CN114480228A - 缓解代谢综合征的益生菌及其代谢产物配方及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种缓解代谢综合征的益生菌及其代谢产物配方及其应用。缓解代谢综合征的益生菌配方，其特征在于，所述的益生菌配方为罗伊氏乳杆菌PLBK®1、罗伊氏乳杆菌PLBK®2、加氏乳杆菌PLBK®3、嗜酸乳杆菌PLBK®4、乳双歧杆菌PLBK®5中的一种或数种、它或它们的发酵培养物，或，它和/或它们的代谢产物。本发明具体涉及五株自主分离、鉴定和专利保藏的益生菌及其发酵代谢产物（后生元）的核心成分及其在缓解代谢综合征中的应用，具体在促进白色脂肪分解的应用机理，应用该发明能够降低脂肪堆积，促进脂肪分解，改善胰岛素敏感性，缓解脂肪肝，并有望应用于代谢性综合征的防治。

Description

缓解代谢综合征的益生菌及其代谢产物配方及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及缓解代谢综合征的益生菌及其代谢产物（后生元）配方及其应用。
背景技术
代谢性综合症，例如：肥胖、糖尿病，（非）酒精性脂肪肝的发生和发展严重威胁人类健康，给国家和家庭带来沉重的经济负担和医疗压力。目前，饮食和运动干预是预防和早期干预治疗代谢综合征的有效手段，但是该手段多数人群较难坚持且存在周期长和反弹迅速的问题。服用药物降低食欲、临床手术减重等手段具有较强的副作用。研究发现代谢综合征的发生和发展常伴有肠道菌群紊乱和系统糖脂代谢稳态失衡的问题，以益生菌和合生元为代表的微生态制剂干预后能改善肠道菌群微环境、促进排便及辅助改善系统糖脂和能量代谢稳态；其主要通过宿主吸收益生菌分泌的代谢产物，调控宿主系统糖脂代谢稳态。利用前期筛选的专利益生菌菌株和优化的发酵工艺得到益生菌及其代谢产物混合物（也被称作后生元）。通过16S测序、全基因组测序以及进化树构建，我们分离的菌株不同于目前发现的菌株，代谢组学鉴定五株菌的代谢产物，发现并鉴定其代谢产物的成分具有抑制脂肪合成和促进脂肪分解的作用。本发明的主要提供数据支撑益生菌及其代谢产物服用能够显著促进白色脂肪的米色化，显著改善和缓解代谢综合征的病程。
发明内容
本发明的目的在于提供了能够抑制脂肪堆积，促进脂肪分解，改善胰岛素敏感性，缓解脂肪肝，并有望应用于缓解代谢综合征的益生菌及其代谢产物（后生元）配方及其应用。
本发明的第一个目的是提供能够抑制脂肪堆积，促进脂肪分解，改善胰岛素敏感性，缓解脂肪肝，并有望应用于缓解代谢综合征的益生菌配方，所述的益生菌配方为罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®1、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®2、加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）PLBK®3、嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus）PLBK®4、乳双歧杆菌（Bifdobacterium lactis）PLBK®5中的一种或数种、它和/或它们的发酵培养物，或，它或它们的代谢产物；
所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®1，其于2019年10月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No: 60828。
所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®2，其于2019年10月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No: 60829。
所述的加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）PLBK®3，其于2019年10月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No: 60830。
所述的嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus）PLBK®4，其于2019年10月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No: 60831。
所述的乳双歧杆菌（Bifdobacterium lactis）PLBK®5，其于2019年10月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No: 60832。
本发明的第二个目的是提供上述益生菌配方在制备缓解代谢综合征产品中的应用。
优选，所述的缓解代谢综合征是降低脂肪堆积、促进脂肪分解、改善胰岛素敏感性和/或缓解脂肪肝。
优选，所述的产品可以是缓解代谢综合征的食品、保健品或药物。
进一步优选，所述的益生菌配方，其是罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®1、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®2、加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）PLBK®3、嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus）PLBK®4、乳双歧杆菌（Bifdobacterium lactis）PLBK®5菌液或代谢产物的混合物，其含菌量是10^9 cfu/ml以上。进一步优选是10^9 cfu/ml。
优选，所述的混合物中，罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®1、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®2、加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）PLBK®3、嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus）PLBK®4、乳双歧杆菌（Bifdobacterium lactis）PLBK®5的数量比是0.75:0.75:1:1.5:1。
