CN116159082A

CN116159082A - 一种预防和/或治疗肥胖及代谢综合征的产品及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116159082A
Application number: CN202310171193.6A
Authority: CN
Inventors: 陈廷涛; 韩小龙; 司书锋; 曹维超; 侯建亮; 王丽媛; 郄璐
Original assignee: Shandong Zhongke Jiayi Bio Engineering Co ltd
Current assignee: Shandong Zhongke Jiayi Bio Engineering Co ltd
Priority date: 2023-02-27
Filing date: 2023-02-27
Publication date: 2023-05-26

Abstract

本发明涉及微生物治疗技术领域，具体涉及一种预防和/或治疗肥胖及代谢综合征的产品及其制备方法和应用，产品包括嗜酸乳杆菌JYLA‑126包被液，嗜酸乳杆菌JYLA‑126包被液由嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）JYLA‑126和细菌包被液混合制得。采用细菌包被液包被嗜酸乳杆菌JYLA‑126菌液，使之更好地运输至肠道发挥疗效。使用嗜酸乳杆菌JYLA‑126包被液对高脂饮食诱导的肥胖小鼠进行灌胃治疗，通过各项指标显示，嗜酸乳杆菌JYLA‑126包被液可以有效调节肠道菌群、维持肠道健康，改善肝脏糖代谢并减轻肝脏氧化应激，改善肝脏脂质代谢并缓解肝脏炎症水平，同时改善白色脂肪堆积并促进棕色脂肪产热，从而实现对小鼠肥胖及代谢综合征的有效治疗。

Description

一种预防和/或治疗肥胖及代谢综合征的产品及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物治疗技术领域，具体涉及一种预防和/或治疗肥胖及代谢综合征的产品及其制备方法和应用。

背景技术

肥胖症是一种由多种因素引起的慢性代谢性疾病，以体内脂肪细胞的体积和细胞数增加致体脂占体重的百分比异常增高并在某些局部过多沉积脂肪为特点。全世界肥胖和超重的患病率极高，预测表明至2030年，将有超过10亿人罹患肥胖或超重。目前，中国肥胖人口已超过2.5亿人，其趋势仍处于不断增长的状态。超重或肥胖可增加罹患乳腺癌、冠心病、2型糖尿病、胆囊疾病、骨关节炎、结肠癌、高血压和卒中的风险。

随着科技的发展，肠道菌群作为一个长期以来被忽略的重要“器官”，正受着越来越多的重视。肠道微生物群已被确定为一个关键因素，它能够通过与饮食和肠道免疫的相互作用，影响代谢健康。肠道微生物群的改变及其组成成分(细胞、蛋白质和代谢物)在不健康饮食的渗透下通过肠道屏障泄漏，会导致代谢组织中与肥胖相关的低级别炎症和胰岛素抵抗，并且人们的生活方式、卫生习惯、药物等都会影响肠道微生物的种类、数量和功能，进而促进代谢综合征、肥胖、糖尿病甚至癌症等疾病的发生与发展。因此研究肠道微生物群和代谢之间的相互作用对于宿主健康至关重要，然而，我们目前还不清楚这些肠道微生物的变化在多大程度上有助于新陈代谢。据研究，厚壁菌门（Firmicutes）在宿主蛋白质的分解、淀粉的消化吸收和短链脂肪酸的合成方面具有正向调节作用。拟杆菌门（Bacteroidota）可降解复杂的含碳有机物，可生成乙酸、丙酸等小分子有机酸来改善宿主代谢，在降脂减肥中具有重要作用。F/B比值增大与肥胖症相关，厚壁菌门相对丰度的增加会促进机体吸收热量、储存脂肪诱导肥胖和血脂升高。

肠道菌群的变化可以增加肠的通透性，从而促进细菌血清脂多糖（LPS）进入血液，导致内毒素血症，引起机体低水平的慢性炎症反应，导致肝脏代谢紊乱，最终发生肥胖症、糖代谢异常、血脂紊乱、高血压等代谢综合征。

相比于健康人群，肥胖症患者体内的LPS水平会显著增高，LPS作为革兰氏阴性菌细胞壁的组成部分，被认为是一种炎性触发因子，可以通过多种途径促进全身性炎症和相关代谢障碍疾病的发生和发展，LPS导致的全身炎症已被证明会引发葡萄糖耐量受损和胰岛素抵抗，这与肥胖的发生发展密切相关。另外，LPS会通过TLR4-NF-κB信号通路触发肠道炎症的发生，破坏肠上皮屏障。肠上皮屏障是指由肠上皮细胞之间的紧密连接蛋白ZO-1和occludin形成抵御病原体和细菌产物入侵的物理屏障。

肥胖可以导致非酒精性脂肪肝的发生，出现例如肝细胞空泡化、炎性浸润等症状，影响肝脏的正常代谢功能。非酒精性脂肪肝的出现往往伴随着肝脏胰岛素抵抗的发生。胰岛素抵抗在肝脏代谢中表现为糖代谢紊乱，即肝脏无法将血液中多余的葡萄糖转化为糖原进行贮存，进而逐渐丧失调节机体血糖浓度的功能。氧化应激引起的肝脏损伤是导致肝脏代谢紊乱以及炎症发生的罪魁祸首。Nrf2的磷酸化激活是开启抗氧化通路的重要开关。进一步的，肝脏氧化应激引起的脂质过氧化反应会导致肝脏脂质代谢发生紊乱，多余的脂质无法通过正常代谢途径被清除将会引起肝脏的脂质积累。另外，肥胖诱导的肠道LPS经门静脉抵达肝脏的易位激活是可能发生的，另外相关的促炎因子，如TNF-α，IL-1β，IL-6和IFN-γ的水平也会显著增加，与肝脏的氧化应激存在相互促进的关系。

