JP3228421B2 - ホトアフィニティーラベル化法を用いたアルツハイマー病およびその他疾患の検出法 - Google Patents

ホトアフィニティーラベル化法を用いたアルツハイマー病およびその他疾患の検出法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、哺乳動物の脊髄液、血液、組織、その他の
標本を用いてヌクレオチド アフィニティープローブ
（photoaffinityprobes）でホトアフィニティー ラベ
ル化（photoaffinity labeling）法で神経疾患を検出す
るための新規な組成物、方法およびテストキットに関す
るものである。
本発明は患者から少量のバイオサンプルを採取し、そ
の中に疾患特異的な巨大分子の生化学的マーカーが存在
するか否かを調べる疾患の診断方法を提供する。本発明
は、特に、疾患特異性なヌクレオチド結合蛋白を用い
て、アルツハイマー病患者の脳脊髄液中にこの蛋白の結
合が有るか否かを検出するアルツハイマー病（Alzheime
r's disease）の診断方法に関するものである。
発明の背景 アルツハイマー病（AD）は老人が大きな割合で罹る内
因進行性の痴呆症である。その病因がいつから発生した
かは不明である。この神経退行性疾患の特徴は知的機能
障害および記憶喪失が時間の経過とともに悪化していく
点にある。
アルツハイマー病患者の神経が早期に機能不全に陥っ
てから死ぬまで起こる一連の病理生理学なチェーンは余
り分かっていない。アルツハイマー病と診断された患者
の脳では多くの異常が報告されているが、その中のどれ
が脳破壊の結果で、どれが神経の早期機能不全および死
に関係しているかを決めるのは難しい。
現在のところアルツハイマー病の臨床診断は除外法で
行われている。すなわち、記憶喪失および認識機能障害
の二次的原因はいわゆる多梗塞痴呆症に到る多重梗塞が
原因とするか、硬膜下血腫、脳腫瘍または肉芽腫等の頭
蓋内の塊病巣が原因とすることができ、ウィルスおよび
細胞起源の中枢神経系感染や、クロイツフェルド−ヤコ
ブ（Creutzfeld−Jacob）病のような緩慢なウィルス性
疾患には別の診断がされる。また、ビタミンB12代謝を
含む代謝障害、チアミンまたは葉酸塩の欠損、甲状腺機
能不全、肝機能不全、腎不全および薬害でも痴呆症が現
れることがある。しかし、これらの二次原因の多くは可
逆的疾患である。これらの疾患を全てを除いた後に残る
大多数の患者は原因不明な脳の退化すなわちアルツハイ
マー病と診断される。
アルツハイマー病であることの最終診断は死後の脳組
織の病理検査に痴呆症の臨床病歴を加えて行われる。こ
の場合には、脳神経組織内に神経線維のもつれおよび神
経炎斑（老人斑）が存在することと、臨床で痴呆症の症
状があったことに基づいて診断が行われる。
細胞骨格線維異常の原因は不明であるが、神経炎斑は
退化性の軸索突起および神経末端（場合によってはさら
に星型細胞要素）で構成されると考えられ、多くの場
合、中央にアミロイド蛋白コアが認められる示す。神経
線維のもつれは正常な対を成すらせん線維で構成された
介在ニューロンの集合体であり、おそらく複数の異なる
蛋白で構成されている。神経炎斑および神経線維のもつ
れを神経組織病理学的に同定し、計数するには脳の複数
の部分を染色し、顕微鏡で検査する必要がある。
しかし、組織の化学染色（histochemical staining）
は必ずしも再現性があるわけではなく、また、神経炎斑
および神経線維のもつれは均一には分布していないた
め、組織病理学的な検査は時間がかかり、多くの作業を
必要とするという問題がある。しかも、細胞骨格線維異
常の蓄積が神経の早期機能不全とその死に直接関与して
いるとする証拠はなく、細胞骨格線維はより基本的な細
胞変化を単に現しているにすぎないかもしれない。臨床
および病理上でアルツハイマー病に顕著な特徴は脳皮質
から神経が少しづつ失れていくことである。なお、神経
炎斑と神経線維のもつれはアルツハイマー病患者の他に
痴呆症ではない老人の患者でも発生する。
アルツハイマー病の解明およびその診断法の開発で現
在最も盛んに行われている研究はアミロイド蛋白とその
前駆体蛋白とに集中している。理論上はアルツハイマー
病の診断は患者個人の脳の皮質区域に神経炎斑を含むア
ミロイドの堆積量を基にしたものである。こ種の診断法
は米国特許第4,668,829号、第4,701,407号、第4,816,41
6号及び第4,993,156号に記載されている。
しかし、アミロイドの堆積は痴呆症状を全く示さない
老人の脳にも見られる。例えば、最近の論文（J.Biol.C
hem.,265:15977（1990））は正常人とアルツハイマー病
患者との血小板からの前駆体アミロイド蛋白では一次構
造に差がないことを示している。従って、アミロイド蛋
白はアルツハイマー病に関与するかもしれないが、それ
よりアルツハイマー病患者のみに特徴的に関係する特性
を識別する別の方法が求められてきた。例えば、アルー
ンサクル（Aroonsakul）の米国特許第4,724,041号はＬ
−ドパ誘発テストを実施した後に採取した患者血清のソ
マトトロピンおよびソマトメジイン−Ｃのレベルを測定
することによってヒトのアルツハイマー病を診断する比
較テストを開示している。
また、アルツハイマー病患者中の神経化学マーカーの
存在を検出するためのイムノアッセー（免疫法）の開発
も行われてきたれた。フデンバーグ（Fudenberg）達の
米国特許第4,728,605号と第4,801,533号とには、患者の
末端血液の免疫学的パラメータと内部活性Ｔ細胞とを測
定することによって中枢神経の退行性疾患、特にアルツ
ハイマー病を診断する比較法が開示されている。ウィス
ニュースキィー（Wisnewski）達の米国特許第4,806,627
号にはアルツハイマー病から神経疾患を原因とする人の
痴呆を区別するためのスクラピー（scrapie）結合線維
とスクラピー特異的モノクローナル抗体とで構成される
プロテアーゼ耐性蛋白を開示している。
しかし、公知のどの診断法もアルツハイマー病の全て
の患者、特に、病気の早期段階の患者を高い信頼性で検
出できるという保証はない。そのため、アルツハイマー
病患者から採取した脳脊髄液の分析に基づいた別の診断
法が提案されている。例えばワーナー（Warner）は患者
の脳脊髄液中のアルツハイマー病関連アミロイド蛋白の
検出法を提案している（Anal.Chem.,59:1203A−1204A
（1987））。
ガンディ（Gandy）達の米国特許第4,874,694号に開示
の神経と精神の障害、例えばアルツハイマー病の診断法
では、患者の脳脊髄液を32Pでラベルしたアデノシント
リホスフェート（ATP）とこのATPからホスフェートを転
送することができる蛋白キナーゼとの存在下で培養した
後、電気泳動する。こうして得られた分画され、ラベル
化されたサンプルのオートラジオグラフパターンを公知
の神経・精神病理学の所定のオートラジオグラフパター
ンと比較して患者の脳脊髄液の病理を分析する。しか
し、この方法はオートラジオグラフパターンのみに基づ
いているため、脳脊髄液中の疾患特異的マーカー蛋白を
同定することはできない。
カトーン（Khatoon）達の研究（Ann.of Neurology,2
6:210−215（1989））は、微小管（microtubees）の形
成で重要な細胞蛋白ツベリン（tubulin）の相互作用は
アルツハイマー病患者の脳組織から作った調製物中では
異常であることを示した。この場合の抑制作用は微小管
形成にGTPを必要とする蛋白とヌクレオチドGTP（グアノ
シン−５′−トリ−ホスフェート）の放射化ホトアフィ
ニティプローブの相互作用を測定してモニターしてい
る。
アジド基を含む分子は低強度の紫外線によって反応性
ニトレン中間体を生じ、これを介して蛋白と共有結合を
形成するということが分かっている（Potter ＆ Haley,
Meth.in Enzymol.,91:613〜633（1983））。特に、プリ
ンヌクレオチドの２−および８−アジド類縁体は未精製
細胞抽出物中のヌクレオチド結合蛋白を同定する部位特
異的プローブとして用いられている（Owens ＆ Haley,
J.Biol.Chem.259:14843−14848（1984）;Atherton達Bi
o.of Reproduction 32:155−171（1985））。この２−
および８−アジドヌクレオチドは精製蛋白のヌクレオチ
ド結合領域の地図化でも用いられている（Khatoon達、A
nn.of Neurology,26:210−215（1989）;King達,J.Biol.