本发明属于微生物技术领域，具体涉及五株自主分离、鉴定和专利保藏的益生菌及其发酵代谢产物（后生元）的核心成分及其在缓解代谢综合征中的应用。还公开了该益生菌及其发酵代谢产物（后生元）在促进白色脂肪分解的应用机理，应用该发明能够抑制脂肪堆积，促进脂肪分解，改善胰岛素敏感性，缓解脂肪肝，并有望应用于代谢综合征的防治。
罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®1，其于2019年10月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No: 60828。
罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®2，其于2019年10月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No: 60829。
加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）PLBK®3，其于2019年10月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No: 60830。
嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus）PLBK®4，其于2019年10月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No: 60831。
乳双歧杆菌（Bifdobacterium lactis）PLBK®5，其于2019年10月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No: 60832。
附图说明：
图1是罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®1的全基因组测序菌株基因环状功能图谱；
图2是罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®2的全基因组测序菌株基因环状功能图谱；
图3是加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）PLBK®3的全基因组测序菌株基因环状功能图谱；
图4是嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus）PLBK®4的全基因组测序菌株基因环状功能图谱；
图5是乳双歧杆菌（Bifdobacterium lactis）PLBK®5的全基因组测序菌株基因环状功能图谱；
图6是(A)罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri PLBK®1，PLBK®2）进化图谱、(B)加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri PLBK®3）进化图谱、(C)嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus PLBK®4）进化图谱、(D)乳双歧杆菌（Bifdobacterium lactis PLBK®5）进化图谱；
图7是5株益生菌菌株发酵代谢产物鉴定图；
图8是纯化的5株益生菌菌株发酵代谢产物鉴定图；
图9是小鼠的肛门温度（A），小鼠的糖耐量（GTT， B），小鼠粪便悬浮时间（C）和小鼠体重增长（D）图；
图10是益生菌及其代谢产物干预促进代谢表型的改善图；
图11是益生菌及其代谢产物干预治疗代谢综合征的改善图；
图12是益生菌及其代谢产物干预预防代谢综合征的发生和发展图；
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制，本发明的保护范围不限于以下具体实施例。
实施例1：
一、实验方法
1、益生菌菌株类别及专利保藏编号
本发明通过筛选和分离获得了5株益生菌，通过16S测序（16S 全长扩增引物，16S_Forw: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG, 16S_Rev: GGTTACCTTGTTACGACTT）、全基因组测序环状功能图谱（提取菌株发酵菌泥核酸，建库进行二代测序，测序平台为Ilumina Hiseq X10）以及进化树构建，获得罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®1、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®2、加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）PLBK®3、嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus）PLBK®4、乳双歧杆菌（Bifdobacterium lactis）PLBK®5基因组信息，具体信息如下：
罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®1，其于2019年10月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No: 60828。其16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全基因组测序菌株基因环状功能图谱如图1所示，进化图谱如图6所示。
罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®2，其于2019年10月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No: 60829。其16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，全基因组测序菌株基因环状功能图谱如图2所示，进化图谱如图6所示。
加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）PLBK®3，其于2019年10月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No: 60830。其16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，全基因组测序菌株基因环状功能图谱如图3所示，进化图谱如图6所示。
嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus）PLBK®4，其于2019年10月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No: 60831。其16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，全基因组测序菌株基因环状功能图谱如图4所示，进化图谱如图6所示。
乳双歧杆菌（Bifdobacterium lactis）PLBK®5，其于2019年10月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No: 60832。其16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，全基因组测序菌株基因环状功能图谱如图5所示，进化图谱如图6所示。
⒉发酵培养基：
乳杆菌，包含但不仅限于罗伊氏乳杆菌，加氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌使用优化的MRS培养基：蛋白胨（10g/L），牛肉浸粉（8g/L），酵母浸粉（4g/L），葡萄糖（20g/L），磷酸氢二钾（2g/L），柠檬酸氢二胺（2g/L），乙酸钠（5g/L），硫酸镁（0.2g/L），硫酸锰（0.04g/L），溶剂为水，具体制备方法是将各成分混合均匀，灭菌备用。
双歧杆菌使用优化的双歧杆菌培养基：蛋白胨（15g/L），葡萄糖（20g/L），酵母浸粉（2g/L），可溶性淀粉（0.5g/L），氯化钠（5g/L），L-半胱氨酸（0.5g/L），番茄浸粉（5g/L），肝浸粉（2g/L），溶剂为水，具体制备方法是将各成分混合均匀，灭菌备用。
3、益生菌发酵和制备工艺：将乳杆菌或双歧杆菌分别接种于5ml灭菌的MRS液体培养基或双歧杆菌液体培养基中，厌氧培养增菌24小时，然后将5ml 菌液，转移至1L的培养基进行厌氧发酵扩增48小时。发酵结束后，离心收取菌泥，上清菌液通过0.22μm滤膜过滤获得过滤上清液备用。通过涂板计数益生菌cfu后，用过滤上清液重悬菌泥获得10^9 cfu/ml单菌株菌液，然后将5个单菌株菌液按照体积比PLBK®1: PLBK®2: PLBK®3: PLBK®4: PLBK®5=0.75:0.75:1:1.5:1的比例混合获得混合益生菌菌液，用于以下实验。
4、益生菌代谢产物制备工艺：菌种发酵液，离心，上清液过滤（0.22 μm），由此得到各菌株的发酵代谢产物，再按照体积等比例混合五株菌发酵代谢产物，获得混合益生菌发酵代谢产物，4 ℃保藏。
5、益生菌代谢产物纯化工艺：
A、将500ml 0.22 μm滤膜过滤得到的益生菌发酵上清液倒于分液漏斗中，随后再向其中倒入500ml的乙酸乙酯；
B、水平摇动分液漏斗2分钟以充分混匀两种液体；
C、将分液漏斗转移至通风橱中，室温静置5分钟，使液体充分分层；
D、重复步骤B和步骤D三至四次，此时可观察到上层液体呈黄棕色透明状，下层液体呈棕色。（上层液体为油相：上清液中可溶于乙酸乙酯的物质；下层液体为水相：上清液中不可溶于乙酸乙酯的物质）。
E、在分液漏斗的下口处放置一个500ml三角瓶，用来盛放下层液体；
F、打开分液漏斗的上活塞，使漏斗内外气压保持一致，随后拧开分液漏斗的下活塞使下层液体排放至三角瓶内。此时可将较少的上层液体也一同排放至三角瓶，以排除液体分层处的干扰。
G、排放结束后，关闭下活塞。下层液体从上口倒出至旋转瓶内；
H、将旋转瓶连接旋转蒸发仪，将旋转瓶的1/4瓶身浸泡于水浴锅中，调整旋转蒸发仪的水浴锅数值为45℃，打开旋转蒸发仪的总开关。
I、待旋转瓶内的液体蒸发至不再减少时，关闭总开关，取下旋转瓶；并向旋转瓶内加入2-3ml的乙酸乙酯，充分混匀，用移液管将旋转瓶内的液体转移至样本瓶；
J、将样本瓶连接旋转蒸发仪，将样本瓶的1/4瓶身浸泡于水浴锅中，调整旋转蒸发仪的水浴锅数值为45℃，打开旋转蒸发仪的总开关。
K、待样本瓶内的液体蒸发至不再减少时，关闭总开关，取下样本瓶，此时瓶内的液体即为500ml菌液上清液初步萃取的物质。由此获得每种益生菌菌的浓缩代谢产物（水相）。
6、健康模型后益生菌及其代谢产物干预实验模型：14周龄C57BL/6J小鼠常规饮食（rodent chow，北京科澳协力饲料，2012，大小鼠维持饲料），12周常规饮食饲养后，进行混合益生菌菌液干预12周，设立1个实验组（混合益生菌组postbiotics）和一个对照组纯水，混合益生菌菌液和纯水分别添加至小鼠饮水瓶中，自由饮用，每周监测小鼠体重增长，干预结束后检测糖耐量（GTT）和胰岛素耐量（ITT），免疫组化评估白色脂肪米色样变，油红染色检测肝脏脂肪累积情况。
7、代谢综合征的单菌株和混合菌株功能比较：14周龄C57BL/6J小鼠60%高脂饮食（HFD, D12492, Research Diets, Inc., Brunswick, NJ）饲养24周，期间进行单菌株菌液和混合益生菌菌液干预24周，设立6个实验组（罗伊氏乳杆菌PLBK®1、罗伊氏乳杆菌PLBK®2、加氏乳杆菌PLBK®3、嗜酸乳杆菌PLBK®4、乳双歧杆菌PLBK®5和混合益生菌组postbiotics）和一个对照组（MRS，同等剂量的MRS培养基），益生菌单菌株菌液、混合益生菌菌液和MRS培养基分别添加至小鼠饮水瓶中，自由饮用，每周监测小鼠的小鼠体重增长，干预结束后检测小鼠肛门温度、糖耐量、和小鼠粪便悬浮时间。
8、代谢综合征的益生菌及其代谢产物治疗实验模型：14周龄C57BL/6J小鼠60%高脂饮食（HFD, D12492, Research Diets, Inc., Brunswick, NJ）建模（12周），第13周开始，进行混合益生菌菌液干预12周，设立1个实验组（混合益生菌组postbiotics）和一个对照组纯水，混合益生菌菌液和纯水分别添加至小鼠饮水瓶中，自由饮用，每周监测小鼠体重增长，干预结束后检测糖耐量（GTT）和胰岛素耐量（ITT），免疫组化评估白色脂肪米色样变，油红染色检测肝脏脂肪累积情况。
9、代谢综合征的益生菌及其代谢产物预防实验模型：14周龄C57BL/6J小鼠60%高脂饮食（HFD, D12492, Research Diets, Inc., Brunswick, NJ）同时，进行混合益生菌菌液干预24周，设立1个实验组（混合益生菌组postbiotics）和一个对照组（MRS培养基中加质量分数30% 葡萄糖Glucose），混合益生菌菌液和MRS培养基中加质量分数30% 葡萄糖Glucose分别添加至小鼠饮水瓶中，自由饮用，每周监测小鼠体重增长，干预结束后检测糖耐量（GTT）和胰岛素耐量（ITT），免疫组化评估白色脂肪米色样变，油红染色检测肝脏脂肪累积情况。