脂肪组织可分为白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）。白色脂肪组织是身体的能量仓库，它可以将多余的能量以脂肪的形式储藏起来；棕色脂肪组织则是通过它细胞内大量的线粒体消耗能量并产生热能。区别于囤积脂肪的白色脂肪组织，棕色脂肪组织能够燃烧脂肪，从而被认为是治疗肥胖和其肥胖相关的代谢疾病的重要靶标。在肥胖症中，WAT的积累导致整体体重的增加。这种脂肪组织堆积是由细胞增生和肥大引起的。脂肪增生通过脂肪形成和脂肪生成发生，其中前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞，有赖于组织中C/EBPα、PPARγ和aP2蛋白的表达。解偶联蛋白1（UCP1）存在于棕色脂肪组织的线粒体中，能够将葡萄糖和脂肪酸分解产生的能量转化为热能，抑制ATP（三磷酸腺苷，为生物体直接供能的物质）的产生，以此介导褐色脂肪产热，从而帮助动物抵御低温、肥胖及相关代谢紊乱。

益生菌是指投入后通过改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂及其代谢产物。迄今为止，应用较为广泛的益生菌有三大类：乳杆菌类，如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌；双歧杆菌类，如长双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌；链球菌类，如嗜热链球菌、粪链球菌。益生菌是研究抗肥胖功效的最积极的来源之一。迄今为止，益生菌抗肥胖作用的多种分子机制表现为代谢能量的改变、肠道屏障的改善、代谢和免疫反应的调节、神经活动和食欲的调节。因此探索具有潜在健康益处的新型益生菌引起了人们的极大关注。

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，为细菌界、厚壁菌门、芽孢杆菌纲、乳杆菌目、乳杆菌科、乳杆菌属，革兰氏阳性菌，厌氧或兼性厌氧，不生芽孢，菌体圆端直杆菌，细长，单个、成对或短链状。通常缺乏鞭毛，但能运动，最适生长温度为35~38℃，20℃下不生长，耐热性差。叶酸和脱氧核糖核苷是嗜酸乳杆菌生长繁殖需要的重要生长因子，能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖同型发酵产DL乳酸，释放乳酸、乙酸、过氧化氢和一些类抗菌素。嗜酸乳杆菌不仅在胃中，它还是人体小肠内的主要益生菌，具有较强的耐酸性、耐胆盐性，对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌有较强的拮抗性。嗜酸乳杆菌属能分泌具广谱效应的类抗生物素物质，具有较高产生β-半乳糖苷酶的能力，其细胞壁肽聚糖是乳酸菌的黏附素之一。嗜酸乳杆菌通过产生大量的有机酸、过氧化氢、细菌素或多肽等物质，从而发挥抑菌和抗病毒作用，具有调节免疫，维持肠道微生态平衡，改善机体代谢等效果。

目前已报道的用于预防和/或治疗肥胖和代谢综合征的益生菌菌株或相关产品的相关机制研究不清晰，存在效果不显著、稳定性和持久性差的问题。

发明内容

针对目前治疗肥胖和代谢综合征的益生菌产品作用机制不清晰、效果不显著、稳定持久性差的问题，本发明提供一种预防和/或治疗肥胖及代谢综合征的产品及其制备方法和应用。

第一方面，本发明提供一种预防和/或治疗肥胖及代谢综合征的产品，包括嗜酸乳杆菌JYLA-126包被液，嗜酸乳杆菌JYLA-126包被液由嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）JYLA-126和细菌包被液混合制得，嗜酸乳杆菌JYLA-126已于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.18095。

进一步的，嗜酸乳杆菌JYLA-126的浓度为1×10⁴~1×10⁹CFU/mL。

第二方面，本发明提供一种上述产品的制备方法，包括以下步骤：（1）复苏嗜酸乳杆菌JYLA-126；（2）制备细菌包被液；（3）将复苏的嗜酸乳杆菌JYLA-126重悬于细菌包被液中，制得嗜酸乳杆菌JYLA-126包被液。

进一步的，步骤（1）具体为将嗜酸乳杆菌JYLA-126从菌库中取出，接种于MRS培养基中，在37℃恒温培养箱依次进行厌氧与需氧培养，完成一次活化，接着再次进行厌氧与需氧培养，完成二次活化，得到复苏的嗜酸乳杆菌JYLA-126。

进一步的，步骤（2）具体为1000mL纯净水中加入0.1g明胶，置于60℃水浴中，待明胶完全溶解制得细菌包被液。使用细菌包被液包被菌体，使之更好地运输至肠道发挥疗效。

