CN114480219B - 提高银杏叶中银杏萜内酯含量的微生物功能菌群及其制备和应用 - Google Patents
提高银杏叶中银杏萜内酯含量的微生物功能菌群及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种提高银杏叶中银杏萜内酯含量的微生物功能菌群及其制备和应用。本发明的微生物功能菌群具有多菌种、多功能和易定植的特性,能有效提高土壤有机质含量,加快物质转化,促进植物生长和物质合成,而且具有拮抗重金属离子、解钾、解磷、固氮的功能。将所述功能菌群施用于银杏苗,在九、十月份,银杏叶中银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯的含量增加分别在74%‑79%、61%‑67%、70%‑77%和59%‑79%之间,总银杏萜内酯增加量在59%‑75%之间。本发明解决了现有银杏叶中银杏萜内酯含量低、生产方法不成熟的问题,以减少化学肥料的使用,并显著提高了银杏叶中银杏萜内酯含量。
Description
技术领域
本发明涉及到一种可显著提高银杏叶中银杏萜内酯含量的微生物功能菌群及其制备和应用方法,属于微生物提升有效药用成分技术领域。
背景技术
药用植物是中医药事业的原材料,我国拥有世界上最丰富的药用植物资源。目前,对药用植物的研究主要集中在天然有效成分的提取、药用部位及药用成分的开发、遗传多样性研究、分类学研究和连作障碍研究等。银杏也同样如此。银杏与其根际微生物之间也存在着相互作用。药用植物存活以及药用部位产量和质量会受到多种因素的影响,其中药用植物根际微生物的影响是近几年关注和研究的热点内容。然而,目前相关研究对促银杏药用成分合成的关键微生物鲜见报道。
银杏萜内酯的含量是银杏叶及其制剂质量控制的关键指标,一直是备受研究学者关注。银杏萜内酯是血小板活化因子的天然拮抗剂,也是治疗心血管疾病的首选天然药物。银杏萜内酯由倍半萜内酯(白果内酯)和二萜内酯(银杏内酯)组成,是银杏叶中一类重要的活性成分。具体来说,银杏萜内酯多达十几种,其中银杏内酯B的生物活性最强;白果内酯属倍半萜内酯,是目前从银杏叶中发现的唯一的一个倍半萜内酯化合物。但是,天然银杏萜内酯因其在银杏叶中含量很低(一般在0.25%以下)且产量有限而未得到充分的开发和应用。
目前,针对提高银杏萜类内酯的生产,已有研究方法主要包括多种物理、生物、化学的方法。除了对银杏种植条件的调整优化之外,研究者们对银杏萜内酯的化学合成也进行了研究。但因银杏萜内酯分子结构复杂,化学合成技术难度大,成本高,难以规模化生产。已有的生物学方法包括银杏组织和细胞培养、基因工程等生物技术也很难实现。近年来,学者利用从银杏的根、茎中分离得到的天然菌株曲霉属、盘长孢属、孢霉属、尖孢镰刀菌等真菌均能生产银杏内酯及其类似物。利用菌类生产银杏内酯具有产量高、成分单一等优点,应用前景较好,但目前发现的内生微生物极少达到工业化生产标准。总之,目前仍以银杏叶为底物溶剂提制法最有市场发展前景,而有效提高银杏叶中银杏萜内酯的含量就变得尤为重要。重组菌群体系用于提高植物药用有效成分仍然处于起步阶段。重组微生物体系的构建,可以避免化学合成、基因工程以及生物合成等方法带来的诸多不足,应用前景较好,能够促进微生物菌剂施用指标的完善,对银杏萜内酯生产具有重要的意义。
发明内容
本发明的首要目的是针对现有银杏叶中银杏萜内酯含量低、生产方法不成熟的问题,提供一种可显著提高银杏叶中银杏萜内酯含量的微生物功能菌群及其制备方法,有效促进了银杏代谢及银杏叶内银杏萜内酯的积累,大大提高了银杏萜内酯的产量。
本发明的目的是通过以下方式实现的。
一种提高银杏叶中银杏萜内酯含量的微生物功能菌群,所述功能菌群包括:灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)、类芽孢杆菌(Paenibacillusprosopidis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)、苍白杆菌(Ochrobactrumpecoris)、内生固氮菌(Herbaspirillumfrisingense)以及奥氏根瘤菌(Rhizobium alamii)混合而成。