⒑糖耐量实验（GTT）
A、称重、计算葡萄糖注射量。小鼠称重后，按2 mg/g体重计算各老鼠葡萄糖注射体积。为方便辨认小鼠，称重后在小鼠尾巴根部或尾尖用marker笔做好标记。
B、基础血糖测定。消毒酒精棉擦拭小鼠尾部后剪小段尾巴测定基线血糖值（0 分钟），弃掉第一滴血。
C、葡萄糖注射。腹腔注射葡萄糖溶液后立即开始计时，并测定注射后15 分钟、30分钟、60 分钟、90 分钟、120 分钟时的血糖值，测量方法为重新开放尾部伤口，弃去第一滴血，测第2滴血血糖值。
D、依次测定其他小鼠在注射葡萄糖后，各时间点的血糖值，做好记录。
⒒胰岛素耐量实验（ITT）：
A、称重、计算葡萄糖注射量。小鼠称重后，按2 mg/g体重计算各老鼠胰岛素注射体积。为方便辨认小鼠，称重后在小鼠尾巴根部或尾尖用marker笔做好标记。
B、基础血糖测定。消毒酒精棉擦拭小鼠尾部后剪小段尾巴测定基线血糖值（0 分钟）。
C、胰岛素注射。腹腔注射葡萄糖溶液后立即开始计时，并测定注射后15 分钟、30分钟、60 分钟、90 分钟、120 分钟时的血糖值，测量方法为重新开放尾部伤口，弃去第一滴血，测第2滴血血糖值。要时刻注意小鼠精神状态，若见小鼠状态不好，则立即向小鼠注射葡萄糖。
⒓肝脏组织冰冻切片油红O染色：
A、将肝脏冰冻切片（6μm）从-80℃冰箱取出，室温放置1小时使玻片晾干；
B、用阻水笔将组织切片隔开；
C、组织固定：用1%PFA室温固定切片30分钟；
D、用PBS清洗组织片三次，每次5分钟；
E、染色：使用稀释后的油红染料，室温染色1小时（将600μl未稀释的油红O染色液加入到400μl的蒸馏水中，并用0.45μm的滤膜过滤后使用）；
F、弃染色液，再用PBS清洗组织切片3遍；
G、染细胞核：用苏木素染色2分钟；
H、用甘油明胶封片，镜下观察。
⒔组织HE染色：脱腊、水化后片子在苏木素中浸泡 2分钟；准备一个空的染色盒，装满自来水，清洗3-5遍，直至无色。随后立即用0.3%盐酸酒精分化，快速涮3s。最后在空的染色盒里重新接满自来水，上下提，稀释盐酸酒精，终止反应。
二、实验结果
1、5株益生菌菌株发酵代谢产物鉴定结果如图7所示。5株益生菌在发酵后，通过0.22μM滤膜过滤后，获得发酵上清液，MRS培养基作为空白对照，进行LC-MS/MS 质谱分析其中代谢物，代谢物成分和含量通过与MRS空白对照对比，获得益生菌发酵产生的代谢物。
2、纯化的5株益生菌菌株发酵代谢产物鉴定如图8所示。5株益生菌在发酵后，通过0.22μM过滤乙酸乙酯浓缩，收集下层（水相）的代谢物，通过低温浓缩蒸干，获得浓缩1000x的代谢物，通过LC-MS/MS 质谱分析其中代谢物，代谢物成分和含量通过与MRS空白对照对比，获得益生菌发酵产生的代谢物。
3、如图9所示，图9A、9B和9C中的柱子从左到右分别为：HFD+MRS、HFD+Postbiotics、HFD+Lactobacillus reuteri PLBK®1、HFD+Lactobacillus reuteri PLBK®2、HFD+Lactobacillus gasseri PLBK®3、HFD+Lactobacillus acidophilus PLBK®4、HFD+Bifdobacterium lactis PLBK®5，C57BL6/J小鼠喂食60% HFD同时，进行混合菌株及其代谢物（Postbiotics）干预，我们检测了小鼠的肛门温度（图9A），小鼠的糖耐量（GTT，图9B），小鼠粪便悬浮时间（图9C）和小鼠体重增长（图9D），结果显示，混合菌株及其代谢物干预的小鼠的基础代谢率显著高于任何单一菌株、其机体糖耐量也显著优于单一菌株，粪便悬浮实验结果显示，混合菌株及其代谢物干预的小鼠脂肪吸收效率最低，大量脂肪残留在粪便中，因此，悬浮时间最长。由上可见，混合菌株及其代谢物优于单一菌株激活机体能量代谢，增强机体抵抗60%高脂饮食（HFD）带来的代谢性紊乱。
4、如图10所见（图10中所有的柱状图中，每组2个柱子其左边的为NCD+H2O，右边的为NCD+Postbiotics），小鼠自由食用NCD饲料（正常饮食组）和纯水12周后，随后利用后生元（混合益生菌菌液）干预肥胖小鼠。经过12周后生元干预后小鼠体重增加缓慢、体型小（图10A.C）。肝脏及白色脂肪组织与小鼠自身体重比例下降，证明后生元可减少机体脂质的累积（图10 B）。后生元干预后能促进健康小鼠的胰岛素敏感性（图10 D-E）。通过HE染色，后生元干预后，棕色和白色脂肪组织中油泡面积明显减小，说明后生元促进了脂肪组织产热（图10F）。同时血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和谷丙转氨酶水平较对照组明显下降，高密度脂蛋白胆固醇与对照组相比含量明显增加，证明后生元可以进一步改善血脂（图10H）。在棕色脂肪组织和白色脂肪组织的mRNA和蛋白水平也可见部分产热标志物表达量相对增加（图10I-L），由此推测造成脂肪组织油泡面积减小的原因可能是组织产热耗能增加。由上可见，健康饮食小鼠，益生菌及其代谢产物干预促进代谢表型的改善。
5、如图11所示（图11中所有的柱状图中，每组2个柱子其左边的为HFD+H2O，右边的为HFD+Postbiotics），小鼠自由食用HFD饲料和纯水12周后小鼠体重出现差异，证明饮食诱导肥胖小鼠建模成功。为了证明后生元是否能够控制高脂饮食诱导肥胖小鼠的体重以及改善糖脂代谢，随后利用后生元干预已经构建成功的肥胖小鼠12周。经过12周后生元干预后与对照组相比，实验组小鼠体重增加缓慢、体型小（图11 A，C）。肝脏及三种脂肪组织（棕色脂肪、白色脂肪和腹股沟脂肪）与小鼠自身体重比例下降，证明后生元可减少机体脂质的累积（图11 B）。后生元干预后能改善的高脂饮食诱导肥胖小鼠的胰岛素抵抗，并且血糖可以降至与正常小鼠类似的水平（图11 D-E）。高脂饮食加剧了小鼠肝脏、棕色和白色脂肪组织中的脂质累积。后生元干预后，肝脏及脂肪组织中脂质积累的情况得以改善，白色脂肪组织中油泡面积明显减小并能恢复到正常状态（图11 F-G）。高脂饮食诱导肥胖小鼠的白色脂肪组织在后生元干预后产热标志物过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同刺激因子(Ppargc1 α)和解偶联蛋白1(Ucp1)表达量明显增加（图11 H）。同时血清总甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和谷丙转氨酶水平明显降低，证明后生元可以改善高脂饮食导致的血脂紊乱（图11 I）。在棕色脂肪组织和白色脂肪组织的mRNA和蛋白水平也可见部分产热标志物表达量相对增加（图11 J-M），由此推测造成脂肪组织油泡面积减小的原因可能是组织产热耗能增加。由上可见，60%高脂饲料诱导构建代谢综合征，益生菌及其代谢产物干预治疗代谢综合征。
