CN114467031A - 用于配体筛选的微放射性结合测定 - Google Patents

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CN114467031A CN202080068156.7A CN202080068156A CN114467031A CN 114467031 A CN114467031 A CN 114467031A CN 202080068156 A CN202080068156 A CN 202080068156A CN 114467031 A CN114467031 A CN 114467031A
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Abstract

本公开文本涉及可以在微放射性结合测定中测量配体与特异性蛋白质靶标的结合的结合测定。特定地，本公开文本涉及可用于低丰度蛋白质如从健康或患病的人供体样品分离的重组或组织源性蛋白质的微放射性结合测定。

Description

用于配体筛选的微放射性结合测定
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年10月1日提交的美国临时申请号62/909,101和2020年2月6日提交的美国临时申请号62/970,977的优先权权益，将所述临时申请中的每一个出于任何目的通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本申请涉及用于针对固定于包被表面上的蛋白质进行配体表征和筛选的微放射性结合测定的组合物和方法。
背景技术
放射性结合测定旨在确定控制配体与靶标之间的相互作用的结合参数。此类测定可以用于不同的实验范例，包括饱和、竞争和动力学结合实验，以定义配体-靶标相互作用的不同参数。
需要针对低丰度生物靶标的高度灵敏的测定。
发明内容
饱和测定旨在测量配体对靶标的亲和力，称为Kd。Kd是平衡状态下的解离常数，并且定义为占据给定靶标的50％结合位点所需的配体浓度。为了确定Kd，将靶蛋白与放射性标记的测试配体一起孵育，其中蛋白质处于恒定(固定)浓度，而放射性标记的测试配体的浓度是变化的。在平衡状态下，针对放射性标记的测试配体的每一浓度量化结合的配体的量，直到饱和发生。所获得的数据可以表示为以摩尔浓度计的结合到靶蛋白的配体的量，因此可以计算出配体的Kd。第二类型的放射性结合实验是竞争性放射性结合测定。在竞争形式中，放射性结合测定测量非放射性标记的(冷)测试配体置换放射性标记的测试配体的能力。放射性标记的测试配体以接近其Kd的固定浓度使用，而非放射性标记的测试配体以不同浓度使用，从而可以确定抑制(或置换)常数(Ki)。这种竞争模式也可以用作筛选测定，其中在单一或多种浓度下测试一种或多种非放射性标记的测试配体/测试化合物置换一种共有的放射性标记的工具配体的能力。在计算竞争百分比(如果测试配体以单一浓度使用)或Ki(如果测试配体以多种浓度使用)之后，可以根据测试配体/测试化合物在置换放射性标记的工具配体中的效力对它们进行分级。所述分级可以用于鉴定针对限定的靶蛋白的强效配体，并因此驱动发现程序。
在放射性结合测定中，放射性标记的配体用放射性同位素标记，并且这允许量化其与靶标结合的部分。这通过用含有光电倍增器装置的检测器测量配体固有电离放射性来获得。为了估计在平衡状态下结合到靶标的配体的量，需要将靶标-配体复合物(配体的结合部分)与未结合的配体(配体的游离部分)分离。在经典的放射性结合测定中，物理分离通常通过过滤完成，其中通常由硝化纤维素或玻璃纤维制成的过滤器仅保留结合的配体-靶标复合物，而游离配体则穿过过滤器并被去除。然后可以量化配体的结合部分。经典的基于过滤器的放射性结合测定需要大量的靶蛋白以实现过滤过程所需的大体积中必需的蛋白浓度。对大量蛋白的需要限制了这种测定的使用，特别是在需要从靶蛋白可能以低水平存在于其中的人组织样品分离靶蛋白时。
本文所述的微放射性配体结合测定允许表征配体与低丰度蛋白质如源自脑或其他患者组织或流体的蛋白质的结合。这包括但不限于与神经变性疾病相关的蛋白质。实际上，已知这些蛋白质经历产生蛋白质沉积物的构象变化，并且这些蛋白质沉积物的积累与疾病表现和进展直接相关。这些蛋白质的例子是：淀粉样蛋白β(Aβ)和τ蛋白，其沉积物是阿尔茨海默病(AD)、唐氏综合征和其他τ蛋白病变的标志；α-突触核蛋白(a-syn)，其沉积物是帕金森病(PD)和路易体痴呆的标志；以及TAR DNA-结合蛋白43(TDP-43)，其沉积物是肌萎缩侧索硬化(ALS)和TDP-额颞叶变性(TDP-FTLD)的标志(Serrano-Pozo等人,2011；Spillantini等人,1997；Neumann等人,2006；以及Nelson等人,2019)。这些病理蛋白沉积物可以在体外由重组蛋白人工产生，但是广泛认识到体外产生的沉积物(如聚集体)在构象上不同于从患者组织分离的蛋白质。因此，旨在用治疗剂或诊断剂靶向那些蛋白质沉积物(如聚集体)的发现程序理想地将使用脑源性蛋白样品作为药理学测定的靶标，以确保产生具有更高转化价值的临床前数据。
对使传统的基于过滤器的放射性结合测定中所需的生物靶标的量最小化的需要引起了研究配体与分离自细胞系的蛋白质G蛋白偶联受体(GPCR)结合的微阵列技术的发展(Posner等人,2007)。然而，仍然需要适用于低丰度病理蛋白，例如来源于人脑样品的病理蛋白的准确、高度灵敏的测定方法。
本申请描述了一种针对低丰度蛋白质靶标特殊设计的小型化放射性结合测定，使其特别适合源自患者脑样品的病理蛋白沉积物。针对人源性病理蛋白沉积物筛选化合物同时使所需的患者源性组织的量最小化的能力代表了常用的基于过滤器的放射性结合测定的主要限制和本文所述的微放射性结合测定的主要优点。微放射性结合测定允许使用非常少量的蛋白质靶标，使用比经典的基于过滤器的放射性结合测定低至多500倍的量的蛋白质靶标材料。这种测定可以用于产生Kd值和Ki值以及用于筛选配体文库的高通量测定。通过与经典的基于过滤器的放射性结合测定直接比较，成功地验证了所述测定。
本文所述的方法使用具有局限于包被表面上的病理蛋白的微样品的微阵列。在一些方面，将病理蛋白靶标的生化富集样品点样到包被表面(如包被玻璃表面)上以形成具有在边界清晰的位置中的点的病理蛋白阵列。在一些方面，对脑源性蛋白样品进行富集步骤以浓缩蛋白质沉积物(以确保来自测定的足够信号)并产生具有适合于在所述包被表面上进行适当分配或点样的粘度的富集样品。所述信号的检测通过磷光体成像来获得，其中在不同孵育步骤结束时将干燥的包被表面暴露于磷光体成像膜或屏幕。在所述表面暴露于所述屏幕或膜适当的时间段后，用磷光体成像扫描仪扫描屏幕，并使用图像分析软件如ImageJ-win 64软件量化信号。
在一些方面，本公开文本涉及一种确定测试配体对富集的生物样品中的病理蛋白的结合亲和力(Kd)的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与饱和固定浓度的冷测试配体接触；
使所述等分试样与多种浓度的放射性标记的测试配体接触，以在所述放射性标记的测试配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；
从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的测试配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的测试配体的信号；以及
由每个等分试样中的检测到的信号计算所述Kd。
在一些方面，本公开文本涉及一种确定测试配体对富集的生物样品中的病理蛋白的结合亲和力(Kd)的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与多种浓度的放射性标记的测试配体接触，以在所述放射性标记的测试配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；
