CN116509906B - 罗伊氏乳杆菌zj617在改善非酒精性脂肪肝和脂肪堆积中的应用 - Google Patents
罗伊氏乳杆菌zj617在改善非酒精性脂肪肝和脂肪堆积中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种具有改善非酒精性脂肪肝和脂肪堆积的罗伊氏乳杆菌的应用。本发明公开了罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)在制备改善非酒精性脂肪肝、改善脂肪堆积产品中的应用。改善非酒精性脂肪肝包括：罗伊氏乳杆菌ZJ617能缓解肝脏脂质堆积、缓解肝脏损伤及炎症、降低高血脂症、改善葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗。改善脂肪堆积包括：减少脂肪细胞大小、促进机体及白色脂肪组织产热、提高脂肪产热基因表达水平；促进脂肪组织线粒体合成相关基因表达水平、改善脂肪沉积。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种具有改善非酒精性脂肪肝和脂肪堆积的罗伊氏乳杆菌的应用。
背景技术
随着生活方式的巨大变化，包括长期摄入富含果糖、蔗糖和饱和脂肪的饮食以及久坐不动的生活方式，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)已成为许多国家最普遍的肝脏疾病。NAFLD可进展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，可能最终发展为肝硬化和肝细胞癌(HCC)。同时，研究表明，NAFLD患者可能与肥胖、高血脂症和胰岛素抵抗等代谢紊乱特征相关联，即NAFLD可能会增强这些疾病的特征。
除了不良的生活方式外，引起NAFLD的另一个风险因素可能是人类微生物组的进化。研究表明，NAFLD表型可通过转移NAFLD患者微生物组进行传播。NAFLD患者的肠道微生物组，其复杂性也低于健康受试者。而肠道菌群失调引起的肠道内皮屏障功能失调，可能会导致细菌成分易位并导致肝脏炎症。此外，肠道微生物产生的各种代谢物也可能会影响NAFLD的易感性。因此，寻找有效的预防及治疗方法，对延缓非酒精性脂肪肝及相关疾病有重要意义。
另，NAFLD的发生和肥胖密切相关。脂肪的大量堆积是肥胖的特征之一。脂肪组织是一个活跃的代谢器官，其正常代谢涉及到全身能量稳态。白色脂肪组织主要起储存能量的作用，其特征是拥有单室的脂肪细胞和低密度的线粒体，而棕色脂肪则主要用于消耗能量，拥有多室的脂肪细胞和高密度的线粒体。由于成年人及动物体内缺乏棕色脂肪，因此，诱导白色脂肪细胞向棕色样脂肪细胞转化是一种有效的预防和治疗肥胖的策略。
诸多研究表明益生菌干预是一种能改善宿主代谢健康的有效策略。其中，乳酸杆菌作为一种常见且安全的益生菌已被广泛应用至饲料、食品及医疗保健行业。CN114410533A、CN114404459A、CN114344344A、CN111254090A、CN201410012020.0和CN110205261A等专利报道不同的罗伊氏乳杆菌菌株对机体有减脂等作用，但上述菌株均不具备促进白色脂肪产热、诱导白色脂肪细胞向棕色样脂肪细胞转化的功能。
CN104293689A的发明公开了一株高粘附力乳酸杆菌菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏日期2013年12月9日，保藏编号CGMCCNo.8542，菌株编号为ZJ617，分类命名为Lactobacillus reuteri。前期的研究表明该高粘附力的罗伊氏乳杆菌ZJ617具有良好的耐酸性和耐胆盐能力，具有一定的胃肠道定殖能力。饮食补充该菌株能够调控动物肠道屏障功能并缓解LPS诱导的肝脏急性损伤等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种罗伊氏乳杆菌ZJ617在改善非酒精性脂肪肝和脂肪堆积中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillusreuteri ZJ617)在制备改善非酒精性脂肪肝、改善脂肪堆积产品中的应用。
作为本发明应用的改进：罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)的保藏编号CGMCC No.8542。
作为本发明应用的进一步改进：所述非酒精性脂肪肝为高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝。
作为本发明应用的进一步改进：所述改善非酒精性脂肪肝包括：罗伊氏乳杆菌ZJ617能缓解肝脏脂质堆积、缓解肝脏损伤及炎症、降低高血脂症、改善葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗。
作为本发明应用的进一步改进：所述高血脂症包括降低血清甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白。