Chem.,264:10210−10218（1989）;Dholakia達,J.Biol.C
hem.,264:20638−20642（1989））。
ホトアフィニティプローブは生物学的に活性な組換え
ペプチド分子の特定ヌクレオチド結合サイトを決定する
のに用いられている（Campbell達,PNAS,87:1243−1246
（1990））。このプローブは精製した蛋白の酵素活性の
研究でも用いられている（Kim達、J.Biol.Chem.,265:36
36−3641（1990））。
上記の通り、アルツハイマー病の決定的診断システム
の開発に多くの努力がなされてきたが、アルツハイマー
病の信頼できる非侵入的テスト法は今日まで開発されな
かった。これまでのアルツハイマー病の最も確実な決定
法は病理組織を直接分析することであるが、その最大の
欠点は患者の死後にしか実施できないことである。
アルツハイマー病は進行性の疾患であるため、それを
早期発見できれば治療効果は著しく向上する。
また、治療後のアルツハイマー病患者の変化を迅速、
安全且つ効果的な診断法を用いてモニターすることがで
きれば、アルツハイマー病の新しい軽減法または治療法
の価値をより良く確認することができる。
従って、アルツハイマー病を高い信頼性で正確、安全
且つ効果的に診断する方法と、アルツハイマー病とその
他の神経疾患、症候群または精神病理とを区別する手段
の開発が古くから求められてきた。そのためにはアルツ
ハイマー病特異的な生化学マーカーの同定と特性付けお
よびそうしたマーカーの同定が必要である。
発明の目的および要約 本発明の目的は、アルツハイマー病患者から抽出した
脳脊髄液中の特定のヌクレオチド結合蛋白を検出するア
ルツハイマー病の診断方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、アルツハイマー病患者の脳脊髄
液中でホトラベル化されていない特異的ヌクレオチド結
合蛋白を正常な患者から抽出した脳脊髄液で検出するア
ルツハイマー病の診断方法を提供することにある。
本発明のさらに別の目的は、正常者の脳脊髄液中には
見られないがアルツハイマー病患者から抽出した脳脊髄
液中に特異的なヌクレオチド結合蛋白と選択的に結合す
る放射化ホトアフィニティプローブで構成されるアルツ
ハイマー病診断用テストキットで使用される組成物を提
供することにある。
本発明のさらに別の目的は、アルツハイマー病患者の
脳脊髄液内には見られないが正常者の脳脊髄液中に特異
的なヌクレオチド結合蛋白と選択的に結合する放射化ホ
トアフィニティプローブで構成されるアルツハイマー病
診断用テストキットで使用される組成物を提供すること
にある。
本発明のさらに別の目的は、脳脊髄液、血漿または人
体組織中のアルツハイマー病特異的蛋白を識別するため
のイムノアッセーで使用する、本発明方法で同定された
アルツハイマー病関連蛋白に対する抗体群を提供するこ
とにある。
本発明のさらに別の目的は、哺乳類の脳脊髄液、血
液、組織、その他の生物学的サンプルを用いてヌクレオ
チドアフィニティプローブによるホトアフィニティラベ
ル化法で神経疾患を診断する方法を提供することにあ
る。
本発明方法で存在または進行が検出できる神経または
精神の病理にはアルツハイマー病、癲癇（eplileps
y）、スクラピー型障害、進行性脊髄性筋萎縮症（ALSま
たはルーゲリッグ（Lou Gehrig）病）、ダウン（Down）
症候群、ベーチェット（Bechet）病、脳炎（encephalit
is）、ハンチントン（Hungtington）病、クロイツフェ
ルド−ヤコブ（Creutzfeld−Jacob）病、パーキンソン
ス（Parkinson）病、エイズ（AIDS）痴呆症、多梗塞痴
呆（multi−infarct）、ジストニー、運動失調8ataxi
a）、精神分裂病、神経梅毒、脳トキソプラズマ症、脳
照射、脳腫瘍、ギラン−バレン（Guillain−Barre）症
候群、振戦（tremor）、多硬化症、頭外傷性障害、急性
および慢性脳炎性、血管疾患が含まれるが、これらに限
定されるものではない。
本発明の上記以外の目的、利点および新規な特徴は下
記の説明から明らかになるであろう。また、本発明を実
行することによって学ぶこともできる。
図面の簡単な説明 第１図は、ヒトの脳脊髄液蛋白を［32P］8N3ATPでホ
トラベル化した後に展開したナトリウムドデシルスルフ
ェート−ポリアクリルアミドゲル（SDS−PAGE）で作っ
たオートラジオグラムの写真である。各脳脊髄液サンプ
ルは癲癇（Ｅ列）、パーキンソン病（Ｐ列）、アルツハ
イマー病（AD列）の患者からと、正常な同年齢の対照被
験者（Ｎ）から得たものである。
このオートラジオグラフは約42,000Mrの蛋白がアルツ
ハイマー病患者の脳脊髄液でのみホトラベル化されるこ
とを示している。また、最後の４つの列に示されている
ように、自然発生的なATPに対するこの相互作用の選択
性はATPが存在する時には［32P］8N3ATPによるホトラベ
ル化が阻止されることで示される。
第2A図と第2B図は、ヒトの脳脊髄液蛋白を［32P］8N3
cAMPでホトラベル化した後に展開した第2C図と第2D図に
示す２つの10％SDS−PAGEを組み合わせたオートラジオ
グラフの写真である。サンプルは第１図で用いた患者と
同じサンプルであり、癲癇（Ｅ列）、パーキンソン病
（Ｐ列）、アルツハイマー病（AD列）の患者と、正常対
照被験者（Ｎ列）である。「マーカー」と記載したラベ
ル化した列は分子量が分かっている蛋白を含んでおり、
脳脊髄液蛋白のおおよその分子量（Mr値）を求めるため
に用いたものである。SDS−PAGEは各Mr値の脳脊髄液蛋
白を検出するためにコマシィブリリアントブルー（Coom
assie Brillant Blue）Ｒ（CBB）で着色した（第2C図と
第2Dに図示）。［32P］8N3cAMPでホトラベル化した蛋白
は放射線のタグを付けたので、第2A図、第2B図に示すオ
ートラジオグラフィの位置を占める。
第2A図、第2B図のオートラジオグラフは、約68,000Mr
の蛋白は正常者、癲癇患者およびパーキンソン病の患者
の脳脊髄液中でのみホトラベル化されることを示してい
る。
第３図は、アルツハイマー病患者の脳脊髄液の42,000
Mr蛋白と精製グルタミンシンテターゼ（GS）とを各々［
32P］2N3ATPでラベル化した場合を比較した２つの棒グ
ラフである。ホトラベル化を異なる条件下（例えば、NH
4 +の添加の有無）で行った後蛋白をSDS−PAGEで分離し
た。42,000Mrのバンドを切り取り、取り込まれた32Pの
レベルを測定した。
この実験は、42,000Mr蛋白とGSとが複数の異なる生物
化学条件下で同様な挙動をすることを示すために行っ
た。GS特異的抗体データからこの42,000Mr蛋白がGSその
ものであることは確認されている。
第４図は、進行性脊髄性筋萎縮症（ALSまたはルーゲ
リッグ（Lou Gehrig）病）またはアルツハイマー病（A
D）の患者のヒトの脳脊髄液蛋白を［32P］8N3ATPまたは
［32P］8N3GTPでホトラベル化した後にSDS−PAGE上で展
開して作成したオートラジオグラフの写真である。
このオートラジオグラフは、［32P］8N3ATPおよび［
32P］8N3GTPはいずれもALS患者の脳脊髄液中のAD特異的
蛋白42,000Mrを検出しないことを示している。さらに、
このことでこの方法のAD診断テストとしての選択性が確
認される。しかし、［32P］8N3GTPを用いると約55,000M
rの蛋白がALS脳脊髄液中でのみホトラベル化される。別
のテストからこの蛋白はALS患者の脳脊髄液中にのみ見
出されることが示されたので、この疾患の診断に使え
る。
本発明の好ましい実施例の詳細な説明 本発明はホトアフィニティプローブを用いたホトアフ
ィニティラベル化法を用いて、哺乳類の脳脊髄液、血
液、組織、その他の生物学的サンプルで神経障害を検出
（神経障害または精神障害の存在および進行を検出）す
るための新規な組成物、方法およびテストキットを提供
する。
本発明はアルツハイマー病の診断または検出用組成物
と、その製造法とに関するものである。
本発明の診断方法ではアルツハイマー病のような神経
疾患のある患者から抽出した脳脊髄液中の疾患特異的ヌ
クレオチド結合蛋白を用いる。
本発明は患者から採取した少量の生物学的サンプル中
に疾患特異的生化学マーカーの巨大分子が存在する否か
を同定する検出方法を提供する。この疾患特異的生化学
マーカーの巨大分子は検出すべき神経疾患によって決ま
る。
診断・検査の標準は臨床的に顕著な痴呆または認識機
能障害（記憶または注意欠如を含む）が認められる多数
の精神障害患者から採取した脳脊髄液サンプルから設定
される。
本発明方法が適用される神経系の神経疾患は脳、脳
幹、脊髄または神経節の生化学的変化を原因または結果
とする疾患、障害または症候群であり、アルツハイマー