使所述等分试样与饱和固定浓度的冷测试配体接触；
从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的测试配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的测试配体的信号；以及
由每个等分试样中的检测到的信号计算所述Kd。
在一些方面，本公开文本涉及一种确定测试配体对富集的生物样品中的病理蛋白的结合亲和力(Kd)的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与多种浓度的放射性标记的测试配体和饱和固定浓度的冷测试配体接触，以在所述放射性标记的测试配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；
从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的测试配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的测试配体的信号；以及
由每个等分试样中的检测到的信号计算所述Kd。
在一些方面，本公开文本涉及一种确定测试配体对富集的生物样品中的病理蛋白的抑制常数(Ki)的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与接近放射性标记的测试配体的Kd的固定浓度的所述放射性标记的测试配体接触，以在所述放射性标记的测试配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；
使所述等分试样与多种浓度的冷测试配体接触；
从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的测试配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的测试配体的信号；以及
由每个等分试样中的检测到的信号计算所述Ki。
在一些方面，本公开文本涉及一种确定测试配体对富集的生物样品中的病理蛋白的抑制常数(Ki)的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与多种浓度的冷测试配体接触；使所述等分试样与接近放射性标记的测试配体的Kd的固定浓度的所述放射性标记的测试配体接触，以在所述放射性标记的测试配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；
从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的测试配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的测试配体的信号；以及
由每个等分试样中的检测到的信号计算所述Ki。
在一些方面，本公开文本涉及一种确定测试配体对富集的生物样品中的病理蛋白的抑制常数(Ki)的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与接近放射性标记的测试配体的Kd的固定浓度的所述放射性标记的测试配体和多种浓度的冷测试配体接触，以在所述放射性标记的测试配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的测试配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的测试配体的信号；以及
由每个等分试样中的检测到的信号计算所述Ki。
在一些方面，本公开文本涉及一种评价测试化合物置换与富集的生物样品中的病理蛋白的放射性标记的复合物中的放射性标记的工具配体的能力的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与接近放射性标记的工具配体的Kd的固定浓度的所述放射性标记的工具配体接触，以在所述放射性标记的工具配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；
使所述等分试样与单一浓度或多种浓度的冷测试化合物接触；
从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的工具配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的工具配体的信号；以及
(a)由每个等分试样中的检测到的信号计算所述冷测试化合物的竞争百分比，其中所述冷测试化合物以单一浓度接触；或(b)由每个等分试样中的检测到的信号计算所述冷测试化合物的Ki，其中所述冷测试化合物以多种浓度接触。
在一些方面，本公开文本涉及一种评价测试化合物置换与富集的生物样品中的病理蛋白的放射性标记的复合物中的放射性标记的工具配体的能力的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与单一浓度或多种浓度的冷测试配体接触；
使所述等分试样与接近放射性标记的工具配体的Kd的固定浓度的所述放射性标记的工具配体接触，以在所述放射性标记的工具配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；
从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的工具配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的工具配体的信号；以及
(a)由每个等分试样中的检测到的信号计算所述冷测试化合物的竞争百分比，其中所述冷测试化合物以单一浓度接触；或(b)由每个等分试样中的检测到的信号计算所述冷测试化合物的Ki，其中所述冷测试化合物以多种浓度接触。
在一些方面，本公开文本涉及一种评价测试化合物置换与富集的生物样品中的病理蛋白的放射性标记的复合物中的放射性标记的工具配体的能力的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与单一浓度或多种浓度的冷测试化合物以及与接近放射性标记的工具配体的Kd的固定浓度的所述放射性标记的工具配体接触，以在所述放射性标记的工具配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；
从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的工具配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的工具配体的信号；以及
(a)由每个等分试样中的检测到的信号计算所述冷测试化合物的竞争百分比，其中所述冷测试化合物以单一浓度接触；或(b)由每个等分试样中的检测到的信号计算所述冷测试化合物的Ki，其中所述冷测试化合物以多种浓度接触。
附图说明
图1示出微放射性结合测定配置。固体表面(如用疏水性粘性表面如氨基丙基硅烷(APS)包被的载玻片)(A)用作支持物以点样蛋白质靶标。在使用自动点样装置用蛋白质点样表面后，获得64个垫，每个垫9个点(B)。在一些实施方案中，用蛋白质靶标对表面上具有水密室的表面(C)进行手动点样(D)。
图2示出用经典的基于过滤器的放射性结合测定(A)和微放射性结合测定(B)对于工具配体针对AD人脑源性τ蛋白沉积物的结合亲和力(Kd)确定的结果。图2A的Y轴示出结合到靶标的特异性放射性标记的配体的量的测量结果，以每分钟的计数(cpm)表示。图2B的Y轴表示膜上存在的与用结合到靶标的特异性放射性标记的配体的量获得的信号成比例的信号强度的量化。工具配体化合物通过基于过滤器的测定示出11.8nM的Kd(A)，并且通过微放射性结合测定示出7.9nM的Kd(B)。两种Kd都具有良好的拟合(对于(A)，R2＝0.97，并且对于(B)，R2＝0.85)。