6、如图12所示（图12中所有的柱状图中，每组2个柱子其左边的为HFD+30%Glucose+MRS，右边的为HFD+Postbiotics（metabolites）），为了证明后生元是否能够抑制潜在肥胖小鼠的体重增长以及维持机体能量代谢稳定，设计了另一种动物模型，即在野生型C57BL/6J小鼠自由食用HFD饲料的同时利用后生元干预小鼠（潜在肥胖模型），对照组利用含糖量为30%的MRS肉汤培养基（通过试剂盒检测发现，细菌在MRS肉汤培养基发酵后菌液内含糖量为原始MRS肉汤培养基的30%）。实验结果发现经过后生元干预的小鼠较对照组小鼠体重增加缓慢、体型小，未见明显脂肪肝（图12 A.C）。白色脂肪和腹股沟脂肪与小鼠自身体重比例下降，证明后生元可减少机体脂质的累积（图12 B）。棕色脂肪组织和肝脏组织未见此现象的可能原因是由后生元干预后的小鼠自身体重较低，棕色脂肪组织和肝脏组织重量增加不明显，二者相比后结果反而降低。后生元干预后能改善的潜在肥胖小鼠的胰岛素抵抗，并可使潜在肥胖小鼠的血糖降至与正常小鼠类似的水平（图12 D-E）。通过HE染色发现，对照组中的棕色脂肪组织和白色脂肪组织的油泡面积明显增大，而在后生元处理后脂肪组织中的油泡面积缩小（图12 F-G）。对于肝脏组织冰冻切片的油红O染色可观察到，实验组中的油红着色明显少于对照组，未见脂滴相互融合的现象。并且通过油红着色的面积可发现后生元可减少脂质在肝脏组织中的蓄积（图12 G）。血脂谱也有明显好转的趋势（图12 H）。在棕色脂肪组织的mRNA和蛋白水平也可见部分产热标志物表达量增加（图12 I-J）。而白色脂肪组织只有在mRNA水平上可见部分产热标志物表达量增加。（图12 K-L）。由上可见，60%高脂饲料诱导代谢综合征的同时，益生菌及其代谢产物干预预防代谢综合征的发生和发展。
序列表
<110> 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)
<120> 缓解代谢综合征的益生菌及其代谢产物配方及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1475
<212> DNA
<213> 罗伊氏乳杆菌PLBK1®(Lactobacillus reuteri )
<400> 1
tggcgcggcg gtgtgctata catgcagtcg tacgcacggg cccaactgat tgatggtgct 60
tgcacctgat tgacgatgga tcaccagtga gtggcggacg ggtgagtaac acgtaggtaa 120
cctgccccgg agcgggggat aacatttgga aacagatgct aataccgcat aacaacaaaa 180
gccacatggc ttttgtttga aagatggctt tggctatcac tctgggatgg acctgcggtg 240
cattagctag ttggtaaggt aacggcttac caaggcgatg atgcatagcc gagttgagag 300
actgatcggc cacaatggaa ctgagacacg gtccatactc ctacgggagg cagcagtagg 360
gaatcttcca caatgggcgc aagcctgatg gagcaacacc gcgtgagtga agaagggttt 420
cggctcgtaa agctctgttg ttggagaaga acgtgcgtga gagtaactgt tcacgcagtg 480
acggtatcca accagaaagt cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540
tggcaagcgt tatccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttg cttaggtctg 600
atgtgaaagc cttcggctta accgaagaag tgcatcggaa accgggcgac ttgagtgcag 660
aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg tggaatgcgt agatatatgg aagaacacca 720
gtggcgaagg cggctgtctg gtctgcaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga 780
acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg agtgctaggt gtttggaggg 840
tttccgccct tcagtgccgg agctaacgca ttaagcactc cgcctgggag tacgaccgca 900
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aagctacgcg aagaccttac caggtcttga catcttgcgc taaccttaga ggataaggcg 1020
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cactctagtg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggacgacgt cagatcatca 1200
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taacctttat ggaggagccg ctaagcgaca gtgcg 1475
<210> 2
<211> 1475
<212> DNA
<213> 罗伊氏乳杆菌PLBK2®(Lactobacillus reuteri)
<400> 2
tggcgcggcg gtgtgctata catgcagtcg tacgcacggg cccaactgat tgatggtgct 60
tgcacctgat tgacgatgga tcaccagtga gtggcggacg ggtgagtaac acgtaggtaa 120
