效果。对比菌液产品易于携带、便于保藏、节省空间，解决了菌液运输不便，保藏期短的问题，在水产养殖业中可以进行推广。
本发明通过以下技术方案实现：
一种利用溶液共混法包埋复合微生态制剂的工艺，包括以下步骤：
步骤a.复合微生态制剂菌悬液的制备：
芽孢杆菌：来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC20037-枯草芽孢杆菌。
乳酸菌：来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCC11016-植物乳杆菌。
酿酒酵母：来自中国农业微生物菌种保藏管理中心中国微生物菌种保藏库，编号为ACCC20165-酿酒酵母。
光合细菌：来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CCREMSDMCC150016-球形红细菌。
将以上4种菌按照接种量3％(各属种比1:1:1:1)同时接菌，在25℃，初始pH为7.0，180rpm/min条件下混合培养24h，得到复合微生态制剂菌液。在4℃、10000rpm/min转速下离心5min，弃上清后，用生理盐水洗涤三次并离心收集菌体，最后用生理盐水定容至适当浓度；
步骤b.包埋材料处理：分别称取6g PVA、3g SA加入到100mL蒸馏水中，90℃水浴加热，恒温搅拌1h，即配成质量分数为6％的PVA溶液，3％的SA溶液；称取3g CaCl2固体、4g硼酸固体溶于100mL蒸馏水中，即配成质量分数为3％的CaCl2硼酸交联剂；将斜发沸石浸泡盐酸中24h，冲洗至中性后烘干，再放入饱和NaCl溶液中浸泡24h，去离子水冲洗至中性，105℃下烘干3h，粉碎过筛，即制得改性沸石粉；
步骤c.共聚物凝胶的配制：将6％的PVA溶液，3％的SA溶液按照体积比1:1(50mL:50mL)比例混合，加入2g改性沸石粉，水浴锅恒温90℃搅拌1h，即得到共聚物凝胶；
步骤d.制微球：用注射器吸取共聚物凝胶，在磁力搅拌下，距交联剂液面上方5cm左右垂直滴入，然后低温固定24h，蒸馏水冲洗三次即得PVA-SA-沸石粉微球，4℃冰箱冷藏；
其中，步骤a中复合微生态制剂为4种菌混合发酵而成的复合微生态制剂，有净化养殖水体水质、促进刺参生长、提高刺参肠道内消化酶活性的作用。
进一步地，在上述技术方案中，步骤c中采用钠性沸石粉，粒径≤100目。
进一步地，在上述技术方案中，步骤d中微球直径为4mm。
发明有益效果
1、本发明采用微生物固定化技术，将有净水效果的复合微生态制剂包埋成PVA-SA-沸石粉微球，提高了该复合微生态制剂对人工污水中氨氮、化学需氧量、硫化物的净化效果，并延长了作用时间。
2、本发明所用聚乙烯醇(PVA)无毒，有较好的传质性能和化学稳定性和可降解性，是一种理想的生物材料，海藻酸钠(SA)是从海藻的细胞膜中提取的一种天然多糖，它有着良好的生物相容性和生物可降解性，有无毒性和成本较低的特点，所制得的PVA-SA-沸石粉微球对环境无污染，是一种安全、绿色的产品。
3、本发明生产工艺简单易于操作，生产原料来源广泛、成本低易于推广，生产周期短，产品质量好，易于应用和推广。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
步骤a、制备复合微生态制剂种子液：用YPD培养基30℃培养酵母(ACCC20165)24h；LB肉汤培养基30℃培养芽孢杆菌(CICC20037)24h，LB肉汤培养基30℃培养光合细菌(CCREMSDMCC150016)48h；MRS培养基30℃培养乳酸菌(ACCC11016)48h；
其中YPD培养基、肉汤培养基和MRS培养基配方如下：
LB肉汤培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水1L，pH6.8-7.0；