图3示出使用微放射性结合测定对于测试化合物针对PD人脑源性a-syn和额颞叶痴呆(FTD)人脑源性TDP-43沉积物的结合常数(Kd)确定的结果(化合物3，a-syn，A；化合物2，a-syn，B；化合物3，TDP-43，C)。每个图的Y轴表示膜上存在的与用结合到靶标的特异性放射性标记的配体的量获得的信号成比例的信号强度的量化。化合物3示出针对PD脑源性a-syn的Kd为10.8nM，具有良好的拟合(R2＝0.87；A)，并且针对FTD脑源性TDP-43的Kd为138nM，具有良好的拟合(R2＝0.79；C)。化合物2示出针对PD脑源性a-syn的Kd为7.8nM，具有良好的拟合(R2＝0.80；B)。
图4示出使用微放射性结合测定通过氚化工具配体针对AD人脑源性τ蛋白沉积物的Ki(A)以及化合物3针对PD人脑源性a-syn沉积物的Ki(B)测量的置换能力的确定的结果。每个图的Y轴表示标记的化合物的置换，以百分比表示，其中100％对应于完全置换。工具配体示出Ki为1nM，具有良好的拟合(R2＝0.97)。化合物3示出Ki为41nM，具有良好的拟合(R2＝0.84)。
图5示出在使用放射性标记的化合物3作为工具配体的微放射性结合测定中化合物4、化合物5和化合物6的筛选结果(分别为A、B和C)。每个图的Y轴表示标记的化合物的置换，以百分比表示，其中100％对应于完全置换。在13nM、37nM和147nM下测量化合物4、化合物5和化合物6的Ki，其都具有良好的拟合(分别地，R2＝0.97、0.80和0.64)。
具体实施方式
从以下详细描述中，本公开文本的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中示出并描述了本公开文本的说明性方面。如将理解的，本公开文本能够具有其他和不同的方面，并且其若干细节能够在各个方面进行修改，所有这些都不脱离本公开文本。因此，所述描述本质上应被视为说明性的而非限制性的。
此说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，并入程度就像每个单独的出版物、专利或专利申请被明确和单独地指出以通过引用并入一样。
病理蛋白是在人组织或体液中异常积累时产生病理效应的蛋白质。在一些实施方案中，病理蛋白是在这种积累后形成沉积物如细丝、缠结或其他聚集体的蛋白质，并且所述沉积物引起功能障碍和疾病进展。在一些实施方案中，本文所述的测定中使用的病理蛋白通过本领域技术人员已知的方法产生。在一些实施方案中，本文所用的病理蛋白来源于人生物样品。在一些实施方案中，所述病理蛋白存在于人生物样品中，其通过本领域技术人员已知的方法富集以提供用于本文所述的测定的更浓缩的生物样品。在一些实施方案中，所述富集的生物样品包含约1mg/mL至约6.5mg/mL的总蛋白质(病理蛋白靶标加上其他样品蛋白)。在一些实施方案中，所述富集的生物样品包含约1mg/mL至约2mg/mL的总蛋白质(病理蛋白靶标加上其他样品蛋白)。在一些实施方案中，所述富集的生物样品包含约3.5mg/mL至约6.5mg/mL的总蛋白质(病理蛋白靶标加上其他样品蛋白)。在一些实施方案中，所述富集的生物样品还包含脂质、RNA、DNA或其他细胞组分。
在一些实施方案中，所述人生物样品是人体液(如鼻分泌物、尿样品、血液样品、血浆样品、血清样品、组织间液(ISF)样品或脑脊液(CSF)样品)或人组织样品(例如，来源于心脏、肌肉、脑等组织)。在其他实施方案中，所述人生物样品是血液样品或脑脊液样品。在一些实施方案中，所述人生物样品是脑样品，如大脑皮层样品或海马样品。在一些实施方案中，所述病理蛋白与神经变性疾病相关。在一些实施方案中，所述富集的生物样品来源于来自患有神经变性疾病的患者或患有神经变性疾病的已故患者的人生物样品。在一些实施方案中，所述神经变性疾病是阿尔茨海默病、唐氏综合征、帕金森病、额颞叶痴呆、肌萎缩侧索硬化、路易体痴呆、进行性核上麻痹(PSP)、多系统萎缩(MSA)或创伤性脑损伤、边缘为主年龄相关TDP-43脑病(LATE)、慢性创伤性脑病(CTE)。在一些实施方案中，所述病理蛋白是τ蛋白、Aβ、α-突触核蛋白、炎性体组分(包括但不限于ASC)、源自C9orf72的二肽重复(DPR)或TDP-43。在一个优选的实施方案中，所述病理蛋白是τ蛋白、Aβ、α-突触核蛋白或TDP-43。
在一些实施方案中，通过将富集的生物样品的等分试样以重复模式分配到固体支持物上来制备微阵列。在一些实施方案中，将所述等分试样分配到所述固体支持物上。在一些实施方案中，所述等分试样是所述固体支持物上的点。因此，在一些实施方案中，本文所述的方法还包括通过将所述富集的生物样品的等分试样分配到载玻片上来制备所述微阵列。在一些实施方案中，所述富集的生物样品的等分试样在所述微阵列上是基本上干燥的。在一些实施方案中，所述微阵列包含至少25个、或至少50个、或至少100个、或至少200个、或至少300个、或至少400个、或至少500个点，或250至600个点，或500至600个点。在一些实施方案中，所述点以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个点，或4至10个点，或9个点的垫轮廓分组。在一些实施方案中，所述微阵列固体支持物被分成室，每个室包括按所述室中点数定义的垫轮廓。在一些实施方案中，离散的室配置为使得可以将不同的流体或试剂添加到每个单独的室中而不在室之间混合。在一些实施方案中，所述微阵列包含至少2个、或至少5个、或至少10个、或至少15个、或至少20个、或至少25个、或至少30个、或至少40个、或至少45个、或至少50个、或至少55个、或至少60个、或约64个室。在一些实施方案中，在所述微阵列中的不同等分试样、点、垫轮廓或室中使用不同已知浓度的测试配体。在一些实施方案中，使所述等分试样与多种浓度接触包括使所述微阵列中的每个室与不同浓度接触。在每个室包含多个等分试样或点的情况下，这些等分试样或点用作用于该室的测试条件(例如，测试化合物或测试浓度)的重复。
在一些实施方案中，使用点样装置，如自动点样装置(例如Nano-Plotter)或通过手动移液来完成来自所述富集的生物样品的病理蛋白的等分试样分配或点样。在一些实施方案中，使用Nano-Plotter 2.1TM(GESIM；德国)进行点样。在本发明的一些实施方案中，阵列化的包含病理蛋白的富集的生物样品的体积为至少300皮升、或至少1纳升、或至少10纳升、或至少36纳升，或者是在约200皮升至约36纳升、或约200皮升至约10纳升、或约200皮升至约1纳升范围内的体积。
所述微阵列包含包被的固体支持物，并且所述固体支持物可以是任何合适的固体材料，如玻璃或聚合物。在一些实施方案中，所述固体支持物是载玻片。在一些实施方案中，所述微阵列固体支持物用粘附剂包被。在一些实施方案中，所述粘附剂是硅烷、硫醇、二硫化物、环氧化物和/或聚合物。在一些实施方案中，所述粘附剂是硅烷。在一些实施方案中，所述粘附剂是氨基丙基硅烷。在一些实施方案中，所述微阵列固体支持物是氨基丙基硅烷包被的载玻片。
配体、工具配体、测试化合物或测试配体是有机化合物、抗原、抗体、肽、蛋白质或被抗体捕获的蛋白质。在一些实施方案中，配体、工具配体、测试化合物或测试配体是有机化合物，如化学化合物或小分子化合物。在一些实施方案中，工具配体和测试配体两者都是小分子化合物。在一些实施方案中，工具配体和测试化合物两者都是小分子化合物。
标记的配体、放射性标记的配体、标记的工具配体、放射性标记的工具配体、标记的测试配体、标记的测试化合物、放射性标记的测试化合物或放射性标记的测试配体是包含允许量化所述配体、所述工具配体、所述测试化合物或所述测试配体的标记的有机化合物、抗原、抗体、肽、蛋白质或被抗体捕获的蛋白质。在一些方面，所述标记允许量化结合至病理蛋白的配体、工具配体、测试化合物或测试配体的量。所述标记的类型没有特别限制，并且将取决于所选的检测方法。可检测的标记附接至本发明的配体的位置没有特别限制。