第三方面，本发明提供上述产品在预防和/或治疗肥胖及代谢综合征方面的应用，所述预防和/或治疗通过调节肠道菌群、维持肠道健康实现。

进一步的，所述预防和/或治疗通过改善肝脏糖代谢并减轻肝脏氧化应激、改善肝脏脂质代谢并缓解肝脏炎症水平实现。

进一步的，所述预防和/或治疗通过改善白色脂肪堆积并促进棕色脂肪产热实现。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的预防和/或治疗肥胖及代谢综合征的产品，采用细菌包被液包被嗜酸乳杆菌JYLA-126菌体，使之更好地运输至肠道发挥疗效。使用嗜酸乳杆菌JYLA-126包被液对高脂饮食诱导的肥胖小鼠进行灌胃治疗，通过各项指标显示，嗜酸乳杆菌JYLA-126包被液可以有效调节肠道菌群、维持肠道健康，改善肝脏糖代谢并减轻肝脏氧化应激，改善肝脏脂质代谢并缓解肝脏炎症水平，同时改善白色脂肪堆积并促进棕色脂肪产热，从而实现对小鼠肥胖及代谢综合征的有效治疗。

本发明通过微生物学、分子生物学、生物信息学以及免疫学有机结合，证明嗜酸乳杆菌JYLA-126在防治肥胖疾病中具有显著优势，有助于促进嗜酸乳杆菌JYLA-126在减肥中的作用机制的研究，为肥胖患者打造一款安全性好、针对性强、无任何毒副作用、价格低廉的减肥产品。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是嗜酸乳杆菌JYLA-126的生长曲线图及益生性研究结果图。

图2是嗜酸乳杆菌JYLA-126对高脂饮食诱导的小鼠肥胖的治疗效果图。

图3是嗜酸乳杆菌JYLA-126对高脂饮食诱导的肠道微生物失调的治疗效果图。

图4是嗜酸乳杆菌JYLA-126对维持高脂饮食诱导的肥胖小鼠肠道健康的效果图。

图5是嗜酸乳杆菌JYLA-126改善肝脏糖代谢并减轻肝脏氧化应激的效果图。

图6是嗜酸乳杆菌JYLA-126改善肝脏脂质代谢并缓解肝脏炎症水平的效果图。

图7是嗜酸乳杆菌JYLA-126改善白色脂肪堆积并促进棕色脂肪产热的效果图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

下列实施例或测试例中，使用的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）JYLA-126为本公司自行采集所得。该嗜酸乳杆菌JYLA-126菌株来源为中国浙江省百岁老人的粪便，经过筛选、分离、鉴定，得到该菌株的基因序列如下：

TGCAGTCGAGCGAGCTGAACCAACAGATTCACTTCGGTGATGACGTTGGGAACGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTATAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAGGGTAACGGCCTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCAATCCGTAGAGATACGGAGTTCCCTTCGGGGACACTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGTACAACGAGGAGCAAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCTCTTAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTCTGCAATGCCCAAAGCCGGTGGCCTAACC

该菌株被鉴定为乳杆菌属（Lactobacillus），推测为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）。嗜酸乳杆菌JYLA-126已于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.18095。

实施例1 制备嗜酸乳杆菌JYLA-126包被液

（1）复苏嗜酸乳杆菌JYLA-126：将嗜酸乳杆菌JYLA-126从菌库中取出，接种于MRS培养基中，分别在37℃恒温培养箱进行厌氧与需氧培养，完成一次活化，接着再次完成二次活化，得到复苏的嗜酸乳杆菌JYLA-126；

（2）制备细菌包被液：向1000mL纯净水中加入0.1g明胶，置于60℃水浴中，待明胶完全溶解制得细菌包被液；

（3）将复苏的嗜酸乳杆菌JYLA-126重悬于细菌包被液中，使嗜酸乳杆菌JYLA-126的浓度为1×10⁴CFU/mL，制得嗜酸乳杆菌JYLA-126包被液。

实施例2 制备嗜酸乳杆菌JYLA-126包被液

（3）将复苏的嗜酸乳杆菌JYLA-126重悬于细菌包被液中，使嗜酸乳杆菌JYLA-126的浓度为1×10⁹CFU/mL，制得嗜酸乳杆菌JYLA-126包被液。

测试例1 嗜酸乳杆菌JYLA-126的生长曲线及益生性研究

1、嗜酸乳杆菌JYLA-126的生长曲线

将嗜酸乳杆菌JYLA-126从菌库中取出，接种于MRS培养基中，在37℃恒温培养箱依次进行厌氧培养，再改变条件进行好氧培养，每隔两个小时测定一次其菌液的OD值，连续测定24h以绘制其生长曲线，如图1A所示。在37℃常温的培养条件下，嗜酸乳杆菌JYLA-126在4h时进入生长对数期且在18h处菌落丰度达到最大，说明该菌具有良好的活性可以用于后续实验。

2、嗜酸乳杆菌JYLA-126的益生性研究

将嗜酸乳杆菌JYLA-126菌株用MRS培养基在37℃恒温培养箱中培养，使其OD值等于0.6后终止培养，保留菌株培养液备用。

（1）自由基清除能力的测定

a. 超氧自由基清除能力的测定

在0.5mL菌株培养液中加入150mmol/L的Tris-HCl溶液（pH=8.0）2mL，然后再加入1.2mmol/L邻苯三酚溶液1mL，室温反应30min，测定325nm处吸光度，按下列公式计算超氧自由基清除率：

其中，A00表示不含菌株培养液和邻苯三酚的吸光度；A01表示不含菌株培养液但含邻苯三酚的吸光度；A10表示含菌株培养液不含邻苯三酚的吸光度；A11表示含菌株培养液和邻苯三酚的吸光度。

b. 羟基自由基清除能力的测定

取2mmol/L的硫酸亚铁溶液1mL、6mmol/L过氧化氢1mL、6mmol/L水杨酸1mL的混合溶液，加入菌株培养液上清1mL，静置30min，在510nm处测定吸光度，以向混合溶液加入蒸馏水1mL为参比，按下列公式计算羟自由基的清除率：