cctgccccgg agcgggggat aacatttgga aacagatgct aataccgcat aacaacaaaa 180
gccacatggc ttttgtttga aagatggctt tggctatcac tctgggatgg acctgcggtg 240
cattagctag ttggtaaggt aacggcttac caaggcgatg atgcatagcc gagttgagag 300
actgatcggc cacaatggaa ctgagacacg gtccatactc ctacgggagg cagcagtagg 360
gaatcttcca caatgggcgc aagcctgatg gagcaacacc gcgtgagtga agaagggttt 420
cggctcgtaa agctctgttg ttggagaaga acgtgcgtga gagtaactgt tcacgcagtg 480
acggtatcca accagaaagt cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540
tggcaagcgt tatccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttg cttaggtctg 600
atgtgaaagc cttcggctta accgaagaag tgcatcggaa accgggcgac ttgagtgcag 660
aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg tggaatgcgt agatatatgg aagaacacca 720
gtggcgaagg cggctgtctg gtctgcaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga 780
acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg agtgctaggt gtttggaggg 840
tttccgccct tcagtgccgg agctaacgca ttaagcactc cgcctgggag tacgaccgca 900
aggttgaaac tcaaagaatt gacgggggcc cgcacaagcg tggagcatgt ggttgatttc 960
aagctacgcg aagaccttac caggtcttga catcttgcgc taaccttaga ggataaggcg 1020
ttcccttcgg ggacgcaatg acaggtggtg catggtcgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1080
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taacctttat ggaggagccg ctaagcgaca gtgcg 1475
<210> 3
<211> 1449
<212> DNA
<213> 加氏乳杆菌PLBK3®(Lactobacillus gasseri)
<400> 3
gggatgggcg gcgtgctata catgcagtcg agcgagcttg cctagatgaa tttggtgctt 60
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tcgtaaagct ctgttggtag tgaagaaaga tagaggtagt aactggcctt tatttgacgg 480
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cgaaggcggc tctctggtct gcaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag 780
gattagatac cctggtagtc catgccgtaa acgatgagtg ctaagtgttg ggaggtttcc 840
gcctctcagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtgcg accgcaaggt 900
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agcaacgcga ggagcctgta ccagtcttga cgtccagtgc aaaccgagga gattaggagt 1020
acctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080
gtcattagtt gccatcatta agttgggcac tctaatgaga ctgccggtga caaaccggag 1140
gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac 1200
aatggacggt acaacgagaa gcgaacctgc gaaggcaagc ggatctctga aagccgttct 1260
cagttcggac tgtaggctgc aactcgccta cacgaagctg gaatcgctag taatcgcgga 1320
tcagcacgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatgag 1380
agtctgtaac acccaaagcc ggtgggataa cctttatagg agtcagccgt ctaagtagac 1440
agggtgggt 1449
<210> 4
<211> 1816
<212> DNA
<213> 嗜酸乳杆菌PLBK4®(Lactobacillus acidophilus)
<400> 4
ggcatggcgg cgtgctatac atgcagtcga gcgagcgtga accaacagat tcacttcggt 60
gatgacgttg ggaacgcgag cggcggatgg gtgagtaaca cgtggggaac ctgccccata 120
gtctgggata ccacttggaa acaggtgcta ataccggata agaaagcaga tcgcatgatc 180