在一些实施方案中，所述放射性标记的测试配体是所述测试配体的放射性标记型式。在一些实施方案中，所述放射性标记的工具配体是已知配体的放射性标记型式。在一些实施方案中，所述工具配体或放射性标记的工具配体是目的病理蛋白的已知配体。示例性放射性标记的工具配体包括：Aβ([11C]PiB(匹兹堡化合物B)、[18F]florobetapir、[18F]florobetaben或[18F]flutematamol)；τ蛋白([18F]T-807(也称为AV1451)、flortaucipir[18F]MK-6240、[18F]RO6958948、[18F]PI-2620、[18F]-GTP-1、[18F]JNJ-067、[18F]PM-PBB3或[11C]PBB3)、THK-5351、THK-5562；或α-突触核蛋白([3H]SIL26)。示例性工具配体包括这些示例性放射性标记的工具配体的未标记型式。
示例性标记包括同位素，如放射性核素、正电子发射体或γ发射体，以及荧光、发光和/或发色标记。如本文所用，放射性同位素标记以与放射性同位素的天然丰度不同的丰度存在。此外，所用的量应该允许通过所选的检测方法对其进行检测。在一些实施方案中，所述标记是放射性核素标记。作为放射性核素的合适同位素的例子包括2H、3H、18F、123I、124I、125I、131I、11C、13N、15O和77Br。在一些实施方案中，所述放射性核素标记是2H、3H、11C、13N、15O或18F。在一些实施方案中，所述放射性核素标记是2H、3H和18F。在一些实施方案中，所述放射性核素标记是3H。如本文所述的放射性标记的化合物通常通过本领域技术人员已知的常规程序使用合适试剂的适当同位素变体来制备，所述合适试剂是可商购的或通过已知的合成技术来制备。
工具配体、放射性标记的工具配体、测试配体、测试化合物和放射性标记的测试配体还可以以组合物的形式提供，所述组合物具有阻断剂、诊断学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或缓冲液中的一种或多种。在一些实施方案中，所述组合物包含阻断剂。在一些实施方案中，所述阻断剂是牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或来自鸡蛋清的白蛋白。在一些实施方案中，所述阻断剂是BSA。阻断剂阻断病理蛋白上的非特异性结合位点并降低背景信号。在一些实施方案中，所述方法包括在富集的生物样品的等分试样的第一次接触之前或在所述第一次接触的同时用阻断剂处理所述等分试样。在一些实施方案中，用阻断剂处理等分试样包括用包含阻断剂的测定缓冲液处理等分试样，任选地其中所述测定缓冲液包含Tris-HCl或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
如本文所用，“饱和固定浓度”意指使对于特定蛋白质的特异性结合饱和的浓度。
如本文所用，使微阵列上的等分试样与“多种浓度”的配体或化合物接触意指使不同的等分试样或等分试样组与不同浓度的配体或化合物接触。当微阵列上的等分试样组与给定浓度接触时，所述组中的等分试样用作测试浓度的重复。等分试样或等分试样组可以与微阵列上的其他等分试样或等分试样组在例如单独室中隔离。对于涉及确定结合亲和力的方法，在一些实施方案中，测试浓度的合适范围相对于饱和固定浓度低至少50倍。
在确定测试配体的抑制常数的方法中，使等分试样与“接近测试配体的Kd的固定浓度”的放射性标记的测试配体接触，所述固定浓度是指在Kd的约2倍以内。
在一些实施方案中，去除未结合的配体(例如，测试配体、测试化合物或放射性标记的配体)包括洗涤微阵列以去除未结合至蛋白质靶标的配体(未结合的配体)。在一些实施方案中，洗涤包括用缓冲液洗涤。在一些实施方案中，所述缓冲液是PBS。
在一些实施方案中，检测包括在将包含含有放射性标记的工具配体或放射性标记的测试配体的复合物的微阵列暴露于膜之后检测所述膜上的信号。在一些实施方案中，所述膜是磷屏膜(phosphoscreen film)。根据一些实施方案，信号的量化通过扫描或通过光成像软件如Phosphoimager Typhoon IP来实现。可以通过使用图像分析软件如ImageJ-win64软件来量化图像。在一些实施方案中，检测包括将包含放射性标记的测试或工具配体的微阵列暴露于膜，如磷屏膜，从而在所述膜上产生信号，并且量化所述膜上的信号。在一些实施方案中，检测包括通过将包含含有放射性标记的工具配体或放射性标记的测试配体的复合物的微阵列暴露于基于新一代气体检测器的实时放射自显影系统(例如BeaQuant仪器[ai4R]、BetaIMAGER、[Biospace Lab])来测量放射性信号(崩解的次数)。根据一些实施方案的信号的量化通过数字成像来进行。在一些实施方案中，可以通过使用图像分析软件(Beamage[ai4R]、M3 vision[Biospace Lab])来量化图像。在一些实施方案中，可以将图像输出到图像处理工具，并且可以通过使用图像分析软件如ImageJ-win 64软件来量化。
在一些实施方案中是一种方法，所述方法包括：
将病理蛋白点样在呈垫轮廓的玻璃支持物上，例如，点样在氨基丙基硅烷(APS)包被的载玻片上；
使所述点样的蛋白质与未标记的(冷)配体接触，以在所述配体与所述蛋白质之间形成复合物；
使所述复合物与标记的配体接触，以在所述标记的配体与所述蛋白质之间形成标记的复合物；
用缓冲液，例如PBS缓冲液洗涤所述标记的复合物；
例如在室温下或在氩气流下干燥所述玻璃支持物；
将所述玻璃支持物暴露于膜，例如磷屏膜；以及
在暴露与所述蛋白质结合的标记的配体之后量化所述膜上的信号。
在一些实施方案中，使所述点样的蛋白质与阻断剂接触。在一些这样的实施方案中，所述阻断剂存在于具有冷配体的测定缓冲液中和/或具有标记的配体的测定缓冲液中。
在一些实施方案中，所述方法包括在暴露与所述蛋白质结合的标记的配体之后量化所述膜上的信号，并且例如通过将量化值绘制在图上，如通过使用图像软件分析将所述值绘制在图上确定结合亲和力(Kd)的值。
在一些实施方案中是一种方法，所述方法包括：将病理蛋白点样在以垫轮廓组织的玻璃支持物上，特别是在氨基丙基硅烷(APS)包被的载玻片上；使包含标记的配体的组合物与所述点样的蛋白质接触；使所述标记的配体与所述蛋白质形成复合物；使包含未标记的(冷)配体的组合物与包含所述蛋白质和所述标记的配体的复合物接触；用缓冲液如PBS缓冲液洗涤；任选地在室温下或在氩气流下干燥所述玻璃支持物如APS包被的载玻片；将所述玻璃支持物如APS包被的载玻片暴露于膜如磷屏膜；在暴露与所述蛋白质结合的标记的配体之后量化所述膜上的信号；以及优选通过将量化的信号绘制在图上，更优选通过使用图像软件分析将所述量化值绘制在图上确定抑制常数(Ki)。
在一些实施方案中是一种方法，所述方法包括：将病理蛋白点样在以垫轮廓组织的玻璃支持物上，如在氨基丙基硅烷(APS)包被的载玻片上，使包含标记的配体的组合物与所述点样的病理蛋白接触，并使所述标记的配体与所述蛋白质形成复合物；使包含未标记的配体的组合物与包含所述蛋白质和所述标记的配体的复合物接触；用缓冲液如PBS洗涤；任选地在室温下或在氩气流下干燥所述玻璃支持物；将所述玻璃支持物暴露于膜如磷屏膜；在暴露与所述蛋白质结合的标记的配体之后量化所述膜上的信号；以及如通过将量化的信号绘制在图上或通过使用图像软件分析将所述量化值绘制在图上确定抑制能力(抑制常数，Ki)。在一些实施方案中，将干燥之前包括的步骤重复至少6次，或至少8次，或至少12次。在一些实施方案中，每次重复所述步骤时，增加/减少配体的量。在一些实施方案中，使用Ki值来评价化合物是否具有与标记的配体竞争结合蛋白质的能力。在一些实施方案中，使用Ki值将测试化合物根据其Ki值进行分级。