作为本发明应用的进一步改进：所述脂肪为白色脂肪。
作为本发明应用的进一步改进：所述改善脂肪堆积包括：减少脂肪细胞大小、促进机体及白色脂肪组织产热、提高脂肪产热基因表达水平；促进脂肪组织线粒体合成相关基因表达水平、改善脂肪沉积。
作为本发明应用的进一步改进：所述产热相关基因包括Adrb3、Pgc-1b、Ppara或Pparg；所述线粒体合成相关基因包括Cox5b、Cox7a1或Cox7a2。
作为本发明应用的进一步改进：产品包括但不限于食品、药物、医疗保健品及饲料。
作为本发明应用的进一步改进：产品包括利用罗伊氏乳杆菌制备而得的发酵乳制品、活菌制剂、添加剂。
本发明的目的之一是提供一种罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteriZJ617)在制备改善非酒精性脂肪肝微生态制剂中的应用，在本发明中，采用C57BL/6J小鼠建立高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝动物模型，探究罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillusreuteri ZJ617)干预能否改善小鼠非酒精性脂肪肝，为开发缓解非酒精性脂肪肝的相关功能性产品提供新的理论依据。
本发明的另一目的是提供一种罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteriZJ617)在制备增加热量消耗的减肥类微生态制剂的应用，在本发明中，采用C57BL/6J小鼠建立高脂饮食诱导的肥胖动物模型，探究罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteriZJ617)在高脂饮食诱导的肥胖中对白色脂肪组织的作用，为开发改善机体脂肪沉积的微生态制剂提供新思路。制剂为减少脂肪细胞大小的微生态制剂，进一步而言，制剂为促进白色脂肪组织产热并提高白色脂肪组织产热及线粒体合成相关基因表达的微生态制剂。所述菌株为改善机体脂肪沉积的微生态制剂。
本发明提供的罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)具有以下优势：
1.1、与高脂饮食诱导的NAFLD小鼠相比，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillusreuteri ZJ617)干预后，小鼠的肝脏组织切片显示，肝脏脂肪变性明显减轻，且肝脏中甘油三酯水平显著降低；
1.2、与高脂饮食诱导的NAFLD小鼠相比，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillusreuteri ZJ617)干预后，小鼠血清中肝脏损伤及炎症相关指标水平显著降低，包括谷草转氨酶、谷丙转氨酶和TNF-α；
1.3、与高脂饮食诱导的NAFLD小鼠相比，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillusreuteri ZJ617)干预后，小鼠高血脂症相关指标水平显著降低，包括甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白；
1.4、与高脂饮食诱导的NAFLD小鼠相比，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillusreuteri ZJ617)干预后，小鼠葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗情况显著改善。
2.1、与高脂饮食组小鼠相比，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteriZJ617)干预组小鼠的体重及白色脂肪组织重量明显低于高脂饮食组小鼠；
2.2、H&E染色切片及统计学结果显示，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillusreuteri ZJ617)干预组脂肪细胞面积显著小于高脂饮食组；
2.3、罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预组小鼠体温显著高于高脂饮食组，且热成像图及统计学结果显示罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillusreuteri ZJ617)干预组白色脂肪组织温度显著高于高脂饮食组；
2.4、实时荧光定量PCR检测脂肪组织产热相关基因表达水平显示，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预组小鼠的白色脂肪组织产热相关基因包括Adrb3、Pgc-1b、Ppara和Pparg表达显著高于高脂饮食组。