/>

其中，A₁表示加入菌株培养液上清的吸光度；A₀表示加入蒸馏水的吸光度。

c. DPPH自由基清除能力的测定

取0.2mmol/L DPPH甲醇溶液2mL，加入菌株培养液上清2mL，黑暗下室温反应30min，取上清在517nm处测定吸光度，以0.2mmol/LDPPH甲醇溶液2mL加入蒸馏水2mL为参比，按下列公式计算羟自由基的清除率：

其中，A₁表示加入菌株培养液上清的吸光度；A₀加入蒸馏水的吸光度。

嗜酸乳杆菌JYLA-126自由基清除能力的测定结果如图1B所示，超氧自由基清除率为81.73%，羟基自由基清除率为81.50%，DPPH自由基清除率为97.72%，亚铁离子螯合率为75.52%以及总还原力OD值为0.76。

（2）耐酸耐胆盐实验

耐酸测试：取出100μL菌株培养液，用PBS缓冲液稀释10¹、10³、10⁵倍，6000g离心3min弃掉上清，加入pH=2、3、4、5、7的PBS缓冲液，放置4小时后，混匀取10μL涂板，在37℃恒温培养箱中培养24小时，活菌计数，做好实验记录，结果如图1C、D所示。

耐胆盐测试：取出100μL菌株培养液，用PBS缓冲液稀释10¹、10³、10⁵倍，6000g离心3min弃掉上清，加入含有0、0.1%、0.2%、0.3%牛胆盐的培养基，在37℃恒温培养箱中培养12小时，混匀取10μL涂板，在37℃恒温培养箱中培养24小时，活菌计数，做好实验记录，结果如图1E、F所示。

耐酸耐胆盐实验结果显示，嗜酸乳杆菌JYLA-126随着溶液酸性程度以及胆盐浓度的升高，菌落数基本不减少，在pH=1.0处仍平均有1.57×10⁶个菌落数，在胆盐浓度为0.3%时，具有2.4×10⁸个菌落数。

（3）抑菌试验

对常见病原菌的抑制效果试验采用牛津杯法。使用长杆大棉签吸取适量病原菌菌液，压去多余水分，采用360°旋转法轻轻地将病原菌涂布于检测平板上，将牛津杯放置于相应位置，然后吸取200μL培养液加入到牛津杯内，将平板放置于4℃冰箱中扩散24h，然后在30℃下培养48h后测量抑菌圈直径并记录。

试验结果如图1G、H所示，嗜酸乳杆菌JYLA-126对β-溶血性链球菌（β- hemolyticsreptococcs，图1G-1）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，图1G-2）、Castellani 301志贺氏菌（Shigella Castellani 301，图1G-3）、大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7，图1G-4）、肠炎沙门氏菌（Salmonellaenteritidis，图1G-5）、福氏志贺氏杆菌（SalmonellaTyphimurium，图1G-6）、鼠伤寒沙门氏菌（Shigella flexneri，图1G-7）、白色念珠菌（Candida albicans，图1G-8）的抑菌圈分别为1.36cm，1.5cm，1.77cm，1.63cm，1.71cm，1.68cm，1.55cm，1.32cm，相比于联合抗生素组抑菌圈是较小的，但与空白对照组相比，其具有较大的抑菌圈。

（4）细胞粘附实验

将六孔细胞培养板用无菌PBS缓冲液清洗一次，放入灭菌的盖玻片，取1mL菌株培养液，与1mL含有少量Caco2/HT29细胞培养液混合后，加入六孔板中，37℃细胞培养箱培养1.5小时；取出六孔组织细胞培养板，吸出培养液，用PBS缓冲液反复清洗5次，甲醇固定，革兰氏染色，油镜观察拍照记录，结果如图1I所示。结果表明，嗜酸乳杆菌JYLA-126对肠上皮细胞Caco-2细胞具有良好的黏附能力。

（5）疏水性和聚集性实验

分别取2 mL菌株培养液3份：一份菌株培养液在室温下静置3h后，取200μL上层菌液，在600nm处测定OD值；另一份菌株培养液和等体积的二甲苯充分混合2min，静置30min使两相分离，取水相在600nm处测定吸光值；最后一份菌株培养液和等体积的氯仿充分混合2min，静置30min使两相分离，取水相在600nm处测定吸光值，以生理盐水作为空白对照。结果如图1J所示，嗜酸乳杆菌JYLA-126在氯仿溶剂中的疏水率为79.87%，在二甲苯溶剂中的疏水率为90.98%，其自聚集率为51.49%。

测试例2 体内动物实验

1、小鼠肥胖模型的建立

6-8周C57BL/6J雄性小鼠适应性喂养一周后，将小鼠的正常维持饲料换为高脂饮食（60%脂肪）喂养。投喂之前先为健康小鼠进行称重，之后给予定量的高脂饮食喂养，每周监测体重，每周检测一次血糖。在第10及11周分别进行葡萄糖耐受及胰岛素耐受实验，之后再喂养1周，根据之前每周的体重绘制曲线图，并计算小鼠肥胖度（公式如下所示），当小鼠肥胖度超过20%即视为建模成功。