本文还公开了用于针对测试配体/测试化合物结合靶标的能力或它们与标记的配体竞争结合靶标的能力来筛选或评价所述测试配体/测试化合物的试剂盒。这样的试剂盒包括用于进行本文所述的方法的组分，例如缓冲液、可检测的染料、实验室设备、反应容器、说明书等。
在一些实施方案中，本公开文本提供了一种确定测试配体/测试化合物对病理蛋白靶标的结合亲和力(Kd)的测定。在其他实施方案中，本公开文本提供了一种确定测定配体/测定化合物对病理蛋白靶标的抑制常数(Ki)的测定。在一些方面，本公开文本提供了一种用于评价、选择和/或筛选测试配体/测试化合物或一系列测试配体/测试化合物的测定，其中根据测定结果选择测试配体/测试化合物或对所述测试配体/测试化合物进行分级。
在针对置换与富集的生物样品中的病理蛋白的放射性标记的复合物中的放射性标记的工具配体的能力评价或筛选测试化合物的一些方法中，所述方法包括：
(a)使所述等分试样与各自以单一浓度的多种冷测试化合物接触，或
(b)使所述等分试样与多种浓度的多种冷测试化合物接触。
在一些实施方案中，所述方法包括根据对于每种测试化合物计算的竞争百分比或Ki对所述多种测试化合物进行分级。在一些实施方案中，多种冷测试化合物是至少两种、至少五种、至少10种、至少25种、至少50种或至少100种冷测试化合物，或两种至100种、或五种至100种、或10种至100种、或25种至100种、或50种至100种冷测试化合物。
在本文所述的任何方法中，使点样有富集的生物样品的多个等分试样的包被的表面与未放射性标记的配体接触可以在使所述包被的表面与放射性标记的配体接触之前、同时或之后进行。
实施例
包括以下实施方案以进一步描述本公开文本的一些实施方案，并且不应将其用于限制本公开文本的范围。所述实施例并不旨在表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。已经努力确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应当考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指示，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度是按摄氏度计，并且压力是大气压或接近大气压。
虽然已经在此示出并描述了本公开文本的方面，但是对本领域的普通技术人员而言将显而易见的是此类方面仅以举例方式来提供。在不偏离本公开文本的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替换。应理解，在此描述的本公开文本的方面的多种替代方案可以用于实施本公开文本。以下权利要求旨在限定本公开文本的范围，并且由此涵盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。
实施例1：用于微阵列制造的蛋白质的制备
a)AD脑源性病理τ蛋白
AD脑源性τ蛋白配对螺旋细丝(PHF)自一名阿尔茨海默病(AD)患者的死后脑富集，所述阿尔茨海默病(AD)患者获自外部来源(Tissue Solutions，英国)。富集程序从Jicha等人,1997以及Rostagno和Ghiso，2009改进，并且从Spillantini等人,1998改编，其描述了应用最初开发用于从阿尔茨海默病脑中提取分散的配对螺旋和直细丝的程序从PD病例的脑中提取分散的a-syn细丝(Greenberg,S.G.等人,1990；Goedert等人,1992)。简言之，在玻璃杜恩斯匀浆器中，将组织以组织匀浆缓冲液体积[补充有蛋白酶抑制剂(Complete；Roche11697498001)的在RAB缓冲液中的0.75M NaCl(100mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)，1mMEGTA，0.5mM MgSO4，2mM DTT，pH 6.8)]的1:4重量/体积比进行匀浆。然后在4℃下孵育匀浆物20min以使任何残余微管解聚，然后将其转移到聚碳酸酯离心瓶(16x76mm；Beckman355603)中，并且在超速离心机(Beckman，XL100K)中使用预冷却的70.1转子(Beckman，342184)在4℃下以11,000g(12,700RPM)离心20min。将沉淀保持在冰上。将上清液汇集到聚碳酸酯瓶中，并且在70.1Ti转子中在4℃下以100,000g(38,000RPM)再次离心1小时，以分离富含PHF的沉淀，而可溶性τ蛋白保留在上清液中。将来自第一次离心和第二次离心的沉淀重悬浮于120mL提取缓冲液[10mM Tris-HCl pH 7.4，10％蔗糖，0.85M NaCl，1％蛋白酶抑制剂(Calbiochem 539131)，1mM EGTA，1％磷酸酶抑制剂(Sigma P5726和P0044)]中。然后将溶液转移到聚碳酸酯离心瓶(16x76mm；Beckman 355603)中，并且在超速离心机(Beckman，XL100K)中使用70.1Ti转子在4℃下以15,000g(14,800RPM)离心20min。在10％蔗糖存在下且在低速离心下，大部分PHF保留在上清液中，而完整的或片段化的NFT和较大的PHF沉积物/聚集体被沉淀。弃去沉淀。将20％Sarkosyl(Sigma L7414-10ML)添加到上清液中至最终浓度为1％，并且在室温下搅拌1小时。然后将此溶液在聚碳酸酯瓶中在70.1Ti转子中在4℃下以100,000g(38,000RPM)离心1小时，并且将含有富含PHF的材料的沉淀以PBS的组织的1:0.1重量/体积比重悬浮于PBS中，等分并且在-80℃下储存。通过蛋白质印迹分析样品的τ蛋白。
b)PD脑源性a-syn蛋白
所述程序自Spillantini等人,1998中描述的方案改编。将来自颞叶皮层或杏仁核脑区的冷冻组织块在冰上解冻，并且使用解剖刀去除白质。使用玻璃杜恩斯匀浆器以组织与匀浆缓冲液体积的1:4重量/体积比匀浆组织。为了匀浆，使用含有0.75mM NaCl和1x蛋白酶抑制剂(Complete；Roche 11697498001)的RAB缓冲液(100mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)，1mM EGTA，0.5mM MgSO4，2mM DTT，pH 6.8)。然后在4℃下孵育匀浆物20分钟以允许任何残余微管解聚，然后将其转移到聚碳酸酯离心瓶(16x76mm；Beckman 355603)中，并且在超速离心机(Beckman，XL100K)中使用预冷却的70.1转子(Beckman，342184)在4℃下以11,000g(12,700RPM)离心20分钟。将沉淀保持在冰上，同时将上清液汇集到聚碳酸酯瓶中，并且在70.1Ti转子中在4℃下再次以100,000g(38,000RPM)离心1小时，以将a-syn沉积物/聚集体与可溶性a-syn分离。将来自第一次离心和第二次离心的沉淀以1:10(重量/体积，w/v)比率重悬浮于提取缓冲液[10mM Tris-HCl pH 7.4，10％蔗糖，0.85M NaCl，1％蛋白酶抑制剂(Calbiochem 539131)，1mM EGTA，1％磷酸酶抑制剂(Sigma P5726和P0044)]中。然后将溶液转移到聚碳酸酯离心瓶(16x76mm；Beckman 355603)中，并且在4℃下以15,000x g(14,800RPM，70.1Ti转子)离心20分钟。弃去沉淀，且将Sarkosyl(20％储备液，SigmaL7414)添加到上清液中至最终浓度为1％，并且在室温下搅拌1小时。然后将此溶液转移到聚碳酸酯瓶中，并且在4℃下以100,000g(38,000RPM，70.1Ti转子)离心1小时。将含有富集的a-syn沉积物/聚集体的沉淀以组织的1:0.1重量/体积比重悬浮于PBS中，等分并且在-80℃下储存。将通过所述程序获得的最终级分用针对a-syn的抗体以生化方式(例如，AlphaLISA、蛋白质印迹和点印迹)进行分析，以证实a-syn沉积物/聚集体的富集。