2.5、透射电镜图显示，与高脂饮食组小鼠相比，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预组小鼠白色脂肪组织富集大量线粒体，且实时荧光定量PCR结果显示线粒体合成相关基因包括Cox5b、Cox7a1或Cox7a2表达显著高于高脂饮食组小鼠。
本发明通过增加脂肪产热，从而减少脂肪堆积，所述脂肪为白色脂肪。本发明所述的罗伊氏乳杆菌具有缓解NAFLD及能促进白色脂肪细胞向棕色样脂肪细胞转化从而达到减脂效果的菌株。说明：棕色样脂肪：脂肪细胞呈小的多室脂滴，即脂肪细胞面积减小，拥有大量线粒体，具有和棕色脂肪类似的功能，即产热。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1：罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预对高脂饮食诱导的NAFLD模型小鼠肝脏组织学的影响。
图2：罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预对高脂饮食诱导的NAFLD模型小鼠肝脏甘油三酯的影响。
图3：罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预对高脂饮食诱导的NAFLD模型小鼠肝脏损伤及炎症相关指标的影响。
图4：罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预对高脂饮食诱导的NAFLD模型小鼠高血脂症的影响。
图5：罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预对高脂饮食诱导的NAFLD模型小鼠葡萄糖耐受情况和胰岛素抵抗的影响。
图6：罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预对高脂饮食诱导的肥胖小鼠体重和白色脂肪重量的影响。
图7：小鼠白色脂肪苏木精-伊红染色组织切片显微镜图。
图8：小鼠白色脂肪细胞面积分布率。
图9：罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预对对高脂饮食诱导的肥胖小鼠体温及白色脂肪温度的影响。
图10：小鼠腹部白色脂肪温度热成像图。
图11：罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预对白色脂肪组织中产热相关基因Adrb3、Pgc-1b、Ppara和Pparg表达水平的影响。
图12：小鼠白色脂肪组织透射电镜图。
图13：罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预对白色脂肪组织中线粒体合成相关基因Cox5b、Cox7a1和Cox7a2表达水平的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)处理动物
(1)4周龄雄性C57BL/6J小鼠(购于上海斯莱克试验动物有限责任公司)在标准试验条件下饲养：23±1℃，湿度50％，12小时光照/黑暗循环。适应一周后，用于实验。
(2)选取(1)中体重相近的雄性小鼠，随机分成3组，每组9只，分别标记为空白对照组(对照饲料，10％的能量来自脂肪)，高脂饮食组(高脂饲料，60％的能量来自脂肪)和罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)组(干预方式以饮水方式摄入)。
具体如下：
空白对照组：对照饲料(10％的能量来自脂肪)，饮用水；
高脂饮食组：高脂饲料(60％的能量来自脂肪)，饮用水；
罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)组：高脂饲料，含有罗伊氏乳杆菌ZJ617的饮用水；
含有罗伊氏乳杆菌ZJ617的饮用水的制备方法为：罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)于灭菌MRS培养基中37℃厌氧培养18小时。培养完成后，菌液在5000rpm，4℃条件下离心15min，去上清，取菌体重悬于无菌饮用水中(109CFU/mL)。
试验期间，所有小鼠自由采食和饮水。各试验组每日更换饮用水。
试验期间每周称取小鼠体重。由图6中A和B可得，高脂饮食喂养后，小鼠体重显著高于空白对照组(P<0.05)。罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预显著降低高脂饮食诱导的体重增加。
每组分别进行如下实验：
(3)试验期第12周，进行如下实施例6所述的口服葡萄糖耐量试验；试验期第13周，进行如下实施例6所述的胰岛素耐受试验；