2、肥胖小鼠的治疗

取12只健康小鼠和36只肥胖模型小鼠，36只肥胖模型小鼠随机分为3组，每组12只。将所有小鼠按照下列要求进行喂养，其中细菌包被液即1000ml纯净水中加入0.1g明胶，置于60℃水浴中，待明胶完全溶解室温保存。各组小鼠的饮水每两天更换一次，持续时间约12周。

①空白对照组（NCD）：无肥胖的健康小鼠，仅以100µL细菌包被液灌胃处理；

②肥胖模型组（HFD）：仅以100µL细菌包被液灌胃处理；

③低剂量益生菌治疗组（HFD+JYLA-L）：使用实施例1制备的低浓度嗜酸乳杆菌JYLA-126包被液（1×10⁴CFU/mL）灌胃治疗；

④高剂量益生菌治疗组（HFD+JYLA-H）：使用实施例2制备的高浓度嗜酸乳杆菌JYLA-126包被液（1×10⁹CFU/mL）灌胃治疗。

3、表型指标检测及生化指标检测

（1）表型检测指标

a. 体重、腰围、体长检测

造模成功前分别测量每只老鼠的体重、腰围、体长，之后每周再测一次小鼠体重、腰围、体长。

b. 摄食量和取水量检测

对于每组小鼠每周进食与进水量进行记录，统计每只小鼠每周进食与进水量。检测各治疗方法对于多饮、多食症状的缓解情况。

c. 血糖检测

禁食过夜后尾静脉取血测量小鼠血糖，每周检测一次血糖观察血糖值变化。

d. 胰岛素耐量与葡萄糖耐量检测

胰岛素耐量检测（insulin tolerance test，ITT）：第六周，小鼠先禁食6h，之后再腹腔注射胰岛素（0.75U/kg），在给予胰岛素后不同时间点（0、15min、30min、60min、90min、120min）尾静脉收集血样本，检测血糖浓度。

葡萄糖耐量检测（glucose tolerance test，GTT）：第七周，小鼠先禁食12h，之后再腹腔注射葡萄糖（2g/kg），在给予葡萄糖后不同时间点（0、15min、30min、60min、90min、120min）尾静脉收集血样本，检测血糖浓度。

胰岛素抵抗（HOMA-IR）指数的稳态模型评估方法如下：

（2）生化指标检测

a. 血液检测指标

第六周末，禁食过夜，第二天眼眶取血约1mL，3500rpm离心15min，取上层血清样本冻存，另外心脏取血500μL置于含肝素的抗凝管中用于血常规以及生化指标检测，包括以下各项指标：天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶活性（ALT，评价肝损伤）、胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）；测定血清中丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和还原型谷胱甘肽（DSH）；ELISA检测血浆胰岛素（insulin）、血浆代谢内毒素（LPS）。

b. 脂肪检测指标

沿着小鼠肩胛间区、腓肠肌、肝脏、肠道、胰腺和心脏，仔细收集棕色、皮下和内脏脂肪。内脏脂肪包括有胃肠周围脂肪、肾周围脂肪、附睾周围脂肪、腹膜后脂肪。皮下脂肪组织分布在皮下，脂肪脂肪细胞大，脂滴大，细胞器少，内脏脂肪反之。

白色脂肪（WAT）：能够将人体暂时消耗不完的糖类、脂类转化为甘油三酯储存起来，即主要与能量的储存有关。主要包括了腹股沟、生殖腺和皮下的脂肪。

棕色脂肪（BAT）：燃烧身体多余的能量从而减少体内以脂肪形式堆积的能量，是我们常说的“好脂肪”。内部充满着大量的线粒体，因此看上去是褐色的。肾脏、肾上腺、主动脉周围和纵隔及颈部组织内，以肩胛部位最好取，也最明显。

Q-PCR检测炎性细胞因子IL1β、IL-2、IL6、TNF-α、RANTES（激活调节正常T细胞的表达与分化）、MCP-1（单核细胞趋化蛋白）和瘦素等脂肪因子的mRNA表达；

Western-blot检测白色脂肪中的ACC（乙酰辅酶a羧化酶），FAS（脂肪酸合成酶），UCP1（棕色脂肪中解偶联蛋白）。

c. 肝脏检测指标

治疗结束后，麻醉小鼠，解剖后取胰腺、肝脏、脾脏、肾脏、肠道、肌肉等器官，尽量多取组织，多冻存，以便后续实验。计算脏器指数，液氮冻存与多聚甲醛保存备用。其中，肝脏指数=肝脏平均重量（mg）/小鼠平均体重（g）。

解剖后拍摄肝脏大小照片、HE染色观察细胞形态与大小、肝脏PAS染色观察糖原分布，油红O染色观察油滴积累。

脂质相关：天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶活性（ALT，评价肝损伤）、胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）。

氧化应激：丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和还原型谷胱甘肽（DSH）。

Western-blot检测AMPK信号通路与脂质代谢有关（AMPK、ACC、PPAR-r）；Nrf-2信号通路与氧化应激有关（Nrf-2、CYP2E1）；NFkB炎症信号通路（TLR4、P65、IkBα、COX2）。

d. 肠道及内容物检测指标

处死小鼠之前，禁食过夜，解剖后取十二指肠、回肠、盲肠、结肠以及它们相应的内容物冻存后用于高通量测序或蛋白表达量检测。

结肠：使用Western-blot检测肠道屏障功能相关蛋白occludin，E-cadherin，肠道通透性蛋白Zo-1。

回肠内容物：Q-PCR检测益生菌-AKK、乳酸菌、双歧杆菌、拟杆菌、厚壁菌及其比值；有害菌-分解色氨酸而产硫化氢的菌（产气肠杆菌、变形杆菌属）、产吲哚的菌（致病性大肠杆菌、迟缓爱德华氏菌、霍乱弧菌）；肠杆菌、肠球菌、梭杆菌、韦荣球菌、葡萄球菌数量；酵母菌、链球菌、类杆菌、乳酸杆菌、消化球菌、双歧杆菌。