病、癲癇（epilepsy）、スクラビー型障害、進行性脊髄
性筋萎縮症（ALSまたはルーゲリッグ（LouGehrig）
病）、ダウン（Down）症候群、ベーチェット（Bechet）
病、脳炎、ハンチントン（Hungtington）病、クロイツ
フェルド−ヤコブ（Creutzfeld−Jacob）病、パーキン
ソン（Parkinson）病、エイズ（AIDS）痴呆症、多梗塞
痴呆症、ジストニー、運動失調、精神分裂病、神経梅
毒、脳トキソプラズマ症、脳照射、脳腫瘍、ギラン−バ
レン（Guillain−Barre）症候群、振戦、多硬化症、頭
の外傷性障害、急性及び慢性脳炎性並びに血管疾患を含
むが、これらに限定されるものではない。
本発明検出方法は、高熱または頭の怪我を原因とする
軽症あるいは激しい脳損傷等により脳脊髄液中のヌクレ
オチド結合蛋白が蓄積して脳細胞が死に到るような場合
のモニターとしても利用することができよう。
本発明は、疾患特異的な特定の生化学マーカーの巨大
分子、特に特定のヌクレオチド結合蛋白が特定の神経疾
患患者、特にアルツハイマー病患者の脊髄液中に同定さ
れるということが明らかにした。
本発明方法で脳脊髄液サンプルを分析する場合の典型
的な手順は以下の通りである。なお、下記の工程および
量は単に本発明を実行する上でのガイドラインに過ぎな
い。
少量の脳脊髄液、一般に10〜30μｌの脳脊髄液を約10
〜30μＭ濃度の放射性ホトアフィニティプローブと0.5
〜1.0分間混合した後、30〜120秒間紫外線を照射する。
サンプルを沈澱された後、直ちに界面活性剤を含む溶液
で溶解し、ゲル電気泳動等によって蛋白を分離する。最
終的なゲルをオートラジオグラフィ用Ｘ線フィルムを収
容したホルダーに入れる。放射能がフィルムの近接部分
を照射してその部分が暗く（黒色に）なるので、ゲル中
の放射性蛋白（放射性ホトプローブと結合蛋白とが化的
学に架橋したもの）の位置が分かる。
分析するサンプルは各ヌクレオチド結合蛋白を含む可
能性のある任意の生物学的サンプル、例えば、脊髄液、
血液または血清等の体液の中から選択することができ
る。特定のヌクレオチド結合蛋白を検出するために本発
明方法で用いる最も好ましいサンプルは脳脊髄液（髄液
ともいう）である。
脳脊髄液の蛋白組成の大部分は血清蛋白に由来する。
この血清蛋白はpostrema区域のような不完全を脳血液障
壁を通り、さらに血管の多い脈絡膜叢を通って（その結
果、脳脊髄液が限外濾液として生じる）クモ膜下空間へ
漏れてくる。従って、脳脊髄液に含まれる蛋白は膀胱結
石分画より少ない。炎症を起こす間に免疫グロブリン等
の蛋白もくも膜下空間に生じるであろう。脳脊髄液は脳
および小脳皮質の表面を浸すので、脳脊髄液蛋白の構成
には小脳尾、皮脳幹、脊髄およびこれらの構造物の全て
が寄与することになる。
本発明方法は神経または精神の疾患、例えばスクラピ
ーまたは「狂牛（Mad Cow）」病を有するヒト以下の任
意の哺乳類にも適用できる。
サンプルは脳室の脳脊髄液または腰部の脳脊髄液のい
ずれかから抽出される。場合によっては、特異的ヌクレ
オチド結合蛋白が良く見えるようにするために種々の方
法（例えば凍結乾燥または高速真空濃縮が含む真空法）
でサンプルの蛋白を濃縮する。脳脊髄液を硫酸アンモニ
ウムまたはポリエチレングリコールを用いて沈澱させて
ヌクレオチド結合蛋白を濃縮することもできる。当業者
には周知の種々の方法を用いることができる。
特異的ヌクレオチド結合蛋白の検出は所定の生化学マ
ーカーの巨大分子をホト化学的または化学的に架橋さ
せ、遊離プローブを除去した後に、上記巨大分子に架橋
させた標識（ラベル）を測定して行う。巨大分子に結合
する標識は放射性ヌクレオチドにすることができる。そ
の例としては等価な非放射性原子を32P、トリチウム、
炭素14、その他の放射性原子または架橋分子に連鎖部位
を与えるリンカーで変性したリガンドで置換した放射性
ヌクレオチドであり、本発明で特に好ましい放射性標識
はα−またはγ−32Pである。
特異的生化学マーカーの巨大分子にリガンドまたはリ
ンカー基を付ける場合には、リガンドまたはリンカー基
にラベル化さい小さなヌクレオチド分子、色素源、螢光
源または冷光源（luminescent）を付けた分子あるいは
磁気粒子を取付けることができるような化学的特性また
は機能を持たせる。リガンドにはそれに対する抗体分子
のようなレセプタ分子があるか、それを生じるような化
学的特性を持たせる。レセプタ分子はラベル化した放射
性ヌクレオチド分子または色素源、螢光源または冷光源
を付けた分子、磁気粒子あるいは適当な基質を介して
色、螢光および／または冷光を出す化合物を生じる酵素
系に結合することができる。
サンプル中の特定の生化学マーカーの巨大分子、特
に、特異的ヌクレオチド結合蛋白は、放射能でラベル化
したホトアフィニティプローブで検出するのが最も好ま
しい。このヌクレオチドホトアフィニティプローブは結
合部位への親和を有し、しかも、未変性のヌクレオチド
と同じ生物学的活性を有するヌクレオチド誘導体であ
り、ある波長の光線を照射すると、極めて反応性に富ん
だ中間体、通常はニトレンまたはカルベンに変換されて
結合部位に蛋白との共有合体を生じる。
このホトプローブは従来の化学プローブより優れてい
る。その利点の１つは活性化光線が無くてもKm、Kdおよ
びKi値を求めることができる点にある。他の利点はリボ
ゾーム、膜、全細胞超音波処理物のような複雑な系が研
究できる点にある。従って、インビボ状態により近い状
態が近似でき、精製系では失われる情報が得られる。
多数のヌクレオチドホトアフィニティプローブを合成
して、使用することに成功した。本発明のホトアフィニ
ティ化合物には例えばプリントリホスフェートアジド類
似体が含まれる。その例はアデニン類似体であるが、そ
の代わりにグアニン類似体を用いることもできる。プリ
ン結合部位は例えば下記のものとその５′−モノ−、ジ
−及びトリホスフェートで効果的にラベル化できる：例
えば、２−アジドまたは２−アジドアデニリルイル
（２′,5′）２−アジドアデニリルイル（２′−５′）
２−アジドアデノシン;2−アジドまたは８−アジドアダ
アデノシン;8−アジドアデニリルイル（２′−５′）−
８−アジドアデニリルイル（２′−５′）−８−アジド
アデノシン;2,8−ジアジドアデニリルイル（２′,5′）
2,8−ジアジドアデニリルイル（２′,5′）2,8−アジド
アデノシン;2,8−ジアジドアデニリルイル（２′,5′）
2,8−ジアジドアデニリルイル（２′,5′）2,8−ジアジ
ドアデニリルイル（２′,5′）2,8−アジドアデノシン
等の単一のアジドアデニリル種のオリゴマー；または例
えば、２−アジドアデニリルイル（２′−５′）２−
（２′−５′）アデノシン、アデニリルイル（２′−
５′）８−アジドアデニリルイル（２′−５′）８−ア
ジドアデノシン等のAMP及び単一のアジドアデニリルイ
ル種のオリゴマー；または例えば、２−アジド−アデニ
リルイル（２′−５′）８−アジドアデニリルイル
（２′−５′）２−アジドアデノシ等の複数のアジドア
デニリルイル種を含むオリゴマー；または、少なくとも
１つのモノマーがアジド−AMP種であるAMP、２−アジド
−AMP、８−アジド−AMPおよび／または2,8−ジアジド
−AMPの任意の組み合わせで得られるオリゴマー。
本発明のホトアフィニティ化合物には、例えばニコチ
ンアミド−２−アジドアデノシンジヌクレオチド（２−
アジド−NAD+）のようなNAD+のホトアクティブな補酵素
類似体またはニコチンアミド−２−ヒドラジドアデノシ
ンジヌクレオチド（２−アジド−NADH）のようなNADH類
似体が含まれる。
上記の化合物の各アデニン部分をグアニンにしたもの
を定義することもできる。従って、本発明の最も好まし
い化合物の一部はアジドグアノシン−５′−トリホスフ
ェート類とその組み合わせまたはアジドグアノシン−
５′−トリホスフェート類とATPとから合成できる。後
者はグアニルイルとアジドグアニリルイルとを含む
（２′−５′）オリゴマーになる。
本発明のホトアフィニティ化合物にはピリミジン誘導
体も含まれる。例えば、５−アジド−２′−デゾキシウ
リジン−５′−トリホスフェート（５−N3dUTP）のよう
なdUTP類似体はdUTPから合成される。これを用いてその
他の有用な５−置換ウリジンヌクレオチドが合成でき
る。この５−ジアゾウリジンヌクレオチドは、例えば活
性部位に対するホトアフィニテイプローブとして、ある
いは別のホトアクティブ核酸（極端なpHでも安定で、還
元剤の存在下でも有効なホトラベル化試薬の状態を維持
する）を作るための酵素重合用基質として用いることが
できる。５−N3dUTPの合成は穏やかな条件を用いるの
で、５−N3dUTPのホモポリマーを合成して、所定の長さ
の単一鎖のホトアクティブDNAを作ることもできる。こ