进一步地,所述功能菌群包括:灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)ATCC23920、类芽孢杆菌(Paenibacillusprosopidis)DSM 22405、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ATCC 6051、嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)DSM 14405、苍白杆菌(Ochrobactrumpecoris)DSM 23868、内生固氮菌(Herbaspirillumfrisingense)DSM13128以及奥氏根瘤菌(Rhizobium alamii)LMG24466混合而成。
所述的微生物功能菌群,均按照2-10%的接种量接种混合培养得到功能菌群。
进一步地,所述的微生物功能菌群:先将各种微生物单独培养,当达到对数生长期时,再混合培养得到功能菌群。
更进一步地,菌株单独培养和混合菌群一起培养时的培养基均为添加0.1-0.15g/L氯霉素的马铃薯葡萄糖培养基;培养条件均为:温度为25-30℃,转速为150-160rpm,初始pH值为6.5-8.0,培养时间为2-4天。
上述培养基为0.1-0.15g/L氯霉素的马铃薯葡萄糖培养基(PDB),以调控微生物的代谢和减少污染。加入氯霉素,细菌在液体中生长状态会比较好,更主要这些细菌都具有氯霉素抗性。
所述的微生物功能菌群,在单独培养菌株和培养混合菌群时,需要严格遮光。
在培养过程中,进行遮光处理,以避免光对微生物代谢产生影响。有些菌在光照24小时后发酵液会发红,形态明显改变。
本发明的第二个目的是提供所述的微生物功能菌群的应用方法,将所述的微生物功能菌群加入到银杏根围土壤中以提高银杏叶中银杏萜内酯含量。
进一步地,在混合菌群培养完成后,离心去掉上清液,加入PDB培养基,重悬后,再次离心,重复洗涤3-6次,待洗涤完成后,收集到的菌体用PDB培养基稀释成菌悬液,并采用一次性灌根接种施用。
更进一步地,在混合菌群培养完成后,离心,去掉上清液,加入等量PDB培养基,重悬后,再次离心,重复洗涤3-6次,待洗涤完成后,收集到的菌体用PDB培养基稀释成1×108-1×109CFU·mL-1菌悬液,并采用一次性灌根接种按照银杏盆栽土壤质量(kg):功能微生物菌群菌悬液体积(L)=20:1-30:1的接种量施用。
最优选:在混合菌群培养完成后,3000-5000rpm离心8-10分钟,去掉上清液,加入等量PDB培养基,重悬后,再次离心,重复洗涤3-6次,待洗涤完成后,收集到的菌体用PDB培养基稀释成1×108-1×109CFU·mL-1菌悬液,并采用一次性灌根接种法按照银杏盆栽土壤质量(kg):功能微生物菌群发酵液体积(L)=20:1-30:1的接种量施用。
作为进一步的改进,自施加功能微生物菌群后,对银杏树进行定期浇水,并每隔一个月采集一次银杏叶,经105℃杀青后,55℃烘箱烘4-8小时,使用研磨仪对烘干银杏叶进行研磨至粉碎,重复3-5次后,过400目网筛,然后采用有机试剂抽提的方法进行银杏萜内酯的抽提,最后经液相色谱检测各银杏萜内酯含量。首先,银杏萜内酯标准样品的制备,分别精密称取白果内酯,银杏内酯C,银杏内酯A,银杏内酯B标准样品20,10.0,10.0,10.0mg,用甲醇分别定容到50mL,根据精密称定样品的量得到标准品白果内酯,银杏内酯C,银杏内酯A,银杏内酯B溶液浓度分别为0.40,0.20,0.20,0.20mg/mL,通过自动进样器控制进样体积得到白果内酯,银杏内酯C,银杏内酯A,银杏内酯B浓度为0.020,0.040,0.060,0.080,0.100mg/mL;进而可以得到样品进样量与响应值峰面积的对数的线性相关性,制作出标准曲线。混合标样和样品银杏萜内酯含量的检测依托高效液相色谱仪,检测条件如下:自动进样器设置为10μL的进样体积,流速0.6mL/min;色谱柱柱温为35℃;检测器设置检测波长为360nm;提取洗脱程序设置为0~15min,流动相:V(甲醇):V(水)=50:50;色谱柱:YMC-Triart C18(250mm×4.6mm,5μm)。。