YPD培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，蒸馏水1L；
MRS培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，无水乙酸钠5g/L，K2HPO4 2g/L，柠檬酸三铵2g/L，MgSO4 0.2g/L，MnSO4 0.05g/L，蒸馏水1L，pH 6.2-6.4；
步骤b、制备复合微生态制剂菌悬液：将芽孢杆菌、乳酸菌、酿酒酵母、光合细菌共4种菌按照接种量3％(各属种比1:1:1:1)同时接菌，在25℃，初始pH为7.0，180rpm/min条件下混合培养24h，得到复合微生态制剂菌液。在4℃、10000rpm/min转速下离心5min，弃上清后，用生理盐水洗涤三次并离心收集菌体，最后用生理盐水定容至浓度为1012cfu/ml，得复合微生态制剂菌悬液。
步骤c、包埋材料处理：分别称取6g PVA、3g SA加入到100mL蒸馏水中，90℃水浴加热，恒温搅拌1h，即配成质量分数为6％的PVA溶液，3％的SA溶液；将斜发沸石浸泡盐酸中24h，冲洗至中性后烘干，再放入饱和NaCl溶液中浸泡24h，去离子水冲洗至中性，105℃下烘干3h，粉碎过筛，即制得改性沸石粉；
步骤d、共聚物凝胶的配制：将6％的PVA溶液，3％的SA溶液按照体积比1:1(50mL:50mL)比例混合，加入2g改性沸石粉，水浴锅恒温90℃搅拌1h，即得到共聚物凝胶；
步骤e、制备微球：用注射器吸取共聚物凝胶，在磁力搅拌下，距交联剂液面上方5cm左右垂直滴入，然后低温(4℃)固定24h，蒸馏水冲洗三次即得PVA-SA-沸石粉微球，4℃冰箱冷藏；交联剂液采用称取3g CaCl2固体、4g硼酸固体溶于100mL蒸馏水中制得凝胶；无菌条件下，用移液枪取复合微生态制剂菌悬液加入冷却的凝胶溶液中，按菌液：凝胶的体积比为1：15混合均匀，即得交联剂。
PVA-SA-沸石粉微球的感官评价结果和包埋效果见表1-1：
表1-1实施例1的微球评价
对实施例1中PVA-SA-沸石粉微球进行净水能力测试，并与未包埋的复合微生态制剂进行比较。具体操作为：无菌条件下，挑选制备好的完整无破损的PVA-SA-沸石粉微球100个，加入到人工污水中。测试结果如下表所示，PVA-SA-沸石粉微球具有较好的净水效果：
表1-2 PVA-SA-沸石粉微球净水能力测定结果(％)
实施例2
步骤a、制备复合微生态制剂种子液：用YPD培养基30℃培养酵母(ACCC20165)24h；LB肉汤培养基30℃培养芽孢杆菌(CICC20037)24h，LB肉汤培养基30℃培养光合细菌(CCREMSDMCC150016)48h；MRS培养基30℃培养乳酸菌(ACCC11016)48h；
其中YPD培养基、肉汤培养基和MRS培养基配方如下：
LB肉汤培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水1L，pH6.8-7.0；
YPD培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，蒸馏水1L；
MRS培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，无水乙酸钠5g/L，K2HPO4 2g/L，柠檬酸三铵2g/L，MgSO4 0.2g/L，MnSO4 0.05g/L，蒸馏水1L，pH 6.2-6.4；
步骤b、制备复合微生态制剂菌悬液：将芽孢杆菌CICC20037，乳酸菌ACCC11016，酿酒酵母ACCC20165，光合细菌CCREMSDMCC150016共4种菌按照接种量3％(各属种比1:1:1:1)同时接菌，在25℃，初始pH为7.0，180rpm/min条件下混合培养24h，得到复合微生态制剂菌液。在4℃、10000rpm/min转速下离心5min，弃上清后，用生理盐水洗涤三次并离心收集菌体，最后用生理盐水定容至浓度为1015cfu/ml；