の5N3dUTPを用いてホトアクティブRNAを同様に作ること
もできる。
アリールアジ化物の合成の一般的な方法は、アジドイ
オンによる臭素、塩素またはニトロ基の求核的な置換ま
たはジアゾ化うた芳香族第１アミンを含む酸性溶液への
アジ化ナトリウムの付加である。
今日最も広く使用されている８−アジドプリンは8N3c
AMPである。この8N3cAMPの利点は哺乳類の組織には高い
親和性でcAMPを結合する蛋白は２種類、cAMPホスホジエ
ステラーゼとcAMP依存蛋白キナーゼの規則的なサブユニ
ットしかなくという点である。ホトプローブ［32P］8N3
cAMPと［32P］8N3ATPとは例えばcAMP依存蛋白キナーゼ
の作用機構の研究で用いられている。GTPのホトアクテ
ィブ類似体、例えば、［32P］8N3GTPは例えばツベリン
重合を研究するために開発され、UTPのホトアクティブ
類似体、例えば［32P］5N3dUTPは例えばDNA結合蛋白の
結合部位の研究用に作られた。
本発明の好ましい化合物はアジドアデノシン−５′−
トリホスフェート類またはその組合せ物から合成さたア
デニルイルおよびアジドアデニリルイルの両方を含む
（２′−５′）オリゴマーである。本発明でアルツハイ
マー病特異的蛋白を同定するための好ましいホトアフィ
ニティ化合物は８−アジドアデノシン−５′−トリホス
フェート（8N3ATP）である。本発明の特に好ましいホト
アフィニティ化合物は２−アジドアデノシン−５′−ト
リホスフェート（2N3ATP）である。本発明でALS特異的
蛋白を同定するための特に好ましいホトアフィニティ化
合物は８−アジドグアノシン−５′−トリホスフェート
（8N3GTP）である。
非放射性ラベル（標識）は２つのカテゴリー、すなわ
ち（ｉ）色、螢光または化学冷光用の色素・染料か、
（ii）リガンドに分けられる。色素・染料は通常８〜49
個の炭素原子、好ましくは９〜30個の炭素原子を有し、
通常は１〜10個の酸素、窒素または硫黄のヘテロ原子を
含み、通常はハロゲン原子を含まないか10個以下のハロ
ゲン原子、通常は沃素、臭素、塩素または弗素を含んで
いる。
色用色素にはフェノールスルホンフタレインとテトラ
ゾリウムの類似体が含まれる。
螢光用色素にはフルオロセインイソチオシアネート、
ジクロトリアジニルアミノフルオロセイン、モルフォリ
ノールホダミンイソチオシアネート、トリメチルローダ
ミンイソチオシアネート及び４−アセトアミド−４−イ
ンチオシアノスチルベン−２と２′−ジスルホン酸がま
れる。
螢光性プリン誘導体には例えば螢光性GTP類似体、
２′３′−Ｏ−（2,4,6−トリニトロシクロヘキサジエ
ニル−イジン）グアノシン−５′−トリホスフェート
（TNP−GTP）またはこれと等価な螢光性ATP誘導体（TNP
−ATP）が含まれる。
化学冷光用色素には５−アミノ−2,3−ジヒドロ−フ
タラジン−1,4−ジオン（ルミノール）、イソルミノー
ル及びアクリジニウムエステルの誘導体が含まれる。
リガンドは、それに対して十分な特異的を有する適当
な受容体が分かっていれば、任意のリガンドでも使用で
きる。
標識の量は種々の方法またはプロトコルを用いて測定
することができ、例えば、ラジオイムノアッセイ（Radi
oimmunoassay,（RIA））、イムノラジオメトリックアッ
セイ（Immunoradiometricassay（IRMA））、サンドウィ
ッチIRMA、フルオロイムノアッセイ（fluoroimmunoassa
y（FIA））、ケミルミネッセントアッセイ（cnemilumin
escent assays）、バイオルミネッセントアッセイ（bio
luminescent assays）及びエンザイムリンクトイムノソ
ルベントアッセイ（enzyme linked immunosorbentassay
s（ELISA））を用いることができる。
本発明の標識プローブは公知の任意のハイブリッド化
法で使用することができる。本発明の実施に有用なハイ
ブリッド化法にはサンプルを固体支持体に不動化するも
の（固相ハイブリッド化法）と、全ての種が溶液中にあ
るもの（溶液ハイブリッド化法）がある。本発明方法で
は溶液ハイブリッド化法が好ましい。他に重要な方法は
サンドイッチハイブリッド化法である。
本発明で特定の生化学巨大分子マーカーを放射化した
ホトアフィニティラベルで同定する際にはいくつかのフ
ァクターを考察するのが好ましい。考察すべきファクタ
ーは例えば下記のものである：（ａ）培養および光反応
の温度、（ｂ）培養および光反応長さ、（ｃ）ホトアフ
ィニティ試薬の濃度、（ｄ）試薬および天然配位子に対
する蛋白の結合アフィニティ、（ｅ）各系でのホトアフ
ィニティ試薬の安定性、（ｆ）イオン強度、pH、コファ
クター、（ｇ）蛋白濃度、（ｈ）光化学反応の光強度、
（ｉ）反応停止と未反応標識の分離、（ｊ）結果の解
釈。感光性プリントホスフェートアジド類似体でサンプ
ル中の特異的生化学マーカーの巨大分子をラベル化する
好ましい方法の詳細はポッターとハレー（Potter ＆ Ha
ley）が記載している（Meth.in Enzymol.,91:613−633
（1983））。
サンプルと選択したホトアフィニティラベルとの光反
応温度は０℃から室温（25℃）またはそれ以上にするこ
とができる。cAMPまたは８−N3cAMPの結合物と未結合物
との間の交換率は０℃では無視できるが、室温では大き
な値になる。逆に、８−N3cAMPが特定の巨大分子マーカ
ーと結合した時に温度をほぼ０℃に下げることによって
蛋白上にコールドトラップできる。従って、最も好まし
い方法は各成分を室温で予備培養し、氷上でに配置した
プレートで温度を約０〜４℃に下げて光分解する方法で
ある。本発明では室温でサンプルを放射性ホトアフィニ
ティプローブと一緒に約0.5〜1.0分間培養するのが好ま
しい。最も好ましいのは混合物を６秒間掻き回した後さ
らに24秒間混合し、その後直ちにサンプルを氷上に配置
して光活性化する方法である。
ホトアフィニティ試薬の濃度はラベル化される蛋白の
結合アフィニティに合せなければならない。しかし、過
度に高い濃度は望ましくない非特異的ラベル化を招く。
その非特異的ラベル化は濃度と共に一次的に増加する。
最も良いの結果は光取込み反応（photo−incorporatio
n）に最適な温度を実験的に求めることによって得られ
る。試薬の安定性は濃度の決定に直接的に関係してい
る。試薬の安定性は薄層クロノトグラフィ、例えば螢光
性セルロース薄層クロマトグラフィで求めることができ
る。
イオン強度、pH、コファクターおよび金属イオン濃度
は蛋白構造に影響を与えるが、最適なラベル化条件を達
成するために当業者は容易に調節できる。蛋白濃度は光
感応性に関係する。サンプルの蛋白濃度が高いほど溶液
は光に対して不透明になるので、溶液が不透明なほど単
位時間当たりの光試薬に達する紫外線量は少なくなり、
光の取込み率が減少する。蛋白の凝集度も試薬の蛋白の
への結合時間に影響し、光の取込み率を下げる。ホトラ
ベル化を最大限行いたい場合には蛋白濃度を変えて最適
光反応時間を求めればよい。
本発明では、少量（10〜30μｌ）の脳脊髄液を放射化
したホトアフィニティプローブ（例、［32P］2N3ATP、
［32P］8N3ATP）でホトラベル化して、アルツハイマー
病特異的42,000Mr蛋白の検出のための最終濃度約10〜30
μＭにする。分析する各脳脊髄液の分別量は15μｌにす
るのが最も好ましいが、検出限度はより多量のサンプル
を使用するか、脊髄液を濃縮することでほとんどコスト
をかけずに上る。
サンプルを［32P］8N3cATPでラベル化することもでき
る、この場合にはサンプルは氷上に配置して、温度を約
０℃に下げて光活性化する。脳脊髄液サンプル中で所定
の蛋白に［32P］8N3ATPが光反応で取り込まれなかった
ことを調べる実験で用いる［32P］8N3cATPの好ましい濃
度は５μＭ以下である。
適当な所定の時間培養して反応させた後に標識した蛋
白を検出し、サンプルと選択したホトアフィニティプロ
ーブとに基づいて計算する。
光分解の光強度は、温度を大きく変化させたり、生物
学的サンプルを損傷したりせずに、最大の光を最小の時
間で取り込むことができるような値にする。光分解は紫
外線源を用いて254nm行うのが好ましい。
ホトプローブで処理したサンプルの活性化には紫外線
（UV）光は必須であるが、低強度のUVでよい。UV光の強
度は通常のUV源では180〜800μW/cm2であり、光分解を
速くするために強度の高いUV源を用いた場合には4000μ
W/cm2またはそれ以上にすることができる。
光分解時間は15秒から５分の範囲にあるが各反応系に
ついて実験的に決定しなければならない。強度が180〜8
00μW/cm2のUV源灯での好ましい光分解時間は約30〜120
秒の範囲、好ましくは約30〜60秒である。
サンプルから光源までの距離は光分解条件の決定的な
