CN114468150B - 龙胆酸在促进幼龄反刍动物生长及瘤胃发育中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了龙胆酸在促进幼龄反刍动物生长及瘤胃发育中的应用，龙胆酸可以作为天然植物饲料添加剂在幼龄反刍动物精料开食料中应用，通过促进瘤胃上皮形态及功能的发育，提高羔羊等幼龄反刍动物的开食料采食量及平均日增重。本发明发现龙胆酸通过调节幼龄反刍动物细胞增殖分化相关蛋白的表达进而促进瘤胃上皮的发育，促进羔羊等幼龄反刍动物生长及瘤胃发育，提高动物的出栏率。所以，龙胆酸可以用于制备促进幼龄反刍动物生长及瘤胃发育的饲料添加剂或者药物。

Description

龙胆酸在促进幼龄反刍动物生长及瘤胃发育中的应用
技术领域
本发明属于饲料添加剂领域，具体涉及龙胆酸在促进幼龄反刍动物生长及瘤胃发育中的应用。
背景技术
反刍动物产业是缓解人畜争粮压力，促进居民饮食结构调整，保障畜产品多样化供给的重要支柱产业。近年来，中国肉羊产业迅猛发展，集约化、规模化养殖成主要趋势。为满足居民对羊肉的极大需求，加大羔羊精料补充量的饲喂量，进而加快瘤胃生长发育，以期达到提前断奶并提高出栏速率的目的。在实际生产中，羔羊若不及时补充精料开食料等固体饲粮，瘤胃因未受到有效的物理和化学刺激而不能充分发育，导致羔羊生长缓慢，体重不能达到出栏要求，增加饲喂成本；然而过早或者过度饲喂开食料又会引发各种瘤胃健康问题，例如酸中毒和角化不全。相关研究表明，精料颗粒饲料与瘤胃上皮角化不全具有一定相关性，瘤胃上皮角化不全现象在饲喂犊牛全精日粮情况下可以观察到。瘤胃上皮角化不全会导致瘤胃摄取能量不足和物理屏障损伤，最终导致动物生长发育和健康受到严重影响。
幼龄反刍动物消化系统具有特殊性，从非反刍阶段向反刍阶段过渡面临营养源和消化生理功能的剧烈转变。在这一重大转变过程中，日粮供应模式从完全液态饲料向固体饲料逐渐转变，消化吸收生理从液态奶提供氨基酸到瘤胃合成菌体蛋白提供氨基酸，从小肠吸收葡萄糖和长链脂肪酸提供能量到瘤胃微生物发酵产生挥发性脂肪酸和酮体供量。在这一重大生理转变过程中，瘤胃上皮乳头向瘤胃腔中生长，乳头发育过程中瘤胃上皮基底层细胞迁移至上层分化为角质细胞并执行特定功能，但是在乳头生长中会引发很多健康问题，例如乳头生长过慢导致机体发育迟缓，生长过快导致角质层过厚影响营养物质的吸收，若在此关键过渡阶段，瘤胃发育调控不佳，很容易导致机体能量吸收不足发育滞后和各种瘤胃健康疾病。因此，解决羔羊瘤胃发育问题，已成为羔羊饲料产业及犊牛养殖过程中迫切需要解决的问题。
龙胆酸(2,5-二羟基苯甲酸，2,5-DHBA)，分子式为：C7H6O4，是一种从植物中提取的植物活性物质，属于多羟基酚类化合物，广泛存在于绿色植物中，如柑橘、葡萄和龙胆根等。龙胆酸在医学和医药方面有着重要作用，可以抗氧化、保护心脏和肝、抵抗毒性、抗癌、抗炎、亮肤等诸多有利作用。但是在饲料应用方面未见报道。
发明目的
发明内容：针对现有技术存在的问题，本发明提供龙胆酸在促进幼龄反刍动物生长及瘤胃上皮发育中的应用。本发明提出了一种龙胆酸的新功能，可以在幼龄反刍动物精料开食料基础上口腔灌服，有效促进幼龄反刍动物生长和瘤胃上皮发育，通过促进瘤胃上皮形态及功能的发育，提高羔羊等幼龄反刍动物的开食料采食量及平均日增重，进而缩短羔羊断奶时间，提高出栏速率，加大对市场的羊肉供应量。
本发明还提供一种促进幼龄反刍动物生长及瘤胃发育的饲料添加剂。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述龙胆酸在促进幼龄反刍动物生长及瘤胃发育中的应用。
本发明所述的龙胆酸在制备促进幼龄反刍动物生长及瘤胃发育的饲料添加剂或者药物中的应用。
其中，所述幼龄反刍动物为羔羊或犊牛。