步骤c、包埋材料处理：分别称取6g PVA、3g SA加入到100mL蒸馏水中，90℃水浴加热，恒温搅拌1h，即配成质量分数为6％的PVA溶液，2％的SA溶液；将斜发沸石浸泡盐酸中24h，冲洗至中性后烘干，再放入饱和NaCl溶液中浸泡24h，去离子水冲洗至中性，105℃下烘干3h，粉碎过筛，即制得改性沸石粉；
步骤d、共聚物凝胶的配制：将6％的PVA溶液，3％的SA溶液按照体积比1:1(50mL:50mL)比例混合，加入2g改性沸石粉，水浴锅恒温90℃搅拌1h，即得到共聚物凝胶；
步骤e、制备微球：用注射器吸取共聚物凝胶，在磁力搅拌下，距交联剂液面上方5cm左右垂直滴入，然后低温(4℃)固定24h，蒸馏水冲洗三次即得PVA-SA-沸石粉微球，4℃冰箱冷藏；交联剂液采用称取3g CaCl2固体、4g硼酸固体溶于100mL蒸馏水中制得凝胶；无菌条件下，用移液枪取复合微生态制剂菌悬液加入冷却的凝胶溶液中，按菌液：凝胶的体积比为1：15混合均匀，即得交联剂。
PVA-SA-沸石粉微球的感官评价结果和菌体包埋率见表2-1：
表2-1实施例2的微球评价
对实施例1中PVA-SA-沸石粉微球进行净水能力测试，并与未包埋的复合微生态制剂进行比较。具体操作为：无菌条件下，挑选制备好的完整无破损的PVA-SA-沸石粉微球100个，加入到人工污水中。结果表明PVA-SA-沸石粉微球具有较好的净水效果，结果如表2-2：
表2-2.PVA-SA-沸石粉微球净水能力测定结果(％)

Claims (4)

1.一种利用溶液共混法包埋复合微生态制剂的工艺，包括以下步骤：
a.复合微生态制剂菌悬液的制备：将芽孢杆菌CICC20037，乳酸菌ACCC11016，酿酒酵母ACCC20165，光合细菌CCREMSDMCC150016共4种菌按照各属种比1:1:1:1，接种量为3％同时接菌，在25℃，初始pH为7.0，180rpm/min条件下混合培养24h，得到复合微生态制剂菌液；在4℃、10000rpm/min转速下离心5min，弃上清后，用生理盐水洗涤三次并离心收集菌体，最后用生理盐水定容至浓度为1012-1015cfu/mL，得复合微生态制剂菌悬液；
步骤b.共聚物凝胶的配制：将6％的PVA溶液，3％的SA溶液按照体积比1:1比例混合，加入2g改性沸石粉，水浴锅恒温90℃搅拌1h，即得到共聚物凝胶；
所述6％的PVA溶液采用称取6g聚乙烯醇、加入到100mL蒸馏水中，90℃水浴加热，恒温搅拌1h，即配成质量分数为6％的PVA溶液；3％的SA溶液采用称取3g海藻酸钠加入到100mL蒸馏水中，90℃水浴加热，恒温搅拌1h，即配成质量分数为3％的SA溶液；
所述改性沸石粉采用将沸石浸泡盐酸中24h，冲洗至中性后烘干，再放入饱和NaCl溶液中浸泡24h，去离子水冲洗至中性，105℃下烘干3h，粉碎过筛，即制得改性沸石粉；
步骤c.PVA-SA-沸石粉微球的制备：用注射器吸取共聚物凝胶，在磁力搅拌下，距交联剂液面上方5cm左右垂直滴入，然后低温固定24h，蒸馏水冲洗三次即得PVA-SA-沸石粉微球，于4℃冰箱冷藏；
所述交联剂液采用称取3g CaCl2固体、4g硼酸固体溶于100mL蒸馏水中制得凝胶；无菌条件下，取复合微生态制剂菌悬液加入冷却的凝胶溶液中，按菌液：凝胶的体积比为1：15混合均匀，即得交联剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中复合微生态制剂为4种菌混合发酵而成的复合微生态制剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中沸石粉为钠性沸石粉，粒径≤100目。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中PVA-SA-沸石粉微球直径为4mm。
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