c)额颞叶痴呆(FTD)脑源性TDP-43蛋白
在P2实验室中用解剖刀从TDP-43病理人脑切割脑组织(皮层)的切片，并且在培养皿上称重组织。用镊子将组织转移到2ml匀浆管(CKmix)中。将含有蛋白酶抑制剂的匀浆缓冲液以1:4(w/v)比率添加到解剖的组织中，产生20％的脑匀浆物。使用以下程序，用precellys将悬浮液在4℃下匀浆：3x在5000rpm下30sec，在每次循环之间暂停-15sec。将匀浆的组织汇集并且重悬浮于5ml Eppendorf管中。制备600μl匀浆脑的等分试样并在干冰上冷冻并且在-80℃下储存。在1.5mL蛋白低结合管(Eppendorf)中进行溶解。
将脑匀浆物在冰上解冻，并且重悬浮于HS缓冲液中至最终浓度为2％Sarkosyl、1单位/μL Benzonase和1mM MgCl2，并且在37℃下在恒温混匀仪以600rpm恒定振荡孵育45min。将上清液收集在新管中。将沉淀重悬浮于1000μl髓磷脂浮选缓冲液中，并且在台式离心机上在4℃下以20,000g离心60min。用1000μl吸头小心地去除上清液以去除所有漂浮的脂质。如果不能在单一离心步骤中去除脂质，则重复重悬浮、离心和上清液去除。将所得沉淀用PBS洗涤，并且在台式离心机上在4℃下离心30min。然后将沉淀重悬浮于200μl PBS中。将所有富集的材料汇集并在-80℃下冷冻。
通过蛋白质印迹分析样品(磷酸化TDP-43、TDP-43、组蛋白H3、Aβ)。
实施例2：病理蛋白微阵列的制备
a)方法1-自动点样
将蛋白质样品在PBS或测定缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5，在0.9％NaCl、0.1％BSA中)中1:3(V/V)稀释，并且通过用P200(Eppendorf)移液在1.5mlEppendorf管中匀浆。然后将样品备妥用于使用自动点样装置即非接触压电打印机Nano-Plotter 2.1(GeSiM；德国)自动点样到氨基丙基硅烷(APS)包被的64垫微阵列载玻片(Lucerna-Chem，#63475)上。所述自动点样装置是一种通用的非接触阵列打印机，其允许用电脉冲分配微小体积(皮升至纳升)的液体。
将APS载玻片(图1A)手动放置在自动导轨上，并且检查它们的正确固定，以确保当每个载玻片安装有室时载玻片之间点样的高度再现性和液滴的良好定位。使用压电尖端从加载板吸取适当的体积。优化系统以允许每个点分配12x3nL液滴，每个垫9个点，并且每个载玻片上总共64个垫(图1B)。在相对湿度为65％的湿度受控气氛中进行样品的点样。在点样之前评估分配的液滴的匀浆质量，以确保样品的体积和密度在整个分配过程中是恒定的。为此，当每个液滴从尖端分配时测量每个液滴，并且在特定电压下测量液滴的分散。一旦对载玻片点样，将室与Proplate多孔室64个孔(25x75mm玻璃显微镜玻璃)组装在一起，并且在载玻片的两侧上使用2个由不锈钢制成的
Figure BDA0003568595130000111
夹确保隔室的水密性。所述系统具有64个独立的孔。将样品在加湿的室中静置干燥15分钟，随后在4℃下储存直至使用。
b)方法2-手动点样
通过用微量移液管p2(Eppendorf)吸取1μL将蛋白质样品手动点样至安装有室的载玻片上(图1C和图1D)。在每个位置仅吸取一个液滴，并且一个液滴对应于载玻片上的一个点。将所得载玻片在室温下在经典的实验室通风橱中干燥至少2小时。
实施例3：冷样品的制备
将冷化合物(测试配体或测试化合物)以2.5mM或10mM重悬浮于100％DMSO中作为储备溶液。通过以2至3的稀释因子进行12个点的一系列连续稀释获得冷化合物的稀释液。在100％DMSO中进行稀释以确保在结合测定反应体积中最终DMSO浓度为1％至2.5％的恒定浓度。所用冷化合物的最大浓度为2μM或3μM，这取决于靶标，并且此条件也用于确定信号的最大位移。
实施例4：标记的样品的制备
合成标记的化合物(放射性标记的测试配体或放射性标记的工具配体；1mCi/mL)并且将其溶解在100％乙醇中。将标记的化合物在实验中在测定缓冲液中以一系列浓度稀释到适当浓度以确定Kd，或者在用于评估置换效力的实验中以恒定固定浓度进行稀释。
实施例5：通过微放射性结合测定确定τ蛋白结合亲和力(Kd)
安装具有点样的病理τ蛋白样品的室，并用含有2μM的冷测试配体的测定缓冲液(50mM Tris pH：7.5，138mM NaCl，0.1％BSA)填充。将所述室在室温下孵育120min。使用密封膜以避免蒸发。将等体积的在测定缓冲液中的不同浓度的氚化测试配体添加到每个室中，充分混合，并且在室温下孵育。最终反应体积为40μL。孵育60min之后，将含有放射性物质的反应溶液收集在合适的容器中。用冰冷的洗涤缓冲液洗涤室五次。将
Figure BDA0003568595130000112
室从载玻片上拆下，并且用双蒸H2O洗涤载玻片。在氩气流下在化学通风橱下干燥载玻片。将膜在Hypercassette(Amersham，RPN 11643)中在BAS-IP TR 2025fujifilm上暴露至少3天。用Phosphoimager Typhoon IP扫描膜，分辨率为50μm且灵敏度为4000。然后使用ImageJ-win64软件分析并量化图像。使用GraphPad Prism 7.03产生图。对于工具配体与τ蛋白沉积物/聚集体确定Kd为7.9nM，具有良好的拟合(图2B)。
实施例6：微放射性结合测定与基于过滤器的放射性结合测定的比较
对使用这种经典的基于过滤器的测定和上述微放射性结合测定的Kd确定进行直接比较，以评估所述方法之间的差异。为了进行基于过滤器的测定，将AD脑源性τ蛋白以1/80稀释，并且在25℃下与浓度范围为1nM至50nM的氚化测试配体(已知的τ蛋白结合剂)且在有或没有恒定(固定)浓度为2μM的冷测试配体的情况下一起孵育120分钟。在GF/C滤板(PerkinElmer 6005174)上在真空下过滤体积为35μL的各样品，以捕获具有结合的测试配体的AD脑源性τ蛋白，并且用Tris 50mM缓冲液(pH 7-5)洗涤GF/C过滤器三次。然后将GF/C过滤器真空干燥，向每个孔中添加50μL闪烁液(Ultimate Gold MB，PerkinElmer)，并且在Microbeta2装置上分析过滤器。用含有过量冷测试配体(2μM)的样品确定非特异性信号，并且通过从总信号中减去非特异性信号来计算特异性结合。所有测量都用至少两个技术重复来进行。通过非线性回归计算Kd值，使用Prism V7(GraphPad)计算单位点特异性结合，以提供11.8nM的Kd(图2A)。使用相同的测试配体，显示使用所述两种方法获得对于独立的AD脑源性τ蛋白沉积物/聚集体非常类似的结合亲和力值(11.8nM(图2A)与7.9nM(图2B，描述于实施例5中))。结果证实微放射性结合测定方法是经典的基于过滤器的放射性结合测定的稳健替代。
实施例7：用微放射性结合测定确定对于a-syn和TDP-43的Kd
实施例5中描述的方法也用于确定测试配体(化合物2(参见PCT申请号WO2019234243)和化合物3)对于蛋白质靶标a-syn(对于化合物2和化合物3)和TDP-43(对于化合物3)的结合常数(Kd)。将从FTD脑分离的富含TDP-43的级分或从PD脑分离的富含a-syn的级分与递增浓度(分别为1nM至300nM或1nM至30nM)的放射性标记[3H]的化合物3在有或没有恒定量的2μM的冷化合物3的情况下一起孵育。类似地，将从PD脑分离的富含a-syn的级分与递增浓度(1nM至30nM)的放射性标记[3H]的化合物2在有或没有恒定量的2μM的冷化合物2的情况下一起孵育。使用恒定过量浓度的冷化合物2(2μM)或冷化合物3(2μM)来确定非特异性结合。确定化合物3对于a-syn和TDP-43蛋白质的Kd值分别为10.8nM(图3A)和138nM(图3C)，并且确定化合物2对于a-syn的Kd值为7.8nM(图3B)。结果证实，可以通过所述的微放射性结合测定来确定对于若干靶蛋白的Kd值，已知这些靶蛋白以低或相对低的丰度存在于生物组织中。例如，认为病理a-syn和病理TDP-43在患病人脑中以比病理τ蛋白低的丰度存在。