进一步地，所述龙胆酸在动物饲料基础上作为天然植物饲料添加剂促进幼龄反刍动物生长及瘤胃上皮发育中的应用。
其中，所述龙胆酸在动物饲料基础上口腔灌服。
作为优选，所述口腔灌服龙胆酸为90-120mg/kg体重幼龄反刍动物。
进一步地，所述口腔灌服龙胆酸为100mg/kg体重幼龄反刍动物。
其中，所述饲料为精料开食料。
其中，所述的动物生长阶段为出生后到断奶前。
本发明所述促进幼龄反刍动物生长及瘤胃发育的饲料添加剂，所述饲料添加剂包括龙胆酸作为有效成分，以及饲料添加剂所需辅料。
为应对以上羔羊饲养产业面临的问题，本发明前期对饲喂羊奶组羔羊和饲喂羊奶+苜蓿组羔羊瘤胃主要代谢物测定和代谢组研究结果(如图1所示)，发现在饲喂羊奶+苜蓿组羔羊瘤胃代谢物中含有较多植物活性物质如水杨酸和龙胆酸，所以之后重点研究这两种植物活性物质。
设计原理：通过体外CCK8细胞试验验证这两种植物活性物质对瘤胃上皮细胞的增殖分化作用，结果表明在瘤胃上皮细胞中添加水杨酸对其没有促增殖作用(如图2所示)，而一定浓度的龙胆酸对瘤胃上皮细胞有显著的促增殖作用(如图3所示)，通过CCK8细胞增殖试验初步确定了龙胆酸较水杨酸对瘤胃上皮细胞有很好的促生长效果，接着为进一步确定龙胆酸对瘤胃上皮细胞促增殖的最佳浓度，又通过Edu检测不同浓度对瘤胃上皮细胞的促生长作用，确定了龙胆酸在50ug/mL处对瘤胃上皮有较好的促增殖作用(如图4所示)，同时为了进一步在体验证龙胆酸对羔羊瘤胃发育的促进作用对湖羊羔羊进行口腔灌服龙胆酸，试验发现龙胆酸可有效促进羔羊生长及瘤胃发育。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明所使用的龙胆酸是一种经济有效的植物源饲料添加剂，本发明提出了一种龙胆酸的新功能，可以在幼龄反刍动物精料开食料基础上口腔灌服，促进幼龄反刍动物生长及瘤胃上皮发育；在体试验中，龙胆酸处理有提高羔羊平均日增重的趋势，提高比例可达到63.86％。说明龙胆酸可以在幼龄反刍动物精料开食料基础上作为天然植物饲料添加剂，促进羔羊等幼龄反刍动物生长及瘤胃发育，提高动物的出栏率。所以，龙胆酸可以用于制备促进幼龄反刍动物生长及瘤胃发育的天然植物饲料添加剂。
附图说明
图1为M和MH组植物活性物质代谢组结果；
图2为体外添加水杨酸影响瘤胃上皮细胞增殖的CCK8折线图；
图3为体外添加龙胆酸影响瘤胃上皮细胞增殖的CCK8折线图；
图4为体外添加龙胆酸影响瘤胃上皮细胞增殖的Edu免疫荧光图；
图5为对照组和龙胆酸组羔羊屠宰后瘤胃组织对比图；
图6为对照组和龙胆酸组羔羊瘤胃组织和瘤胃上皮乳头HE切片对比图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
实施例中所使用的原料和仪器都是市售可得。
水杨酸购自Sigma Aldrich。
BeyoClickTMEdu-594细胞增殖检测试剂盒购自碧云天。
龙胆酸购自中国阿拉丁公司。
龙胆酸分子式为：C7H6O4，结构式如下：
Figure BDA0003490117400000031
实施例1
试验选择3只56日龄性别一致，体重相近的湖羊公羔羊用于细胞试验。羔羊屠宰后立即分离瘤胃，用6倍的青链霉素的D-Hanks溶液多次冲洗，去除瘤胃内容物，然后再漂洗2-3次，能有效的去除残留的细菌和真菌。收集瘤胃腹囊部上皮组织块，加入含0.25％的胰蛋白酶液，在37℃水浴中消化30min，一般羊的瘤胃上皮组织的消化时间为2-3h。清洗后用含0.25％胰蛋白酶继续消化，直到看到有细碎细胞脱落(大部分是椭圆形细胞时开始收集)，间隔5min收集一次细胞消化液。收集的细胞消化液用70μm的滤膜进行过滤，离心，重悬，将细胞接种到培养瓶中，置于5％CO2，37℃培养箱中培养。待细胞融合到70-80％，进行传代，96孔板中每个孔接种5000个细胞，完全培养液培养24h，之后进行饥饿处理24h，加入不同浓度的水杨酸培养24h，换液，加入10ulCCK8培养3h，在450nm处测定OD值。通过体外CCK8细胞试验验证水杨酸对瘤胃上皮细胞的增殖分化作用，水杨酸浓度为0、0.5、5、50、500ug/ml，如图2所示结果表明在瘤胃上皮细胞中添加水杨酸对其没有促增殖作用。