因子である。本発明の好ましい方法では約6200μW/cm2
の十分な強度を有する紫外線源をサンプルから約1cmの
距離で設定し、光活性化に十分な時間、一般に約45秒の
間照射した。
過剰な未結合いサンプルおよび／または標識を含む溶
液からラベル化済みの巨大分子を分離するには一般に沈
澱を用いるがその他の公知の蛋白精製法を用いることも
できる。典型的な沈澱方法では、トリクロロ酢酸（TC
A）、過塩素酸（PCA）、アセトン、硫酸アンモニウム、
ポリエチレン−グリコール（PEG）のような蛋白沈澱剤
をサンプルに添加するが、この方法に限定されるもので
はない。本発明方法で好ましい沈澱剤でPCAまたは硫酸
アンモニウムでありり、PCAが特に好ましいしい沈澱剤
である。
沈澱剤の量はサンプル中の蛋白濃度で決定まる。好ま
しい沈澱剤濃度は溶液から特異的蛋白を効果的に沈澱さ
せる濃度である。最も好ましい沈澱剤の濃度は予め活性
化されホトラベル化された脳脊髄液サンプルを効果的に
沈澱させる量である。
沈澱剤はドライバッチで添加するか、計算した等価な
液体の形でサンプルに混合する。混合時間は選択した沈
澱剤の種類とサンプルのサイズまたは濃度に応じて変え
るが、選択した温度でサンプル溶液から蛋白がほとんど
沈澱しなくなるまでの時間が必要である。
沈澱した蛋白は遠心分離、沈降または濾過等の任意の
有効な方法で溶液から分離する。溶液から沈澱した蛋白
を分離する好ましい方法は十分な速度で且つ時間遠心分
離して蛋白をペレットに分離する方法である。最も好ま
しい分離方法は13,000XGで30分間遠心分離することであ
る。これらのパラメータは溶液の種類で変える。
沈澱法と分離法との有効性を調べるために、ペレット
と上澄み液の両方の蛋白含有量を分析する。
沈澱した蛋白を可溶化し、任意の方法で残りの反応を
停止する。可溶化剤は特異的ヌクレオチド結合蛋白を同
定する方法に応じて決定するが、例えば硫酸ナトリウム
ドデシル（SDS）や尿素および安定化剤にすることがで
きる。
光分解後に残留しているアジ化物はジチオトレイトー
ルまたはその均等物等を添加して破壊する。また、トリ
ホスフェート誘導体N3ATPまたはN3GTPからの燐の移行は
EDTA等のキレート化剤によって阻害することができる。
好ましい蛋白可溶化剤は洗剤、特にSDSであり、最も好
ましくは蛋白可溶化混合物（PSM）である（これが最も
一般的な標準化された方法で、ポッターとハレー（Pott
er ＆ Haley）に記載されている（Meth.in Enzymol.198
3年、91:613〜633）。この混合物中の特に好ましいSDS
の濃度は10％であり、その結果、最数的なサンプルに対
するSDSの濃度は４％になる。
可溶化は０℃またはその以上の温度で実施しても結果
に影響しないが、本発明では室温の可溶化は効果的であ
る。
可溶化後、蛋白サンプルを蛋白分画用の支持体に塗布
する。支持材料は例えばポリアクリルアミドゲル、濾
紙、澱粉ゲルまたはブロック、セルロースまたはポリウ
レタンフォーム等である。公知の有効な蛋白分離方法は
いずれでも使用できるが、好ましくは変性ゲルまたは未
変性ゲル上で勾配法または非勾配法で電気泳動で分離す
るのが好ましい。本発明方法では通常変性ゲル上での電
気泳動で蛋白を分離する。
使用するゲルの濃度はサンプルの種類と特異的ヌクレ
オチド結合蛋白の大きさで決める、それによって蛋白分
離を良好に行うための分離時間と印加電流とを決定す
る。本発明の蛋白分画はSDS−ポリアクリルアミドゲル
（SDS−PAGE）上で電気泳動で分離するのが最も好まし
い。一般にはサンプルを10％ポリアクリルアミドゲル上
で、約140Vの初期電圧で35mAの一定のアンペア数を2 1/
2〜３時間流して分画する。任意の標準的な電気泳動装
置を用いることができる。
得られたゲルはＸ線フィルムに露出して当業者に周知
の方法でオートラジオグラフィによる視覚化をする。ゲ
ルを染色して特定の特異的蛋白パンドを調べ、ホトラベ
ルの取込み量の差で蛋白レベルの大きな変化ではないこ
とを確認することもできる。多数の蛋白染色方法が知ら
れており、例えばコマシィブリリアントブルー（Coomas
sieBrillant Blue）Ｒ（CBB）または銀染色等がある。
このCBBは蛋白と染料との間の疎水性相互作用に基いて
蛋白を検出するために広く使用されている染料である。
CBBは本発明方法で最も迅速且つ経済的なものである
が、特異的ヌクレオチド結合蛋白を効果的に識別する染
色方法は任意の方法を使用することができる。
出来たSDS−PAGEゲルは選択した蛋白断片を染色する
のに有効な量のCBBでえ染色するのが好ましい。特に、
完成後のゲルを約１時間の間10％CBB（w/v）溶液に浸漬
し、次いで過剰な染料を除去するための溶液中で脱色す
る。５％酢酸と10％イソプロピルアルコールの脱色溶液
を10〜18時間用いるのが好ましい。
最後に、標準的なオートラジオグラフィ技術を用いて
特異的結合蛋白断片を視覚化する。増倍スクリーンを使
用すればオートラジオグラフィの視覚化を加速すること
ができる。本発明方法では、染色されたゲルを乾燥した
後、デュポン クロネックス（DuPont Cronex）4X線フ
ィルムに露出する。オートラジオグラフィ時間は各実験
サンプルの蛋白中に光化学で取込まれたプローブの特異
的活性によって変える。−70℃に保持した時にはゲルを
ゲル状態のままでオートラジオグラフィにかけることが
できる。
蛋白の量および各蛋白に取り込まれた放射能の量は露
光後のＸ線フィルムまたは染色後のゲルをデンシトメー
タスキャンしたり、ゲルを励起した後に蛋白パンドを液
体シンチレーション分光測定する等の公知の任意の方法
で定量する。なお、これらの方法に限定されるものでは
ない。
神経疾患または精神疾患または障害を有するヒトから
採取した脳脊髄液を適当な放射性ホトアフィニティプロ
ーブでラベル化し、活性化して分析することによって、
疾患特異的な生化学マーカーがわえり、その存在によっ
て疾患の状態を特徴付けることができるということが明
らかになった。
例えば、正常なヒトの被験者の脳脊髄液に見られる見
掛けの分子量が約68,000D±10％の蛋白バンドを放射性
ホトアフィニティプローブ、例えば［32P］8N3cAMPでラ
ベル化し、活性化して視覚化した。こうして同定した蛋
白バンドの分子量は約68kDである。同じサイズの断片が
アルツハイマー病以外の神経疾患の患者から採取した脳
脊髄液サンプル中にも認められた。
比較の結果、アルツハイマー病患者の脳脊髄液をホト
ラベル化、例えば［32P］8N3cAMPでホトラベル化して視
覚化すると、分子量が約68kDの蛋白断片は存在しないと
いう特徴があることが分かる（図２を参照）。
また、種々の神経障害および精神障害を有する患者の
脳脊髄液を放射性ホトアフィニティプローブでラベル化
し、次いで活性化することによって、特有の特異的ヌク
レオチド結合蛋白の存在で特定の病気を診断することが
できる。例えば、アルツハイマー病患者の脳脊髄液を［
32P］8N3ATPを用いて放射性ホトアフィニティラベル化
したものには見掛けの分子量が約42,000D±10％の特徴
的蛋白バンドが見られる。こうして同定されたアルツハ
イマー病特異的蛋白バンドの分子量は約42kDである。
比較の結果、正常なヒトの被験者から採取した脳脊髄
液を同じ放射性ホトアフィニティプローブ（すなわち［
32P］8N3ATP）でラベル化し、活性化する操作を系統的
に行ったものにはホトラベル化されて分子量が約42kDの
蛋白断片はないことが分った。従って、上記で同定され
た蛋白はアルツハイマー病患者に特有のものであり、正
常なヒトの試験者の脳脊髄液中には上記で同定されたも
のに対応する蛋白断片は含まれていない。
この42,000Mr蛋白は放射性ホトプローブでホトラベル
化される他に、蛋白キナーゼおよびシンテターザ（第１
図の最後の４列）の燐酸塩ドナーである自然発生的ヌク
レオチドであるATPと相互反応する。この選択性に基づ
いて、アルツハイマー病特異的蛋白は約42,000MrのATP
結合蛋白として同定できる。同じ42kD蛋白を８−アジド
−GTPでホトラベル化するとATP及びGTP結合蛋白として
の特異的蛋白が定義できる。この42,000Mr蛋白より高い
親和性でATPと結合する。
従って、ヒトの脳脊髄液サンプルを高く信頼性で正確
に２つのグループに分類することができる。すなわち、
アルツハイマー病患者から採取した脳脊髄液サンプルは
［32P］8N3ATPまたは［32P］2N3ATPを上記で同定された
疾患特異的な42kD蛋白に光化学で取込むが、正常な68kD
蛋白では［32P］8N3cATPは光化学的に取込まれない。一
方、アルツハイマー病患者であい対照被験者から採取し
た脳脊髄液では正常な68kD蛋白中に［32P］8N3cAMPが光
化学的に取込まれるが42kD蛋白には［32P］8N3ATPおよ
び［32P］2N3ATPのいずれも光化学的に取込まれない。