agcttataaa aggcggcgta agctgtcgct atgggatggc cccgcggtgc attagctagt 240
tggtagggta acggcctacc aaggcaatga tgcatagccg agttgagaga ctgatcggcc 300
acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac 360
aatggacgaa agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa 420
gctctgttgt tggtgaagaa ggatagaggt agtaactggc ctttatttga cggtaatcaa 480
ccagaaagtc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt 540
gtccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggaaga ataagtctga tgtgaaagcc 600
ctcggcttaa ccgaggaact gcatcggaaa ctgtttttct tgagtgcaga agaggagagt 660
ggaactccat gtgtagcggt ggaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc 720
ggctctctgg tctgcaactg acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga 780
taccctggta gtccatgccg taaacgatga gtgctaagtg ttggggaggt ttccgcctct 840
cagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggaccgc aaggttgaga 900
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acgagcgcaa cccttgtcat tagttgccag cattaagttg ggcactctaa tgagactgcc 1500
ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catgcccctt atgacctggg 1560
ctacacacgt gctacaatgg acagtacaac gaggagcaag cctgcgaagg caagcgaatc 1620
tcttaaagct gttctcagtt cggactgcag tctgcaactc gactgcacga agctggaatc 1680
gctagtaatc gcggatcagc acgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1740
ccgtcacacc atgggagtct gcaatgccca aagccggtgg cctaacctcg gaaggagccg 1800
tctaagcagc gttgcg 1816
<210> 5
<211> 1439
<212> DNA
<213> 乳双歧杆菌PLBK5®(Bifdobacterium lactis)
<400> 5
gaggcatgtg gcgtgcttac catgcagtcg acgggatccc tggcagcttg ctgtcggggt 60
gagagtggcg aacgggtgag taatgcgtga ccaacctgcc ctgtgcaccg gaatagctcc 120
tggaaacggg tggtaatacc ggatgctccg ctccatcgca tggtggggtg ggaaatgctt 180
ttgcggcatg ggatggggtc gcgtcctatc agcttgttgg cggggtgatg gcccaccaag 240
gcgttgacgg gtagccggcc tgagagggtg accggccaca ttgggactga gatacggccc 300
agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc 360
gacgccgcgt gcgggatgga ggccttcggg ttgtaaaccg cttttgttca agggcaaggc 420
acggtttcgg ccgtgttgag tggattgttc gaataagcac cggctaacta cgtgccagca 480
gccgcggtaa tacgtagggt gcgagcgtta tccggattta ttgggcgtaa agggctcgta 540
ggcggttcgt cgcgtccggt gtgaaagtcc atcgcctaac ggtggatctg cgccgggtac 600
gggcgggctg gagtgcggta ggggagactg gaattcccgg tgtaacggtg gaatgtgtag 660
atatcgggaa gaacaccaat ggcgaaggca ggtctctggg ccgtcactga cgctgaggag 720
cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacggtgga 780
tgctggatgt ggggcccttt ccacgggtcc cgtgtcggag ccaacgcgtt aagcatcccg 840
cctgggagta cggccgcaag gctaaaactc aaagaaattg acggggcccg cacaagcggc 900
ggagcatgcg gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctgggcttg acatgtgccg 960
gatcgccgtg gagacacggt ttcccttcgg ggccggttca caggtggtgc atggtcgtcg 1020
tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc tcgccgcatg 1080
ttgccagcgg gtgatgccgg gaactcatgt gggaccgccg gggtcaactc ggaggaaggt 1140