盲肠内容物：将提取到的肠道（粪便）微生物基因组DNA，送上海派森诺公司进行16S rRNA测序。以提取的基因组DNA为模板，扩增16S rRNA基因的V3-V4区（引物为338F/806R）并上机测序，从而得到每个样品的OTUs，进而分析肠道菌群与肥胖的相关性。

f. 粪便检测指标

分别在造模成功前、后，每周同一时间、血糖降低节点时取每只老鼠粪便2~3粒，冻存备用，用于高通量测序分析等。

收集粪便做高通量测序分析，检测粪便脂多糖含量以及短链脂肪酸总含量。短链脂肪酸总含量的检测采用ELISA试剂盒进行快速检测，主要收集检测方法如下：收集小鼠粪便（>50mg）分装后冻存于-80℃，避免反复冻融。检测时解冻粪便样本，加入适量生理盐水搅拌均匀，3000rpm离心5-10min取上清，按照ELISA试剂盒说明书步骤仔细操作。

4、检测结果分析

（1）嗜酸乳杆菌JYLA-126治疗高脂饮食（HFD）诱导的小鼠肥胖

如图2所示，经过不同浓度嗜酸乳杆菌JYLA-126包被液的灌胃治疗后，可以很明显的观察到相比于肥胖小鼠的臃肿身材，正常饮食小鼠以及高剂量嗜酸乳杆菌JYLA-126治疗组小鼠身材纤细，体内脂肪含量大大减少，各组形体上存在较大差异（图2A）。另外，观察到嗜酸乳杆菌JYLA-126可以有效抑制HFD诱导的体重增加（图2F），但HFD组、HFD+JYLA-L组和HFD+JYLA-H组在食物摄取量以及饮水量和能量摄入量上均无显著差异（图2B-D），说明嗜酸乳杆菌JYLA-126产生的抗肥胖效果并非来自于摄食量或能量摄取量的减少，而肥胖小鼠经嗜酸乳杆菌JYLA-126治疗后能量摄取效率显著降低（图2E）。肥胖小鼠脂肪重量的减少和不同组织器官重量的变化进一步证实了这一点（图2H）。肝脏以及附睾脂肪组织形态学观察表明嗜酸乳杆菌JYLA-126能够显著抑制HFD诱导的肝脏与脂肪累积（图2G），这说明嗜酸乳杆菌JYLA-126有助于预防肥胖导致的并发症，如非酒精性脂肪肝等。

同时，本研究结果发现HFD喂养的小鼠血清LPS水平显著升高，而嗜酸乳杆菌JYLA-126的治疗可有效缓解小鼠血清内LPS含量的增加（图2I）。另外，LPS导致的全身炎症已被证明会引发葡萄糖耐量受损和胰岛素抵抗，这与肥胖的发生发展密切相关。作为最重要的肠道激素之一，胰高血糖素样肽1（GLP-1）可以刺激葡萄糖依赖性胰岛素的分泌，从而改善相关代谢综合征，如肥胖和2型糖尿病。在本研究中，HFD显著降低了血清GLP-1水平，而嗜酸乳杆菌JYLA-126的治疗则有效缓解了这一现象（图2J）。此外，HFD诱导的高空腹血糖水平、高胰岛素水平、高HOMA-IR以及低HOMA-IS水平均能够通过嗜酸乳杆菌JYLA-126的治疗得到有效的逆转（图2K-N）。并且，在小鼠葡萄糖耐量以及胰岛素耐量实验中也得到了相同的结果，HFD可诱发小鼠糖耐量受损以及胰岛素抵抗，但嗜酸乳杆菌JYLA-126的灌胃治疗可明显修复小鼠的糖耐量与胰岛素耐受性（图2O、P）。

（2）嗜酸乳杆菌JYLA-126减轻HFD诱导的肠道微生物失调

本研究应用高通量测序技术系统地分析了嗜酸乳杆菌JYLA-126治疗后肥胖小鼠粪便菌群组成的变化。肠道微生物α多样性展示了菌群微生物的丰富度和均匀度，包括有Chao 1指数、Shannon指数、Simpson指数、observed species指数、goods coverage指数和PD whole tree指数。HFD喂养显著降低了肥胖小鼠肠道微生物α多样性，而补充嗜酸乳杆菌JYLA-126则完全恢复了微生物组成的丰富度和均匀度（图3A-F）。为了更好地了解不同组别间小鼠肠道菌群组成的相似性，利用Venn图（图3G）来进行展示。对各组小鼠肠道菌群中的OTU数进行统计后结果显示，四组小鼠共具有644个OTU，其中有234个OTU同时存在于每个小组中。NCD组与HFD+JYLA-H组之间有57个相同OTU，然而NCD组与HFD组之间仅有8个相同OTU。此外，嗜酸乳杆菌JYLA-126治疗后肥胖小鼠的OTU数为486个显著多于HFD组318个的OTU数。