实施例2
细胞处理同实施例1。通过体外CCK8细胞试验验证龙胆酸对瘤胃上皮细胞的增殖分化作用，龙胆酸浓度为0、5、50、500、5000ug/ml，如图3所示结果表明龙胆酸在50ug/ml处对瘤胃上皮细胞有增殖作用。
实施例3
为进一步确定龙胆酸对瘤胃上皮细胞促增殖的最佳浓度，通过Edu检测不同浓度龙胆酸对瘤胃上皮细胞的促生长作用。细胞前处理同实施例1。细胞传代后，将细胞按照每个爬片50000个接种于24孔板，完全培养液培养24h，之后饥饿处理24h，加入不同浓度龙胆酸和Edu(10μM)培养24h，染色之后使用共聚焦显微镜观察。图4所示龙胆酸在50ug/mL处对瘤胃上皮有较好的促增殖作用，与CCK8结果一致，所以结合以上结果表明相当于水杨酸来说龙胆酸对瘤胃上皮细胞有更好的促生长效果。
实施例4
试验选择8对体况良好，胎次一致，体重相近的新生双胎湖羊羔羊。在28日龄，将其随机分为两组，一组按100mg/kg体重口腔灌服龙胆酸(处理组，GA,n＝8)，另一组口腔灌服相同体积的生理盐水(对照组，Con,n＝8)，每天8：00和17：00各灌服一次，灌服体积根据每周称量的体重调整一次(保持100mg/kg)。龙胆酸粉末(阿拉丁，中国)是溶解在水中，最终的浓度是15mg/mL。在灌服期间，羔羊跟随母羊自由哺乳和饮水，在补饲栏中补饲开食料，没有羔羊能够接触母羊的饲料。每天监测羔羊饲喂栏的开食料，以确保所有羔羊始终都有新鲜的开食料采食。每天记录羔羊开食料采食量，每周监测羔羊体重变化。试验开始前，两组羔羊的体重没有显著差异(8.30±0.61vs.8.33±0.59kg，P＝0.977)。开食料依据湖羊开食料营养需要标准(NY/Y816-2004；中国农业部,2004)设计开食料配方，组成见表1。
表1试验开食料组成与营养水平
Figure BDA0003490117400000051
实施例5
试验期间每天称量实施例4的对照组和试验组的开食料采食量，每周监测实施例4的对照组和试验组羔羊体重变化，龙胆酸灌服对羔羊开食料的平均日采食量和平均日增重的影响结果如表2。
表2.龙胆酸灌服对羔羊开食料的平均日采食量和平均日增重的影响
Figure BDA0003490117400000052
注：数据以平均值±标准误形式表示，n＝8；ADG，平均日增重；ADFI，平均日采食量
由表2可知，龙胆酸灌服显著提高了羔羊平均日采食量，与对照组相比，龙胆酸处理有提高羔羊平均日增重的趋势，提高比例可达到63.86％，证明龙胆酸灌注有良好的促进羔羊生长的效果。
实施例6
取实施例4的羔羊56日龄时，早晨饲喂4-5小时后进行屠宰。屠宰后立即分离瘤胃并称重(对应实施例7瘤胃器官指数)，如图5所示为对照组和龙胆酸组羔羊屠宰后瘤胃组织对比图，可看出灌服龙胆酸组羔羊瘤胃发育较好。收集有代表性的瘤胃内容物测定pH值，测定完pH值后的瘤胃内容物四层纱布过滤收集瘤胃液，-20℃保存待测挥发性脂肪酸浓度。采集瘤胃组织用于测定瘤胃器官指数，采集腹囊部的瘤胃上皮测定瘤胃形态结构(对应实施例7乳头形态和瘤胃各层细胞厚度)。
实施例7
检测龙胆酸灌服对羔羊瘤胃器官指数和瘤胃上皮乳头形态结构的影响：