また、アルツハイマー病患者と正常なヒト被験者との脳
脊髄液サンプルをGTP類似体でホトラベル化して比較分
析した場合にも、42kD蛋白をATPのホトアフィニティプ
ローブでホトラベル化した時に観察された上記の結果が
確認される。
対照被験者から採取した脳脊髄液（68kD蛋白がホトラ
ベル化される）とアルツハイマー病患者の脳脊髄液（68
kD蛋白はホトラベル化されない）の実験の結果を合せる
と、アルツハイマー病の脳脊髄液成分は正常な対照サン
プルの脳脊髄液の68kD蛋白の［32P］8N3cAMPによるホト
ラベル化が明らかに阻止されることが本発明によって明
らかにされる。
本発明によりアルツハイマー病特異的42,000Mr蛋白は
グルタミンシンテターゼであると同定された。哺乳類の
グルタミンシンテターゼは下記反応を触媒する42,000Mr
のサブユニットを有する酵素である： グルタメート＋NH4＋ATP→グルタミン＋ATP＋Piさら
に、アルツハイマー病（AD）では機能不全に陥った脳の
部分のグルタメートのレベルが極めて低くなっており、
グルタメートの代謝が変化していることを示唆してい
る。アルツハイマー病患者の死んだ神経細胞はグルタメ
ート感応性の細胞である。
このグルタミンシンテターゼは基質の産物への酵素触
媒転化量を測定して検出することもできる。公知の検出
法では例えば［14C］グルタメートの［14C］グルタミン
への触媒変換、または［α32P］ATPの［α32P］ADPへの
触媒変換を測定する。この触媒変換の測定方法は本発明
のアルツハイマー病特異的42,000Mr蛋白の検出でも利用
される。
この42,000Mr蛋白はアルツハイマー病患者の脳脊髄液
中に極めて少量存在する。しかし、この42,000Mr蛋白は
アルブミンや28,000Mrの蛋白以外で8N3ATPまたは2N3ATP
でホトラベル化される公知の主要な蛋白であるので、ホ
トアフィニティラベル化法と本発明の材料および方法を
用いることによって、臨床的にアルツハイマー病と診断
された患者の脳脊髄液に特有な脳脊髄液中のATP及びGTP
と相互反応する極めて微量の蛋白を検出することができ
る。
本発明者が最近行った一連の研究によって蛋白への光
化学的取込みの最適化が可能になった。すなわち、現在
では数千cpmsの32Pで10〜15μｌのサンプルをラベル化
することができ、蛋白精製は大幅に高くできるので、診
断手段として価値は高い。
死後解剖の研究から、42,000Mr蛋白はアルツハイマー
病患者のホトラベルは脳室の脳脊髄液中に高いレベルで
存在するが、腰部の脳脊髄液中には低いレベルであるこ
とが分かっている。しかし、本発明方法では数マイクロ
リットルの少量の脳脊髄液から特異的ヌクレオチド結合
蛋白を同定・精製できるので、極めて低レベルの蛋白し
か含まないサンプル中で標識した42kD蛋白を検出するこ
とができる。また、40％硫酸アンモニウムで飽和まで処
理した1mlの腰部脳脊髄液を用いた最近の研究では
［32P］2N3ATPでホトラベル化して容易に検出可能な量
の42,000Mr蛋白を含む蛋白沈澱物が得られた。これによ
って腰部脳脊髄液も本発明の診断テストで使用できるこ
とが確認された。
同様な方法で、放射性GTPホトアフィニティプローブ
も用い、活性化して視覚化することによって、進行性脊
髄性筋萎縮症（ALSまたはルーゲリッグ（Lou Gehrig）
病）患者の脳脊髄液には見掛けの分子量が約55,000Dの
蛋白バンドが見られた。第４図に示すように、このALS
−特異的55,000Mr蛋白は正常被験者、アルツハイマー患
者のどちらの脳脊髄液にも見られない。
従って、患者の脳脊髄液の小量のサンプルに見られる
ホトラベル化した蛋白断片のパターンの独特な変化から
患者に存在する病気の状態を識別する鍵が与えられる。
微量な脳脊髄液サンプルに本発明の組成物、方法および
テストキットを用いることによって疾患特異的生化学マ
ーカーをホトラベル化し、検出することができ、患者の
病気の状態を同定することができる。
本発明の新規な方法は二重の比較システムで疾患状態
を診断する。特異的蛋白が存在しないことだけで特定の
疾患状態を簡単に判断するだけでは不十分である。無い
という結果だけに基づく結論は誤りになることがある。
例えば蛋白が実際には存在しているが操作エラーのため
に正しくホトラベル化されない場合もある。
本発明の診断は、患者から採取した体液サンプル中の
疾患特異的結合蛋白または生化学マーカーが存在するこ
とと、正常被験者のサンプルに特徴的に見られる［正
常］な結合蛋白または生化学マーカーの存在しないこと
の両方に基づいているので、この分野で長い間まれてき
た正常被験者および別の神経障害または精神障害あるい
は痴呆患者からアルツハイマー病患者を高い信頼性で正
確、安全且つ効果的に区別するという要求を満すことが
できる。本発明はさらに、長い間待たれていたALSやそ
の他の神経症候群または疾患の患者の疾患特異的生化学
マーカーを高い信頼性で正確、安全且つ効果的に検出可
能にするという要求も満すものである。
以下、当業者が本発明方法とその利点は完全に理解で
きようにするための実施例を示すが、以下の実施例は本
発明の単なる例示であって、本発明が下記実施例に限定
されるものではない。
実施例 標準的な方法および試薬はマニアティス（Maniatis）
達を用いた（1982年、Molecular Cloning:A Laboratoty
Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York）。
プリンホスフェートアジ化物類似体による特異的ヌクレ
オチド結合部位のホトアフィニティラベル化のための特
殊な技術はポッター・ハレーを用いた（Potter ＆ Hale
y、Meth.in Enzymol.,91:613〜633、1983）。おおよそ
の分子量は市販の標準蛋白の移行速度対対数分子量の表
から予想した移行速度（Mr）で示された。正確な結果を
保証するために各サンプルは少なくとも３回分析した。
実施例１ 脳脊髄液蛋白の精製 本発明の診断蛋白の特性決定は、アルツハイマー病、
パーキンソン病または癲癇と診断された条件を有する40
人の患者と、対応する年齢の対照群との脳脊髄液サンプ
ルをブラインドアッセイした結果を用い求めた。
実験に悪影響を与えるないようにするために脳脊髄液
は異なる期間−20℃で貯蔵した。収集直後にホトラベル
化した脳脊髄液について行った実験も長期間貯蔵した冷
凍したサンプルの場合と同じ特性を示した。新鮮な脳脊
髄液は死後数時間内に死体から収集した。冷凍したサン
プルは供給者エリ リリィ社（Eli Lilly,Inc.）とアテ
ナ ニューロサイエンス（Athena Neurosciences）から
ドライアイスで輸送され、検定まで−20℃で貯蔵したも
のである。各実験ではサンプルを完全に解凍し、所定量
を分採した後、サンプルをすぐに再冷凍し、−20℃の貯
蔵に戻した。サンプルは常に手袋を嵌めた手で取り扱っ
た。
脳脊髄液15μｌについて各検定を行った。テストした
脳脊髄液の量は各実験で一定であったが、各サンプルの
蛋白濃度はある程度変りた。しかし、僅かな蛋白の濃度
の変化で実験結果に影響はなかった。
アルツハイマー病患者の腰部脳脊髄液のサンプルの化
には、42,000Mrを視覚化するためには量が少なすぎる場
合があった。それらのサンプルは光分解の前に真空法、
凍結乾燥または高速真空濃縮を用いるか、硫酸アンモニ
ウムまたはポリエチレングリコール等による蛋白沈澱で
濃縮した。
濃縮でアルツハイマー病患者の脳脊髄液サンプル中の
42,000Mrがハッキリ見えるよになるが、正常な対照被験
者からの脳脊髄液中には対応する42,000Mr蛋白バンドは
検出できない。さらに、真空濃縮法の後は68,000Mr蛋白
は［32P］8N3ATPでホトラベル化されない。しかし、全
ての脳脊髄液サンプルに明らかに存在する26,000Mr蛋白
のホトラベル化は真空濃縮後減少しないので、この作用
は一般化されない。その結果、42,000Mr蛋白がより容易
に見ることができる。これは２つしかない主要なホトラ
ベル化された種の１つである。通常、脳脊髄液1mlを真
空下で最終容積が約0.2〜0.3mlになるまで蒸発させる
と、42,000Mrの蛋白の検出量は約３〜５倍に増加する。
1mlの脳部脳脊髄液を40％飽和硫酸アンモニウムで沈澱
させると検出量は少なくとも10〜20倍に増加する。
各脳脊髄液サンプルを［32P］8N3ATPでホトラベル化
して42,000Mr蛋白を同定した。脳脊髄液サンプルは脳脊
髄液、緩衝液及び水からなる。各実験で使用したホトプ
ローブはポッター及びハレー（Potter ＆ Haley）の方
法（Meth.in Enzymol.,91:613〜633（1983））で本発明
者が調製した。ICNラジオケミカルズから市販のプロー