采用非度量多维尺度（NMDS）和主坐标分析（PCOA）对4组小鼠粪便菌群β多样性进行可视化分析。NMDS结果（图3H）表明，代表HFD组别的圆点均分布在右侧象限并且与其他三组无明显交叉重叠，表明HFD小鼠与其他三组小鼠的粪便微生物群结构存在显著差异。代表NCD和HFD+JYLA-H组别的圆点主要分布在左侧象限，呈两个紧密分布的群落。而代表HFD+JYLA-L组别的圆点仅与HFD+JYLA-H组别的圆点有重叠，这样的结果进一步证实了补充高浓度的嗜酸乳杆菌JYLA-126可特异性影响肠道菌群多样性，有效缓解HFD诱导的肠道菌群急剧变化。PCOA的结果（图3I）与NMDS的分析结果基本一致。

为了进一步研究肠道菌群群落的具体变化，我们比较了四组菌群中优势门和属的相对丰度。在门水平上，拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）是所有类群中的三大主导群落，占总群落丰度的90%以上（图3J）。HFD显著降低小鼠肠道中拟杆菌门的相对丰度，增加厚壁菌门和变形菌门的相对丰度，嗜酸乳杆菌JYLA-126的治疗可明显逆转上述变化。在属水平上，嗜酸乳杆菌JYLA-126也显示出逆转HFD诱导的不良肠道菌群组成的良好效果，包括Acetatifactor属的降低、Desulfovibrio属和Parabacteroides属的增加（图3K）。

（3）嗜酸乳杆菌JYLA-126维持肥胖小鼠肠道健康

肠道上皮的完整性被认为是胃肠道的第一道防线。HFD可通过增加肠道LPS含量而破坏肠上皮屏障。本研究结果一致表明，HFD诱导的小鼠结肠缩短，肠道通透性（血浆FITC-葡聚糖）和粪便LPS水平显著增加（图4A-D）。苏木精和伊红染色（H&E）染色结果证实HFD引起严重的肠屏障损伤，主要体现在，HFD组肠道杯状细胞明显减少、隐窝变形、大量炎症细胞浸润、粘膜肌层与固有层变薄。然而，补充嗜酸乳杆菌JYLA-126可减轻HFD引起的肠道炎症和损伤，并伴有总短链脂肪酸（SCFAs）含量的升高（图4E-G）。

LPS触发肠道炎症的发生，主要依赖于TLR4-NF-κB信号通路。嗜酸乳杆菌JYLA-126则可以通过调节肠道菌群多样性来减少LPS的释放，抑制TLR-4的激活，从而减少下游NF-κB和IκB-α的磷酸化表达，降低细胞炎症因子TNF-α，IL-1β，IL-6和IFN-γ的释放（图4H-L）。检测嗜酸乳杆菌JYLA-126对小鼠结肠上皮紧密连接蛋白ZO-1和occludin表达水平的影响，结肠免疫荧光染色结果显示，HFD组小鼠的ZO-1水平显著低于NCD组小鼠，而HFD+JYLA-H组小鼠的ZO-1水平与NCD组小鼠相似。各组occludin蛋白表达水平与ZO-1的变化趋势相同，且有显著性差异（图4M、N）。

（4）嗜酸乳杆菌JYLA-126改善肝脏糖代谢并减轻肝脏氧化应激

肥胖可以导致非酒精性脂肪肝的发生，从而影响肝脏的正常代谢功能。从肝脏的H&E染色结果图可以看出，HFD诱导的肥胖小鼠肝脏NAFLD评分最高，具有较多的脂肪肝症状，例如肝细胞空泡化、炎性浸润等。然而高浓度的嗜酸乳杆菌JYLA-126显著改善了这一症状（图5A、B）。非酒精性脂肪肝的出现往往伴随着肝脏胰岛素抵抗的发生。胰岛素抵抗在肝脏代谢中表现为糖代谢紊乱，即肝脏无法将血液中多余的葡萄糖转化为糖原进行贮存，进而逐渐丧失调节机体血糖浓度的功能。肝脏PAS结果显示，HFD破坏了肝脏的糖代谢过程，导致其糖原合成量减少，并且与之结果相一致的是，肝脏组织中与糖原合成过程相关的蛋白IRS-2和AKT磷酸化表达量也显著降低。高浓度的嗜酸乳杆菌JYLA-126则可以显著改善这一结果（图5A、C）。

已有研究表明，氧化应激引起的肝脏损伤是导致肝脏代谢紊乱以及炎症发生的罪魁祸首。Nrf2的磷酸化激活是开启抗氧化通路的重要开关。HFD诱导肥胖小鼠抗氧化蛋白P-Nrf表达抑制，肝脏组织内抗氧化酶SOD，CAT和GPx活性下降，肝脏过氧化产物MDA含量增加，另外，氧化应激所导致的肝损伤ALT，AST酶活性也显著升高。与此相较，高浓度的嗜酸乳杆菌JYLA-126可有效抑制肝脏氧化应激的发生，从而保护肝脏不受氧化损伤的危害（图5D-J）。