ggggatgacg tcagatcatc atgcccctta cgtccagggc ttcacgcatg ctacaatggc 1200
cggtacaacg cggtgcgaca cggtgacgtg gggcggatcg ctgaaaaccg gtctcagttc 1260
ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa ggcggagtcg ctagtaatcg cggatcagca 1320
acgccgcggt gaatgcgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcaagtc atgaaagtgg 1380
gtagcacccg aagccggtgg cccgaccctt gtggggggag ccgtctaagt agactcatg 1439

Claims (10)

1.一种缓解代谢综合征的益生菌配方，其特征在于，所述的益生菌配方为罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®1、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®2、加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）PLBK®3、嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus）PLBK®4和乳双歧杆菌（Bifdobacterium lactis）PLBK®5或它们的发酵培养物，或它们的代谢产物；
所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®1，保藏编号：GDMCC No: 60828；
所述的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®2，保藏编号：GDMCC No: 60829；
所述的加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）PLBK®3，保藏编号：GDMCC No: 60830；
所述的嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus）PLBK®4，保藏编号：GDMCC No:60831；
所述的乳双歧杆菌（Bifdobacterium lactis）PLBK®5，保藏编号：GDMCC No: 60832。
2.根据权利要求1所述的益生菌配方，其特征在于，所述的益生菌配方为罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®1、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®2、加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）PLBK®3、嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus）PLBK®4、乳双歧杆菌（Bifdobacterium lactis）PLBK®5菌液和/或代谢产物的混合物。
3.根据权利要求2所述的益生菌配方，其特征在于，所述的混合物中含菌量是10^9 cfu/ml以上。
4.根据权利要求2或3所述的益生菌配方，其特征在于，所述的混合物中，罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®1、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®2、加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）PLBK®3、嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus）PLBK®4、乳双歧杆菌（Bifdobacterium lactis）PLBK®5的数量比为0.75:0.75:1:1.5:1。
5.权利要求1所述的益生菌配方在制备缓解代谢综合征产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的缓解代谢综合征是降低脂肪堆积、促进脂肪分解、改善胰岛素敏感性和/或缓解脂肪肝。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述的产品是缓解代谢综合征的食品、保健品或药物。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的益生菌配方为罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®1、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®2、加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）PLBK®3、嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus）PLBK®4、乳双歧杆菌（Bifdobacterium lactis）PLBK®5菌液和/或代谢产物的混合物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的益生菌配方中，罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®1、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）PLBK®2、加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）PLBK®3、嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus）PLBK®4、乳双歧杆菌（Bifdobacterium lactis）PLBK®5的数量比为0.75:0.75:1:1.5:1。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述的益生菌配方，其含菌量是10^9 cfu/ml以上。
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