ブ（Radiodhemicals）2727（Campus Drive,Irvine,CA 9
2715）も使用できる。
［32P］8N3cAMPの濃度を変えて様々な実験で使用し
た。濃度は１μＭから10μＭまでの範囲で変えたが、結
果には大きな変化はなかった。アルツハイマー病68,000
Mr蛋白で低濃度の［32P］8N3cAMPでホトラベル化の差が
最も明らかであり、その時、光化学の取込み程度は比較
的対照68,000Mr蛋白よりかなり低い。アルツハイマー病
患者サンプルで68,000Mrが減少する程度は濃度依存性が
高く、［32P］8N3cAMPの濃度が５μＭ以下では光化学的
取込みは観察されない。
各実験ではホトプロープを脳脊髄液サンプルに添加
し、６秒間かき回した後、処理したサンプルを各々室温
でさらに24秒間混合し、紫外線（UV）光に露光する。
処理したサンプルを氷上に置き、45秒間UV光に露光す
る。UV光源である強度6200μW/cm2の手持ちUVランプは
サンプルから1cmに配置した。ホトプローブでラベル化
たサンプルのUV活性化は常に０℃で行った。
６％過塩素酸を添加するか、硫酸アンモニウムの量を
増してサンプルを沈澱させた。硫酸アンモニウムによる
沈澱を利用してアルツハイマー病の脳脊髄液で見られる
蛋白をさらに特徴付けし、抗体形成のために蛋白を精製
した。各硫酸アンモニウム添加で沈澱させた蛋白を電気
泳動分析とオートラジオグラフィのために保存した。
同定された蛋白を沈澱させた硫酸アンモニウムのパー
センテージは蛋白とその特性を特徴付ける因子として使
用するのに十分に特異的である。従って、ホトラベル化
の前後で硫酸アンモニウムの沈澱を組み合わせることに
よって、42,000Mr蛋白を大容積の脳脊髄液から濃縮し
た。同時に汚染蛋白の大部分は除去された。
42,000Mr蛋白を40％硫酸アンモニウム飽和で沈澱させ
た。40％飽和を引き起こすのに必要な固体の超純粋な硫
酸アンモニウムの計算量で予め活性化し、ホトラベル化
した脳脊髄液サンプルに添加した。混合物を室温で30分
間穏やかに攪拌し、30分間卓上遠心分離（13,000XG）で
遠心分離して、精製蛋白を分離した。少量の各上澄み液
とペレットをSDS−PAGEで蛋白含有量の分析した。
精製蛋白サンプルを最も一般的な方法である蛋白可溶
化混合物（protein solubilizing mix）（PSM）に溶解
した。混合物中のSDS（硫酸ナトリウムドデジル）の量
は10％であり、その結果、最終サンプルに対するSDSの
濃度は４％であった。各実験で、サンプルを室温で溶解
した。
各サンプルを10％SDS−PAGEで分画し、140Vの初期電
圧で35mAの一定のアンペア数を2 1/2〜３時間流した。
全ての蛋白が10％ゲル上に良好に分離したので勾配は必
要なかった。
得られたSDS−PAGEゲルを染色して蛋白を検出し、ゲ
ルをＸ線フィルムに露出した。コマシィブリリアント
ブルー（Coommassie Brilliant Blue）Ｒ（CBB）がこれ
らの実験で蛋白を検出するための最も迅速且つ最も有効
な染料であることが証明された。完成されたSDS−PAGE
ゲルを各々を約１時間10％CBB（w/V）溶液で染色し、次
に、５％酢酸と10％イソプロピルアルコールで10〜18時
間の間脱色し、次に３回洗浄して、特異的ヌクレオチド
結合蛋白と未架橋のホトアフィニティラベル部分を除去
した。
最後に、染色したゲルを乾燥した後、デュポン クロ
ネックス（Dupont Cronex）4X線フィルムに露出した。
オートラジオグラフィでは各実験サンプルの蛋白中に光
化学的に取込まれるプローブに特有な活性と特異的蛋白
バンドの視覚化を加速する増倍スクリーンの有無とに従
って時間を変えた。
蛋白の量と各蛋白に含まれる放射能の量は露出された
Ｘ線フィルムまたは染色されたゲルをデンシオメーター
スキャンするか、ゲルから切出した蛋白パンドを液体シ
ンチレーション分光測定して定量した。0.50以下の低い
rhoレベルの変異度の分析によって重要性を決定した。
ブラインド条件下で分析した40のサンプルのうち、ア
ルツハイマー病患者からの16の脳脊髄液のサンプルは全
て42,000Mr蛋白への［32P］8N3ATPによる光化学的取込
みを示した。比較すると、２つの「対照」サンプルだけ
が42,000Mr蛋白への光化学的取込みを示したが、このサ
ンプルは86才と94才の被験者からのもので、彼らがアル
ツハイマー病にかかっていないことは確認できなかっ
た。同じ研究所から提供された３つのサンプルだけが予
想した光化学的取込みを示さなかった。また、約同数の
対照被験者からのサンプルとパーキンソン病または癲癇
患者からのサンプルからなる残る19の脳脊髄液サンプル
には特異的42,000Mr蛋白は存在しなかった。
実施例２ ［γ32P］8N3ATPを用いた脳脊髄液のホトラ
ベル化 比較する脳脊髄液サンプルは、第１図に示したように
アテナニューロサイエンス（Athena Neuroscience）か
ら提供された癲癇（Ｅ列）、パーキンソン病（Ｐ列）ま
たはアルツハイマー病（AD）に掛かっていると判明して
いる患者から得られたものと、正常な被験者（Ｎ列）か
ら得られたものである。実施例１の方法で各サンプルを
処理し、［γ32P］8N3ATPでホトラベル化し、分析し
た。しかし、脳脊髄液サンプル中の蛋白が隠れるように
覆われたSDS−PAGEゲルのオートラジオグラフの写真で
ある第１図に示すように、アルツハイマー病の患者から
のサンプルだけで約42kDの蛋白がホトラベル化された。
実施例３ ［32P］8N3cAMPを用いた脳脊髄液のホトラベ
ル化 比較する脳脊髄液サンプルは、実施例２で用いたもの
と同じで、第２図に示したように癲癇（Ｅ列）、パーキ
ンソン病（Ｐ列）またはアルツハイマー病（AD）にかか
っていることが分かっている患者から得られるものと、
正常な被験者（Ｎ列）から得られたものである。
第２図に示したように、２つを合せたSDS−ポリアク
リルアミドゲル（第2C図と第2D図）を用い［32P］8N3cA
MPでホトラベル化した後各サンプルの脳脊髄液蛋白を分
離した。ゲルＩはCBBで染色し（第2c図）、Ｘ線フィル
ムに露出し、オートラジオクラフィで分析した（第2A図
と第2B図の下）。
CBBで染色したゲル（第2C図と第2D図）は脳脊髄液中
に複数の蛋白が見られることを示している。アルツハイ
マー病と対照サンプル間で比較をしても蛋白レベルは変
化しなかった。しかし、オートラジオグラフ（第2A図と
第2B図の上と下）はアルツハイマー病と対照サンプルと
の間で各蛋白に導入された［32P］8N3cAMPの量が変化し
たことを示している。特に、全ての脳脊髄液蛋白が光化
学的取込みをしたわけではないので、露出されたＸ線フ
ィルムよりも染色されたゲルにより多くのパンドが出現
した。第２図に示すように、約68kDの蛋白はアルツハイ
マー病ではないと診断された患者からのサンプルでだけ
ホトラベル化された。反対に、第１図に示すように42kD
の蛋白はアルツハイマー病の患者のサンプルのみで［32
P］8N3cAMPでホトラベル化された。
染色されたゲルと露出されたオートラジオクラフフィ
ルムとの間の相違は蛋白のホトラベル化が極めて特異的
で再現性がある方法であることを示した。この実験によ
って、ホトラベル化された疾患特異的蛋白パンドはほと
んど同じMrの値を有し、僅かな変化はゲルそれ自体の微
小な変化によるものであること分かった。
実施例４ アルツハイマー病特異的42kD結合蛋白の精製 42kD脳脊髄液蛋白を高速液体クロマトグラフィ（HPL
C）で純粋な分画として分離した。アルツハイマー病患
者からの脳脊髄液をホトラベル化し、蛋白分学を20〜40
％硫酸アンモニウムで飽和沈澱させた。沈澱した蛋白を
緩衝液Ａ（0.1％トリフルオロ酢酸（TFA））に溶解し、
C4カラム上でアセトニトリル勾配、すなわち０％緩衝液
で０〜20分、次に緩衝液Ｂ（ここで、緩衝液Ｂは0.1％T
FAと70％CH3CN（アセトニトリル））の割合を100％まで
増加させながら20〜80分、HPLCで分離した。
42kD蛋白を約82〜92％Ｂで溶離する。硫酸アンモニウ
ム沈澱の前にサンプルを［32P］2N3ATPで光分解してこ
の分画も放射化した。分画の純度と同定は画分をSDS−P
AGEとオートラジオグラフィで視覚化して確認した。精
製蛋白が光化学的取込みをし、42,000kDの分子量を有す
ることが結論された。
実施例５ 脳脊髄液中に見られるアルツハイマー病特異
的42,000Mr蛋白の同定 アルツハイマー病患者からのホトアフィニティラベル
化した脳脊髄液中で本発明方法によって検出されたアル
ツハイマー病特異的42kD蛋白が哺乳類のグルタミンシン
テターゼ（GS）であることを下記の証拠に基づいて確認
した： 1.精製されたGS（シグマ（Sigma）社ら購入、羊の脳か
ら精製）はSDS−PAGE上の共泳動でアルツハイマー病患