实施例8：使用微放射性结合测定确定测试配体抑制常数(Ki)
使用微放射性结合测定确定测试配体对AD脑源性τ蛋白沉积物/聚集体和PD脑源性a-syn沉积物/聚集体的抑制常数(Ki)。如实施例1(步骤a和步骤b)和实施例2(a)中所述制备蛋白质并将其点样在包被的载玻片上。
将3nM的氚化测试配体(已知的τ蛋白结合剂)与点样的τ蛋白沉积物/聚集体和浓度为10pM至3μM的冷测试配体一起孵育(图4A)。在不存在冷工具配体的情况下获得最大信号(100％结合)，而在存在3μM冷工具配体的情况下获得最大位移。Ki值是使用Prism V7(GraphPad)通过单位点-拟合Ki(One site–Fit Ki)计算的。在1nM下测量测试配体的Ki值，其具有良好的拟合，R2＝0.97。
将冷化合物3与浓度范围为50pM至2μM(或10nM至3μM)的点样的a-syn沉积物/聚集体以及40nM[3H]化合物3一起孵育。在不存在冷化合物3的情况下获得最大信号(100％结合)，而在存在2μM化合物3的情况下获得最大位移。在41nM下测量化合物3的Ki值，具有良好的拟合(图4B)。
这些结果证实，化合物的自置换能力(通过计算的Ki确定)可以通过所述的微放射性结合测定针对若干蛋白质靶标来确定，已知这些蛋白质靶标以低或相对低的丰度存在于生物组织中。
实施例9：用于对文库化合物的活性进行分级的微放射性结合测定
针对测试化合物与[3H]化合物3(放射性标记的工具配体)竞争结合PD患者脑源性a-syn沉积物/聚集体的效力来筛选所述测试化合物。以筛选形式评估测试化合物置换，以允许基于它们置换放射性标记的工具配体的能力对测试化合物进行分级(基于计算的Ki值分级)。如上文在实施例1(b)和实施例2(a)中所述进行蛋白质样品的制备和点样。
在两个独立的实验中一式两份地对测试化合物进行测试，均值±SEM示于图5A至图5C中。使用40nM的[3H]化合物3作为放射性标记的工具配体，在浓度范围为50pM至2μM下筛选测试化合物。示出以下化合物的代表性竞争曲线：化合物4(图5A，Ki 13nM，强结合剂)，化合物5(图5B，Ki 37nM，中间结合剂)，和化合物6(图5C，Ki 147nM，弱结合剂)。总之，这些结果证实所述的微放射性结合测定可以用于以筛选形式测量测试化合物的置换能力(Ki)，这允许根据计算的Ki值对筛选的测试化合物进行分级，例如从最弱结合剂至最强结合剂。示出更低Ki值的测试化合物被认为是更强的结合剂，并且将代表针对测试的蛋白质靶标的潜在命中化合物。另外，测试化合物置换放射性标记的工具配体的能力表明，所述测试化合物在与放射性标记的工具配体的蛋白质结合位点重叠的位点处结合蛋白质靶标。
虽然已经在此示出并描述了本公开文本的方面，但是对本领域的普通技术人员而言将显而易见的是此类方面仅以举例方式来提供。在不偏离本公开文本的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替换。应理解，在此描述的本公开文本的方面的多种替代方案可以用于实施本公开文本。以下权利要求旨在限定本公开文本的范围，并且由此涵盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。
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Claims (29)

1.一种确定测试配体对富集的生物样品中的病理蛋白的结合亲和力(Kd)的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与饱和固定浓度的冷测试配体接触；
使所述等分试样与多种浓度的放射性标记的测试配体接触，以在所述放射性标记的测试配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；
从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的测试配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的测试配体的信号；以及
由每个等分试样中的检测到的信号计算所述Kd。
2.一种确定测试配体对富集的生物样品中的病理蛋白的结合亲和力(Kd)的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与多种浓度的放射性标记的测试配体接触，以在所述放射性标记的测试配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；
使所述等分试样与饱和固定浓度的冷测试配体接触；
从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的测试配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的测试配体的信号；以及
由每个等分试样中的检测到的信号计算所述Kd。
3.一种确定测试配体对富集的生物样品中的病理蛋白的结合亲和力(Kd)的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与多种浓度的放射性标记的测试配体和饱和固定浓度的冷测试配体接触，以在所述放射性标记的测试配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；
从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的测试配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的测试配体的信号；以及
由每个等分试样中的检测到的信号计算所述Kd。
4.一种确定测试配体对富集的生物样品中的病理蛋白的抑制常数(Ki)的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与接近放射性标记的测试配体的Kd的固定浓度的所述放射性标记的测试配体接触，以在所述放射性标记的测试配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；
使所述等分试样与多种浓度的冷测试配体接触；
从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的测试配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的测试配体的信号；以及
由每个等分试样中的检测到的信号计算所述Ki。
5.一种确定测试配体对富集的生物样品中的病理蛋白的抑制常数(Ki)的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与多种浓度的冷测试配体接触；
使所述等分试样与接近放射性标记的测试配体的Kd的固定浓度的所述放射性标记的测试配体接触，以在所述放射性标记的测试配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；
从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的测试配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的测试配体的信号；以及