试验期14周后，先进行如下实施例8所述的动物体温检测和实施例9所述的热成像检测白色脂肪温度。采取心脏采血方式获取动物血液于无菌离心管中，室温静置30min后，于4℃，3000rpm条件下离心15min后收集血清，储存于-80℃用于后续生化分析(详见实施例4、实施例5)。而后实施安乐死。取部分小鼠肝脏组织固定于4％多聚甲醛中进行如下的实施例2，其余肝脏可保存于-80℃中，用于其他研究分析(包括实施例3)。
且，对上述实施安乐死的小鼠取其附睾白色脂肪组织称重记录，由图6中C可得，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预后，与高脂饮食组小鼠相比，其白色脂肪组织重量显著减轻。取部分白色脂肪组织固定于4％多聚甲醛中进行如下的实施例7，部分白色脂肪组织固定于2.5％戊二醛溶液中进行如下的实施例10，其余的白色脂肪组织可保存于-80℃中，用于其他研究分析(包括实施例11)。
实施例2，动物肝脏组织H&E染色病理学观察
将实施例1中4％多聚甲醛固定好后的小鼠肝脏组织样本依次转移至不同浓度梯度的乙醇(75％，85％，95％和100％)中进行脱水，并在二甲苯中进行透明处理；将透明好的组织包埋在石蜡中并进行切片，厚度为5μm。脱蜡后再次转移至不同浓度梯度的乙醇(75％，85％，95％和100％)中，随后进行苏木精-伊红染色。封片后于光学显微镜(OlympusCorporation，Japan)下观察肝脏组织形态。
由图1所示，空白对照组小鼠肝脏细胞形态正常，肝脏细胞排列整齐，无明显的肝脏脂肪变性及炎症浸润，而NAFLD模型组(高脂饮食组)小鼠肝脏出现明显的肝细胞肿胀，肝组织出现严重空泡化，伴有气球样变，罗伊氏乳杆菌ZJ617组由于罗伊氏乳杆菌ZJ617干预后，明显改善了肝细胞损伤、肝脏脂肪变性及炎性反应，对NAFLD具有保护作用。
实施例3，肝脏甘油三酯含量的检测
小鼠肝脏中甘油三酯含量主要用试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行检测，严格按照说明书操作。
实施例1中的小鼠处理后，取100mg小鼠肝脏，加入1mL无水乙醇，使用匀浆机进行研磨，随后于4℃，2500g条件下离心10min后收集上清液，用于检测。取试剂盒自带标准品和匀浆上清液各2.5μL于酶标板中，然后加入250μL工作液，震荡孔板混匀后，于37℃孵育10min，使用酶标仪(TECAN,Switzerland)在波长510nm处检测各孔吸光度值。
由图2可得，与空白对照组相比，NAFLD模型组小鼠肝脏甘油三酯水平显著升高；与NAFLD模型组小鼠相比，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预能显著改善肝脏中甘油三酯水平。
实施例4，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预缓解了NAFLD小鼠的肝脏损伤及炎症。
小鼠肝脏损伤相关指标包括测定血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶，炎症相关指标包括血清TNF-α水平。由实施例1处理后，动物血清保存于-80℃冰箱中。室温融解平衡后，上述指标严格按照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行检测。
由图3中A和B所示，与空白对照组小鼠相比，NAFLD模型组小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量显著上升；与NAFLD模型组小鼠相比，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillusreuteri ZJ617)干预后显著降低了谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量，分别降低了76.3％和57.6％表明罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)能缓解高脂饮食诱导的肝损伤。由图3中C所示，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)显著降低了NAFLD模型组小鼠血清中炎性因子TNF-α水平。综上所述，表明罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预可以缓解高脂饮食诱导的NAFLD小鼠的肝损伤及炎症。
实施例5，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预缓解了NAFLD小鼠的高血脂症
小鼠肝脏损伤相关指标包括测定血清中甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白。由实施例1处理后，动物血清保存于-80℃冰箱中。室温融解平衡后，上述指标严格按照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行检测。