（5）嗜酸乳杆菌JYLA-126改善肝脏脂质代谢并缓解肝脏炎症水平

肝脏氧化应激引起的脂质过氧化反应会导致肝脏脂质代谢发生紊乱，多余的脂质无法通过正常代谢途径被清除将会引起肝脏的脂质积累。肝脏油红O染色结果显示，HFD组小鼠肝脏内脂滴总面积显著增大，高浓度的嗜酸乳杆菌JYLA-126则可以预防肝脏脂质堆积（图6A、B）。研究脂质代谢相关通路后发现，HFD可显著抑制以P-AMPK为中心的脂质代谢蛋白表达：1.促进SREBP1和Fas蛋白的表达来促进肝脏内脂肪合成、增加脂质积累。2.促进ACC1并抑制CPT1蛋白表达来激活脂质过氧化。另外小鼠血清中的血脂水平也显示相同结果，HFD诱导的肥胖小鼠血清中TG，TC，LDL和HDL含量显著增高，高浓度的嗜酸乳杆菌JYLA-126喂养后的小鼠则可以显著促进肝脏脂质代谢、降低脂质过氧化水平、避免高血脂的发生（图6C-G）。

Elisa检测结果表明，肥胖小鼠肝脏组织内的LPS含量显著增加，另外相关的促炎因子，如TNF-α，IL-1β，IL-6和IFN-γ的水平也显著增加。这不仅是因为内毒素LPS导致的炎症上调，与肝脏的氧化应激也存在相互促进的关系。然而高浓度的嗜酸乳杆菌JYLA-126则阻止了肝脏LPS的浸润以及促炎因子的表达，有利于肝脏健康与正常代谢（图6H-L）。

（6）嗜酸乳杆菌JYLA-126改善白色脂肪堆积并促进棕色脂肪产热

脂肪组织可分为白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）。白色脂肪组织是身体的能量仓库，它可以将多余的能量以脂肪的形式储藏起来；棕色脂肪组织则是通过它细胞内大量的线粒体消耗能量并产生热能。区别于囤积脂肪的白色脂肪组织，棕色脂肪组织能够燃烧脂肪，从而被认为是治疗肥胖和其肥胖相关的代谢疾病的重要靶标。

观察附睾白色脂肪（Epididymal WAT）的H&E染色结果可以发现，高浓度的嗜酸乳杆菌JYLA-126显著抑制HFD诱导的脂肪积累和脂肪细胞膨胀（图7A、B）。肩胛骨棕色脂肪（Scapular BAT）的H&E染色结果分析显示HFD诱导的BAT细胞面积逐渐减小，并出现向白色脂肪转变的趋势，即细胞内的脂滴显著增大。与此同时,高浓度的嗜酸乳杆菌JYLA-126阻止了BAT细胞的“白化”（图7C、D）。另外，如图7E-H所示，从小鼠中分离出的四种脂肪组织：附睾脂肪（Epi-WAT）、腹股沟脂肪（Ing-SAT）、肠系膜脂肪（Mes-WAT）和肾周脂肪（Per-WAT）的重量均在HFD的作用下显著增加，而在嗜酸乳杆菌JYLA-126的作用下显著降低。

在肥胖症中，WAT的积累导致整体体重的增加。这种脂肪组织堆积是由细胞增生和肥大引起的，脂肪增生通过脂肪形成和脂肪生成发生，其中前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞，有赖于组织中C/EBPα、PPARγ和aP2蛋白的表达。如图7I所示，与HFD处理组相比，添加嗜酸乳杆菌JYLA-126可使肥胖小鼠成脂因子C/EBPα、PPARγ和aP2蛋白表达降低。

解偶联蛋白1（UCP1）存在于棕色脂肪组织的线粒体中，能够将葡萄糖和脂肪酸分解产生的能量转化为热能，抑制ATP（为生物体直接供能的物质）的产生，以此介导褐色脂肪产热，从而帮助动物抵御低温、肥胖及相关代谢紊乱。如图7J、K所示，HFD喂养的小鼠显示UCP1蛋白表达抑制，与此相比，高浓度的嗜酸乳杆菌JYLA-126可以显著提高肥胖小鼠的UCP1表达量，从而促进机体的能量消耗。

尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1. 一种预防和/或治疗肥胖及代谢综合征的产品，其特征在于，包括嗜酸乳杆菌JYLA-126包被液，嗜酸乳杆菌JYLA-126包被液由嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）JYLA-126和细菌包被液混合制得，嗜酸乳杆菌JYLA-126已于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.18095。

2.如权利要求1所述的产品，其特征在于，嗜酸乳杆菌JYLA-126的浓度为1×10⁴~1×10⁹CFU/mL。

3.一种如权利要求1所述产品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）复苏嗜酸乳杆菌JYLA-126；（2）制备细菌包被液；（3）将复苏的嗜酸乳杆菌JYLA-126重悬于细菌包被液中，制得嗜酸乳杆菌JYLA-126包被液。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）具体为将嗜酸乳杆菌JYLA-126从菌库中取出，接种于MRS培养基中，在37℃恒温培养箱依次进行厌氧与需氧培养，完成一次活化，接着再次进行厌氧与需氧培养，完成二次活化，得到复苏的嗜酸乳杆菌JYLA-126。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）具体为1000mL纯净水中加入0.1g明胶，置于60℃水浴中，待明胶完全溶解制得细菌包被液。

6.如权利要求1所述产品在预防和/或治疗肥胖及代谢综合征方面的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗通过调节肠道菌群、维持肠道健康实现。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗通过改善肝脏糖代谢并减轻肝脏氧化应激、改善肝脏脂质代谢并缓解肝脏炎症水平实现。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗通过改善白色脂肪堆积并促进棕色脂肪产热实现。