由每个等分试样中的检测到的信号计算所述Ki。
6.一种确定测试配体对富集的生物样品中的病理蛋白的抑制常数(Ki)的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与接近放射性标记的测试配体的Kd的固定浓度的所述放射性标记的测试配体和多种浓度的冷测试配体接触，以在所述放射性标记的测试配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；
从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的测试配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的测试配体的信号；以及
由每个等分试样中的检测到的信号计算所述Ki。
7.一种评价测试化合物置换与富集的生物样品中的病理蛋白的放射性标记的复合物中的放射性标记的工具配体的能力的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与接近放射性标记的工具配体的Kd的固定浓度的所述放射性标记的工具配体接触，以在所述放射性标记的工具配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；
使所述等分试样与单一浓度或多种浓度的冷测试化合物接触；
从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的工具配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的工具配体的信号；以及
(a)由每个等分试样中的检测到的信号计算所述冷测试化合物的竞争百分比，其中所述冷测试化合物以单一浓度接触；或(b)由每个等分试样中的检测到的信号计算所述冷测试化合物的Ki，其中所述冷测试化合物以多种浓度接触。
8.一种评价测试化合物置换与富集的生物样品中的病理蛋白的放射性标记的复合物中的放射性标记的工具配体的能力的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与单一浓度或多种浓度的冷测试配体接触；
使所述等分试样与接近放射性标记的工具配体的Kd的固定浓度的所述放射性标记的工具配体接触，以在所述放射性标记的工具配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；
从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的工具配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的工具配体的信号；以及
(a)由每个等分试样中的检测到的信号计算所述冷测试化合物的竞争百分比，其中所述冷测试化合物以单一浓度接触；或(b)由每个等分试样中的检测到的信号计算所述冷测试化合物的Ki，其中所述冷测试化合物以多种浓度接触。
9.一种评价测试化合物置换与富集的生物样品中的病理蛋白的放射性标记的复合物中的放射性标记的工具配体的能力的方法，所述方法包括：
使微阵列上的所述富集的生物样品的多个等分试样与单一浓度或多种浓度的冷测试化合物以及与接近放射性标记的工具配体的Kd的固定浓度的所述放射性标记的工具配体接触，以在所述放射性标记的工具配体与每个等分试样中的所述病理蛋白之间形成放射性标记的复合物；
从所述等分试样中去除未结合的放射性标记的工具配体；
检测来自每个等分试样中的所述放射性标记的复合物中的放射性标记的工具配体的信号；以及
(a)由每个等分试样中的检测到的信号计算所述冷测试化合物的竞争百分比，其中所述冷测试化合物以单一浓度接触；或(b)由每个等分试样中的检测到的信号计算所述冷测试化合物的Ki，其中所述冷测试化合物以多种浓度接触。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，所述方法包括：
(a)使所述等分试样与各自以单一浓度的多种冷测试化合物接触，或
(b)使所述等分试样与多种浓度的多种冷测试化合物接触。
11.根据权利要求10所述的方法，所述方法包括根据对于每种测试化合物计算的竞争百分比或Ki对所述多种测试化合物进行分级。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，所述方法包括使所述富集的生物样品的等分试样与阻断剂接触。
13.根据权利要求12所述的方法，其中使所述等分试样在与所述放射性标记的工具配体、冷工具配体和/或冷测试化合物接触之前或同时与所述阻断剂接触。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述阻断剂存在于还包含所述放射性标记的工具配体、冷工具配体和/或冷测试化合物的一种或多种测定缓冲液中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述测定缓冲液包含Tris-HCl或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述阻断剂是BSA、酪蛋白或来自鸡蛋清的白蛋白。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述病理蛋白选自Aβ、τ蛋白、α-突触核蛋白和TDP-43。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述富集的生物样品的每一等分试样包含约3.5mg/mL至约6.5mg/mL的总蛋白质。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中每一等分试样是点。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述微阵列包含至少5个、或至少10个、或至少15个、或至少20个、或至少25个、或至少30个、或至少40个、或至少45个、或至少50个、或至少55个、或至少60个、或约64个室。
21.根据权利要求20所述的方法，其中每个室包含所述富集的生物样品的至少一个等分试样、或至少六个等分试样、或至少九个等分试样或九个等分试样。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中使所述等分试样与多种浓度接触包括使所述微阵列中的每个室与不同浓度接触。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述检测包括在将所述微阵列暴露于膜之后检测所述膜上的信号。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述膜是磷屏膜。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述微阵列是载玻片。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述载玻片是氨基丙基硅烷包被的载玻片。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，所述方法包括通过将所述富集的生物样品的等分试样分配到所述载玻片上来制备所述微阵列。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，所述方法包括在与放射性标记的测试配体或与冷测试配体或化合物接触之前干燥所述微阵列上的多个等分试样。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，所述方法包括在检测信号之前干燥。
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