由图4所示，与空白对照组小鼠相比，NAFLD模型组小鼠血清中甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白水平显著上升；与NAFLD模型组小鼠相比，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预后显著降低了甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白，表明罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)能缓解NAFLD小鼠的高血脂症。
实施例6，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预缓解了NAFLD小鼠的葡萄糖不耐受及胰岛素抵抗
(1)按照实施例1处理，于试验期第12周执行口服葡萄糖耐量试验。具体操作如下：将各组小鼠置于一个换有干净垫料的笼子里，移除饲料，可自由饮水。禁食6小时后，给各组小鼠灌喂2g/kg的葡萄糖溶液。在0、15、30、60、90和120min用血糖仪(Accu-Chek performa,Roche)测定尾静脉血糖并做好记录。
(2)按照实施例1处理，于试验期第13周执行胰岛素耐受试验。具体操作如下：将各组小鼠置于一个换有干净垫料的笼子里，移除饲料，可自由饮水。禁食4小时后，给各组小鼠腹腔注射0.75U/kg的胰岛素。在0、15、30、60、90和120min用血糖仪(Accu-Chek performa,Roche)测定尾静脉血糖并做好记录。
由图5所示可得，与空白对照组小鼠相比，NAFLD模型组小鼠清除血中葡萄糖的能力显著低于空白对照组，且出现了明显的胰岛素抵抗现象，而罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预后，NAFLD小鼠葡萄糖不耐受及胰岛素抵抗的情况显著改善。
综上所述，在本发明中，采用C57BL/6J小鼠建立高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠模型，14周高脂饮食干预后，小鼠肝脏脂肪变性严重并伴有肝脏损伤和炎症，肝脏脂质代谢紊乱，进一步导致机体发生高血脂症、葡萄糖不耐受及胰岛素抵抗等代谢性疾病。罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预14周后，显著改善了NAFLD的发展，且显著降低了血清甘油三酯、胆固醇和低密度脂蛋白，显著改善了机体葡萄糖耐量及胰岛素抵抗。证实了罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)对于高脂饮食诱导的NAFLD小鼠，具有保护肝功能，改善肝脏脂肪变性及脂质堆积作用，是一种有效缓解NAFLD的益生菌。
实施例7，动物脂肪组织H&E染色病理学观察
将实施例1中4％多聚甲醛固定好后的小鼠白色脂肪组织样本依次转移至不同浓度梯度的乙醇(75％，85％，95％和100％)中进行脱水，并在二甲苯中进行透明处理；将透明好的组织包埋在石蜡中并进行切片，厚度为5μm。脱蜡后再次转移至不同浓度梯度的乙醇(75％，85％，95％和100％)中，随后进行苏木精-伊红染色。封片后于光学显微镜(OlympusCorporation，Japan)下观察脂肪组织形态，并使用ImageJ软件(National Institutes ofHealth，USA)测量脂肪细胞面积。
由图7可得，白色脂肪组织H&E切片结果显示，高脂饮食诱导的小鼠与空白对照组相比，具有更大的脂肪细胞并具有更大的脂肪滴。罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillusreuteri ZJ617)干预后，脂肪细胞显著减小，脂质堆积显著降低。对脂肪细胞的面积进行测量并统计，图8显示结果与H&E切片结果一致。
实施例8，动物体温检测
各实验组小鼠处理14周后，对各组小鼠进行体温测定。
由图9中A可得，高脂饮食组小鼠体温显著低于空白对照组，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预显著逆转了高脂饮食诱导的体温降低。
实施例9，热成像检测白色脂肪温度
各实验组小鼠处理14周后，使用热成像仪对各组小鼠进行的腹部脂肪温度进行测定，并进行统计。
由体温数据图9A可知ZJ617可显著提高机体产热，进一步通过图9B和图10确定，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预组小鼠白色脂肪温度显著高于高脂饮食组小鼠。
实施例10，动物脂肪组织透射电镜线粒体观察
将实施例1中用2.5％戊二醛溶液室温固定4小时后的小鼠白色脂肪组织样本使用PBS(0.1M，pH＝7.0)漂洗样品3次，每次10min。然后在1％四氧化锇溶液中固定1h。样品用一系列梯度乙醇(30％，50％，70％，95％，100％)脱水后，将其包埋至Spurr树脂混合物中。样品在超薄切片机(LEICA EM UC7)中切片，分别用醋酸双氧铀和碱性柠檬酸铅染色10min。最后用透射电子显微镜进行观察(Hitachi Model H-7650)。