本发明的微生物功能菌群具有多菌种、多功能和易定植的特性,能有效提高土壤有机质含量,加快物质转化,促进植物生长和物质合成,而且具有拮抗重金属离子、解钾、解磷、固氮的功能。本发明解决了现有银杏叶中银杏萜内酯含量低、生产方法不成熟的问题,以减少化学肥料的使用,并显著提高了银杏叶中银杏萜内酯含量,为银杏叶银杏萜内酯的规模化生产提供了一定的理论依据和技术支撑。
附图说明
图1为不同月份中本发明功能微生物菌群对银杏叶银杏萜内酯产量的影响。
图2为不同月份中本发明功能微生物菌群对银杏叶银杏萜内酯各组分的影响。
具体实施方式
以下通过具体实施案例对本发明做详细说明,具体实施案例仅为举例说明,不作为对本发明实施范围的限定。
实施例1:功能微生物初步筛选
为解决现有银杏叶中银杏萜内酯含量低、生产方法不成熟等问题,最直接的方法是构建一种可有效提高银杏萜内酯含量的功能菌群,在促进银杏生长的同时,提高银杏萜内酯的含量。本发明选择的微生物功能菌群具有多菌种、多功能和易定植的特性,能有效提高土壤有机质含量,加快物质转化,促进植物生长和物质合成,而且具有拮抗重金属离子、解钾、解磷、固氮的功能。另外,功能微生物使用的培养基要求成分简单,成本低。前期探索实验:以十月份为例,不同搭配菌群的施用效果如下:
以下组合中每种菌都是按照5%等比例混合,混合菌群均在相同条件下培养完成后,离心,去掉上清液,加入等量PDB培养基,重悬后,再次离心,重复洗涤4次,待洗涤完成后,收集到的菌体均用PDB培养基稀释成1×109CFU·mL-1左右的菌悬液,并采用一次性灌根接种按照银杏盆栽土壤质量(kg):功能微生物菌群菌悬液体积(L)=25:1的接种量施用。
菌群A:灰绿链霉菌、嗜根寡养单胞菌、类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苍白杆菌、内生固氮菌以及奥氏根瘤菌等比例混合培养,进行与银杏苗的共培养试验,结果表明银杏叶中银杏萜内酯的含量增加了54.11-65.23%,与对照组相比差异极其显著;
菌群B:灰绿链霉菌和嗜根寡养单胞菌等比例混合培养,进行与银杏苗的共培养试验,结果表明银杏叶中银杏萜内酯的含量增加了5.11-8.02%,与对照组相比差异不显著;
菌群C:类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苍白杆菌、内生固氮菌以及奥氏根瘤菌等比例混合培养,进行与银杏苗的共培养试验,结果表明银杏叶中银杏萜内酯的含量增加了34.29-37.47%,与对照组相比差异显著;
菌群D:苍白杆菌、内生固氮菌以及奥氏根瘤菌等比例混合培养,进行与银杏苗的共培养试验,结果表明银杏叶中银杏萜内酯的含量增加了25.76-29.10%,与对照组相比差异不显著;
菌群E:灰绿链霉菌、嗜根寡养单胞菌、苍白杆菌、内生固氮菌以及奥氏根瘤菌等比例混合培养,进行与银杏苗的共培养试验,结果表明银杏叶中银杏萜内酯的含量增加了22.35-37.55%,与对照组相比差异不显著;
菌群F:类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等比例混合培养,进行与银杏苗的共培养试验,结果表明银杏叶中银杏萜内酯的含量增加了19.33-24.05%,与对照组相比差异不显著;
菌群G:灰绿链霉菌、嗜根寡养单胞菌、类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等比例混合培养,进行与银杏苗的共培养试验,结果表明银杏叶中银杏萜内酯的含量增加了45.81-51.34%,与对照组相比差异显著;
菌群H:枝状枝孢霉和黄曲霉等比例混合培养,进行与银杏苗的共培养试验,结果表明银杏叶中银杏萜内酯的含量增加了3.16-6.22%,与对照组相比差异不显著。
对照组是指施加相同体积的无菌水与银杏苗的共培养,但不加入任何微生物。
从5月份银杏叶刚长完全时施加,9、10月份各测定一次,每个实验组都有6-10个平行,取平均值。
根据以上结果显示菌群A效果最好,有效性持久,能够显著提高银杏叶中银杏萜内酯含量的微生物功能菌群,并再次优化菌群的制备过程,最终得到能够显著提高银杏叶中银杏萜内酯含量的微生物功能菌群。
实施例2:功能微生物的组成及来源