取实施例4的在羔羊56日龄时屠宰采样，羔羊屠宰后立即分离瘤胃，去除瘤胃内容物后用于称重；取3块瘤胃腹囊部的1*1cm2的瘤胃上皮，使用放大倍率为2.5倍的放大镜(MG3B-1A，上海)测定乳头密度，每头羊每块瘤胃上皮取15个瘤胃乳头用于测定瘤胃上皮乳头长度和宽度，乳头的表面积/cm2计算为乳头长度×宽度×密度(乳头数/cm2)×2；每头羔羊选取瘤胃腹囊的瘤胃上皮进行组织形态学分析，将固定在4％多聚甲醛的瘤胃乳头样品，包埋在石蜡中，切成6μm厚，并用苏木精和曙红染色，使用Image Pro Plus(MediaCybernetics，美国)软件测量瘤胃乳头的角质层，颗粒层，棘突层和基底层的厚度。结果如表3和图6所示。
表3.龙胆酸灌服对羔羊各器官重量和瘤胃上皮乳头形态学的影响
Figure BDA0003490117400000061
注：数据以平均值±标准误形式表示，n＝8
由表3可知，龙胆酸灌服显著提高了羔羊瘤胃干重与体重的比值，与对照组相比，龙胆酸灌服有提高瘤胃干重的趋势。龙胆酸灌服显著提高了瘤胃上皮乳头长度、宽度和瘤胃上皮吸收表面积，对瘤胃壁厚度和乳头数无显著影响，图6结果也可看出龙胆酸灌服能促进瘤胃上皮乳头的长度和宽度。龙胆酸灌服显著提高了棘突层和基底层厚度以及总厚度，显著降低了角质层和颗粒层的厚度。上述结果说明，龙胆酸灌服可有效促进瘤胃上皮形态学发育。
综上，龙胆酸可以在幼龄反刍动物精料开食料基础上口腔灌服，有效促进幼龄反刍动物生长和瘤胃上皮发育，通过促进瘤胃上皮形态及功能的发育，提高羔羊等幼龄反刍动物的开食料采食量及平均日增重，进而缩短羔羊断奶时间，提高出栏速率，加大对市场的羊肉供应量，龙胆酸可以用于制备促进幼龄反刍动物生长及瘤胃发育的天然植物饲料添加剂。
实施例8
对实施例6的瘤胃内容物测定pH值，考察龙胆酸对羔羊瘤胃参数的影响，结果如表4所示。
瘤胃生理参数测定，用便携式pH计(HI 9024C；HANNA Instruments,美国)测定瘤胃pH值。气相色谱测定(GC-14B,岛津,日本；毛细管柱:30m×0.32mm×0.25mm膜厚度)VFA浓度，参照秦为琳.(应用气相色谱测定瘤胃挥发性脂肪酸方法的研究改进.南京农业大学学报,1982(4):110-116)的方法(柱温＝110℃,汽化室温度＝180℃,检测器＝180℃)。
表4龙胆酸灌服对羔羊瘤胃参数的影响
Figure BDA0003490117400000071
如表4所示，龙胆酸灌服对羔羊瘤胃其他挥发性脂肪酸比例有升高的趋势；对瘤胃pH、总挥发性脂肪酸浓度、乙酸浓度、丙酸浓度、丁酸浓度、其他挥发性脂肪酸浓度、乙酸比例、丙酸比例、丁酸比例和乙丙比无显著性影响，说明在灌服龙胆酸4-5小时后屠宰羔羊，龙胆酸没有改变羔羊瘤胃发酵模式。

Claims (6)

1.龙胆酸在促进幼龄反刍动物生长及瘤胃发育中的应用，所述龙胆酸在动物饲料基础上口腔灌服，所述口腔灌服龙胆酸为90-120 mg/kg体重幼龄反刍动物。
2.龙胆酸在制备促进幼龄反刍动物生长及瘤胃发育的天然植物饲料添加剂中的应用，所述龙胆酸在动物饲料基础上口腔灌服，所述口腔灌服龙胆酸为90-120 mg/kg体重幼龄反刍动物。
3.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，所述幼龄反刍动物为羔羊或犊牛。
4.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，所述龙胆酸在动物饲料基础上作为天然植物饲料添加剂促进幼龄反刍动物生长及瘤胃上皮发育中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述饲料为精料开食料。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的动物生长阶段为出生后到断奶前。
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