由图12可得，透射电镜图结果显示，高脂饮食组小鼠脂肪组织线粒体数量明显少于空白对照组，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预较高脂饮食组小鼠脂肪组织中线粒体数量明显增多。
实施例11，脂肪组织RNA提取及荧光定量PCR检测
由实施例1处理后，动物白色脂肪组织样本保存于-80℃冰箱中。称取约50mg白色脂肪组织，根据试剂盒(Accurate Biotechnology,AG21017,China)提供的说明书提取脂肪组织总RNA。根据逆转录试剂盒说明书(Accurate Biotechnology,AG11728,China)上提供的方法将mRNA转化为cDNA。采用SYBR Green法(Accurate Biotechnology,AG11701,China)检测系统检测目的基因的表达。引物序列使用Primer Premier 5进行设计(如表1)。PCR反应在real-time PCR system(Bio-Rad,CFX96,USA)中进行，荧光定量程序为95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，添加溶解曲线，共进行40个循环。各个样品目的基因表达量通过管家基因Gapdh进行校正标准化，用2-ΔΔCt法对样本基因进行定量分析，空白对照组作为对照，以虚线表示。
由图11可得，分析白色脂肪组织中产热相关mRNA表达水平。与高脂饮食组小鼠相比，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预后，产热相关mRNA，包括Adrb3、Pgc-1b，Ppara和Pparg表达水平显著上调。同时，由图13可得，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预后，线粒体合成相关mRNA，包括Cox5b，Cox7a1，Cox7a2表达水平显著上调，与实施例10显示结果一致。
表1荧光定量引物序列
综上所述，在本发明中，采用C57BL/6小鼠建立高脂饮食诱导的肥胖模型，罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)干预14周后，显著缓解了肥胖小鼠非酒精性脂肪肝的发生及白色脂肪的堆积，促进了白色脂肪组织产热，显著上调了白色脂肪组织中产热及线粒体合成相关基因的表达，诱导白色脂肪细胞向棕色样脂肪细胞转化由此，进一步缓解由高脂饮食造成的小鼠肥胖。
说明：除了本发明的罗伊氏乳杆菌ZJ617外，背景技术所述的其余菌株，未报道可促进白色脂肪组织产热，也未报道可上调产热及线粒体合成相关基因的表达。
因此，只有本发明的罗伊氏乳杆菌ZJ617首次报道了具有促进机体产热并诱导白色脂肪细胞向棕色样脂肪细胞转化，以达到减少机体脂肪堆积的功能。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (4)
1.罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)在制备改善非酒精性脂肪肝、改善脂肪堆积、逆转高脂饮食诱导的体温降低的产品中的应用；
罗伊氏乳杆菌ZJ617(Lactobacillus reuteri ZJ617)的保藏编号CGMCC No.8542；
所述非酒精性脂肪肝为高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝；
所述改善非酒精性脂肪肝包括：罗伊氏乳杆菌ZJ617能缓解肝脏脂质堆积、缓解肝脏损伤及炎症、降低高血脂症、改善葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗；
所述降低高血脂症包括降低血清甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白；
所述改善脂肪堆积包括：减少脂肪细胞大小、促进机体及白色脂肪组织产热、提高脂肪产热基因表达水平；促进脂肪组织线粒体合成相关基因表达水平、改善脂肪沉积；所述产热相关基因包括Adrb3、Pgc-1b、Ppara或Pparg；所述线粒体合成相关基因包括Cox5b、Cox7a1或Cox7a2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述脂肪为白色脂肪。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：产品包括但不限于食品、药物、医疗保健品及饲料。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：产品包括利用罗伊氏乳杆菌制备而得的发酵乳制品、活菌制剂、添加剂。
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