本发明制备功能菌群的微生物均购自于各菌种保藏库,分别为灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)ATCC 23920、类芽孢杆菌(Paenibacillusprosopidis)DSM22405、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6051、嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)DSM 14405、苍白杆菌(Ochrobactrumpecoris)DSM23868、内生固氮菌(Herbaspirillumfrisingense)DSM 13128以及奥氏根瘤菌(Rhizobiumalamii)LMG 24466混合而成。另外,前期所涉及的功能菌株筛选使用了枝状枝孢霉(Cladosporium cladosporioides)ATCC 16022和黄曲霉(Aspergillus flavus)ATCC22546。
2017年10月购于德国微生物及细胞保藏中心(DSM)的菌株包括:
类芽孢杆菌(Paenibacillus prosopidis)DSM 22405、嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)DSM 14405、苍白杆菌(Ochrobactrum pecoris)DSM23868、内生固氮菌(Herbaspirillum frisingense)DSM 13128。
2018年5月购于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的菌株包括:
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6051、枝状枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)ATCC 16022、黄曲霉(Aspergillus flavus)ATCC 22546、灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)ATCC 23920。
2017年10月购于国家典型培养物保藏中心(NTCC)的菌株为:奥氏根瘤菌(Rhizobium alamii)LMG 24466。
实施例3:各微生物菌株及功能微生物菌群的培养方法
以实施例1菌群A中各微生物为对象单独培养,培养基为含0.12g/L氯霉素的马铃薯葡萄糖培养基(PDB),以调控微生物的代谢和减少污染。培养条件为:温度为26℃,转速为150rpm,初始pH值为7.0,在培养过程中,进行遮光处理,培养到对数期,收集菌体并计数。然后,根据微生物数量等比例混合,均按照5%的接种量混合接种,培养基为含0.12g/L氯霉素的马铃薯葡萄糖培养基(PDB),培养条件均为:温度为26℃,转速为150rpm,初始pH值为7.0,在培养过程中,进行遮光处理,培养3天,收集菌体,即为功能微生物菌群。
实施例4:功能微生物菌群的应用
将实施例3中已培养好的功能微生物菌群,利用高速离心机,4000rpm离心10分钟,去掉上清液,加入等量PDB培养基,重悬后,再次离心,重复洗涤6次,待洗涤完成后,收集到的菌体用PDB培养基进一步重悬稀释成1×109CFU·mL-1左右的菌悬液,并采用一次性灌根接种法按照银杏盆栽土壤质量(kg):功能微生物菌群发酵液体积(L)=25:1的接种量施用。
实施例5:使用研磨仪对银杏叶的处理
按照实施例4施用后,对银杏树进行定期浇水,并每隔一个月采集一次银杏叶,经105℃杀青后,55℃烘箱烘4-8小时,使用研磨仪对烘干银杏叶进行研磨至粉碎,重复3-5次后,过400目网筛,然后采用有机试剂抽提的方法(采用乙醇,丙酮,乙酸乙酯,分开等比例抽提,然后把三种萃取液混合在一起,经过旋转蒸发仪旋蒸10-25分钟至无明显液体,加入3-5mL甲醇重溶待测)进行银杏萜内酯的抽提,最后经液相色谱检测各银杏萜内酯含量。中间涉及到研磨仪的程序设定,具体如下:第一步,速度60-70Hz,温度0.0-4.0℃,用时200-240S;第二步,速度60-70Hz,温度-10.0--20.0℃,用时100-150S;第三步,速度40-50Hz,温度-20.0--25.0℃,用时100-150S;第四步,速度60-70Hz,温度-20.0--25.0℃,用时100-150S;第五步,速度60-70Hz,温度-10.0--20.0℃,用时200-300S。
实施例6:功能微生物对银杏萜内酯产量的影响
从5月份银杏叶刚长完全时施加,每月15号测定一次,每个实验组都有6-10个平行,取平均值。自施加功能微生物菌群后,结果发现,投加功能微生物菌群的实验组,在不同月份,其银杏萜内酯含量均高于对照组(即未施加功能微生物菌群),并有持续性作用,具体如图1所示。对其各成分进一步比较分析发现,实验组各萜内酯含量增加显著。在九、十月份,银杏叶中银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯的含量增加分别在74%-79%、61%-67%、70%-77%和59%-79%之间,总银杏萜内酯增加量在59%-75%之间。具体如图2所示。由此可见,以该功能微生物菌群作为菌肥进行施加,可显著提高银杏叶中银杏萜内酯的含量。
Claims (9)
1.一种提高银杏叶中银杏萜内酯含量的微生物功能菌群,其特征在于,所述功能菌群包括:灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)ATCC 23920、Paenibacillus prosopidis DSM 22405、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6051、嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)DSM 14405、Ochrobactrum pecoris DSM 23868、佛莱辛草螺菌(Herbaspirillum frisingense)DSM 13128以及奥氏根瘤菌(Rhizobium alamii)LMG 24466混合而成。
2.根据权利要求1所述的微生物功能菌群,其特征在于,均按照2-10%的接种量接种混合培养得到功能菌群。
3.根据权利要求2所述的微生物功能菌群,其特征在于,先将各种微生物单独培养,当达到对数生长期时,再混合培养得到功能菌群。
4.根据权利要求1所述的微生物功能菌群,其特征在于,菌株单独培养和混合菌群一起培养时的培养基均为添加0.1-0.15 g/L氯霉素的马铃薯葡萄糖培养基;培养条件均为:温度为25-30℃,转速为150-160rpm,初始pH值为6.5~8.0,培养时间为2~4天。
5.根据权利要求1所述的微生物功能菌群,其特征在于,在单独培养菌株和培养混合菌群时,需要严格遮光。
6.权利要求1-5任一项所述的微生物功能菌群的制备方法,其特征在于,先将各种微生物单独培养,当达到对数生长期时,均按照2-10%的接种量接种混合培养得到功能菌群;菌株单独培养和混合菌群一起培养时的培养基均为添加0.1-0.15 g/L氯霉素的马铃薯葡萄糖培养基;培养条件均为:温度为25-30℃,转速为150-160rpm,初始pH值为6.5~8.0,培养时间为2~4天;在单独培养菌株和培养混合菌群时,需要严格遮光。
7.权利要求1-5任一项所述的微生物功能菌群的应用方法,其特征在于,将所述的微生物功能菌群加入到银杏根围土壤中以提高银杏叶中银杏萜内酯含量。
8.根据权利要求7所述的应用方法,其特征在于,在混合菌群培养完成后,离心去掉上清液,加入PDB培养基,重悬后,再次离心,重复洗涤3-6次,待洗涤完成后,收集到的菌体用PDB培养基稀释成菌悬液,并采用一次性灌根接种施用。
9.根据权利要求8所述的应用方法,其特征在于,在混合菌群培养完成后,离心,去掉上清液,加入等量PDB培养基,重悬后,再次离心,重复洗涤3-6次,待洗涤完成后,收集到的菌体用PDB培养基稀释成1 × 108 -1 × 109CFU·mL-1菌悬液,并采用一次性灌根接种按照银杏盆栽土壤质量(kg):功能微生物菌群菌悬液体积(L)=20:1-30:1的接种量施用。
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GR01 | Patent grant | ||
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