者からの脳脊髄液中の42,000Mr蛋白と同じ展開をする。
2.精製したGSとアルツハイマー病患者からの脳脊髄液中
に見られる42kDはATP、８−アジド−ATPおよび２−アジ
ド−ATPを結合させる同じ飽和度とKd値を有している。
すなわち、いずれの蛋白も２−アジド−ATPと８−アジ
ド−ATPの両方と約10μｍで起きる最大光化学的取込み
の半分の40〜50μＭで光化学的取込みの飽和を示した。
また、ATPは、８−または２−アジド−ATPによってほと
んど同じATP濃度で両方の蛋白のホトリラベル化を減少
させた。従って、GSとアルツハイマー病患者の脳脊髄液
中の42kD蛋白は同じヌクレオチド結合特性を有する。
3.精製したGSとアルツハイマー病患者の脳脊髄液中の42
kD蛋白のホトラベル化は、第３図に示したようにヌクレ
オチドの結合に関してGSの動力学に影響することが公知
のある配位子の添加に同じ動力学特性を示した。特に、
1000mM重炭酸アンモニウムを添加することによって［32
P］2N3ATPの結合を高め、従って、42kD脳脊髄液蛋白とG
Sの両方をホトラベル化を約５倍に高めた。また、10mM
グルタレート（グルタメート基質類似対）を添加すると
［32P］2N3ATPの結合が僅かに減少し、従って、過剰な
重炭酸アンモニウムの存在下で42kD脳脊髄液蛋白とGSの
両方をホトラベル化を僅かに減少させた。
4.GSとアルツハイマー病患者からの脳脊髄液42kD蛋白で
はほとんど同じモル対モル比の光化学的取込みが見られ
る。両方の蛋白は、８−アジド−ATP対２−アジド−ATP
と同じ相対的光取込み効率を示した。特に、GSとアルツ
ハイマー病患者からの脳脊髄液中に見られる42kD蛋白へ
の光導入量は、［γ32P］2N3ATPがホトラベルとして使
用した時、モル対モル基準で、構造的に異なるATP類似
体［γ32P］8N3ATPよりむしろ大きい。
5.精製したGSとアルツハイマー病患者からの脳脊髄液42
kD蛋白はどちらもウエスタンブロット（Western blot）
でGS（ラットの脳）に選択的な抗体に反応性であること
が公知の二次放射性沃化抗体でラベル化される。しか
し、他の脳脊髄液蛋白とクレアチンキナーゼはこのGS抗
体と相互反応しなかった。従って、GSの選択的な抗体は
アルツハイマー病患者からの脳脊髄液の42kD蛋白と反応
した。
6.42kD蛋白と精製したGSの両方の溶離パターンは、C4カ
ラムと実施例４に記載したようなアセトニトリル勾配を
使用したHPLCクロマトグラフィでほとんど同じである。
どちらも75〜85％緩衝液Ｂで溶離される。
7.2次元ゲル電気泳動（IEF Ｘ SDS−PAGE）でアルツ
ハイマー病患者からの脳脊髄液の42kD蛋白は、6.0±0.2
pH単位を有する単一の種であった。比較すると、シグマ
（Sigma）社製の精製したGSでは、42,000Mr値の主要な
蛋白の種のpIの範囲は5.8〜7.2であり、６つの等電形か
らなる。等電形の最も酸性のものは、アルツハイマー病
患者からの脳脊髄液中の42kDホトラベル化蛋白と共に同
様に２次元ゲル上で泳動する。
実施例６ 病気特異的アルツハイマー病蛋白のイムノア
ッセーの展開 正常対照被験者とアルツハイマー病患者からの脳のホ
モジネート中のGSのレベルをGS抗体に対する免疫応答に
関して検査した。GSは、対照サンプルと比較してアルツ
ハイマー病患者からのサンペルで大きく上昇しているこ
とが測定された。
本発明方法でポリクローナル抗体およびモノクローナ
ル抗体の両方の特異的製造用の42,000Mr蛋白を分離、精
製することができる。さらに、42,000Mr蛋白は特異的基
質を有するグルタミンシンテアーゼなのでGSの触媒特性
に基づくこの酵素の存在の生化学的検定を展開すること
ができる。
アルツハイマー病の信頼性の高い診断テストは、アル
ツハイマー病患者に特有の特異的蛋白の精製及び識別を
要求する。特異的蛋白に対する抗体の製造によって、免
疫検定方法の展開が容易になる。
実施例 ７進行性脊髄性筋萎縮症とアルツハイマー病患
者からの脳脊髄液サンプルのホトラベル化 進行性脊髄性筋萎縮症を有することが判明している４
人の患者らの脳脊髄液サンプル（ALS列）をアルツハイ
マー病患者からのサンプル（AD列）と比較した。実施例
１の方法によって各サンプルを処理し、［γ32P］8N3AT
Pまたは［γ32P］8N3GTPでホトラベル化し、分析した。
脳脊髄液サンプル中の蛋白が覆われているSDS−PAGE
ゲルのオートラジオクラフの写真の第４図に示されるよ
うに、約55,000Mrの特異的蛋白はALS患者からの脳脊髄
液中でだけ［γ32P］8N3GTPでホトラベル化された。55,
000Mrの放射線標識帯はALS患者からの［32P］8N3GTPで
ホトラベル化された脳脊髄液の４つのサンプルの各々で
見られた。第４図に示した［32P］8N3GTPでホトラベル
化されたバンド、ALS＃１は第４図の対応する蛋白バン
ド列２、３及び４の約12分の１の強さであるが、検出は
可能である。
比較すると、［32P］8N3GTPでホトラベル化された55k
D蛋白はアルツハイマー病患者または複数の他の非ALS患
者からの脳脊髄液サンプル中には観察されない。また、
アルツハイマー病特異的42kD蛋白への検出可能な光化学
的取込みはALS患者からの脳脊髄液サンプルでは見られ
ない。従って、患者の脳脊髄液中の特有な疾患特異的蛋
白を同定するためにヌクレオチドアフィニティプローブ
でホトアフィニティラベル化する本発明方法は、ヒトの
神経疾患または症候群の存在または進行の測定に有効で
あることが分かった。
以上、本発明は現在好ましい実施例を参照して記載し
たが、当業者には本発明の精神の範囲を逸脱しないで種
々変更、置換、省略および改良が可能であることは理解
されよう。従って、本発明の範囲は下記の請求の範囲と
その均等物によってのみ限定される。
フロントページの続き (56)参考文献 Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏ ｇｙ，Ｖｏｌ．26，Ｎｏ．２（1989）ｐ 210 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．，Ｖｏｌ．88（1991）ｐ10540 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/68 G01N 33/50 A61K 39/395

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記（ａ）〜（ｄ）からなる脳脊髄液サン
    プル中のグルタミンシンテターゼのインビトロ検出方
    法： （ａ） 見掛けの分子量（Mr）が約42,000ダルトンのヌ
    クレオチド結合蛋白のグルタミンシンテターゼを含む脳
    脊髄液サンプルを、ヌクレオチド結合蛋白のヌクレオチ
    ド結合部位に結合させるのに有効な量のラベル化された
    ATP−またはGTP−類似のホトアフィニティラベル化試薬
    と接触させてヌクレオチド結合蛋白をホトアフィニティ
    ラベル化し、 （ｂ） 脳脊髄液サンプルを分画してホトアフィニティ
    ラベル化されたヌクレオチド結合蛋白を分離し、 （ｃ） 分離されたホトアフィニティラベル化されたヌ
    クレオチド結合蛋白の存在を検出し、 （ｄ） ホトアフィニティラベル化されたヌクレオチド
    結合蛋白の存在をアルツハイマー病の存在と相関させ
    る。
  2. 【請求項２】ラベル化されたホトアフィニティラベル化
    試薬が放射線でラベル化されている請求項１に記載の方
    法。
  3. 【請求項３】ホトアフィニティラベル化試薬が光活性化
    を行うのに十分な紫外線光で活性化する請求項１または
    ２に記載の方法。
  4. 【請求項４】溶解したホトアフィニティラベル化された
    蛋白をゲル電気泳動で分離する請求項１〜３のいずれか
    一項に記載の方法。
  5. 【請求項５】放射線でラベル化されたホトアフィニティ
    ラベル化試薬が［32P］８−アジドアデノシン−５′−
    トリホスフェート（［32P］8N3ATP）または［32P］２−
    アジドアデノシン−５′−トリホスフェート（［32P］2
    N3ATP）である請求項２〜４のいずれか一項に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】サンプルが見掛けの分子量Mrが約68,000ダ
    ルトンの所に検出される［32P］8N3cAMP）でホトラベル
    化された蛋白を含まない請求項１〜５のいずれか一項に
    記載の方法。
  7. 【請求項７】下記（ａ）〜（ｆ）からなる脳脊髄液サン
    プル中のグルタミンシンテターゼのインビトロ検出方
    法： （ａ） 見掛けの分子量Mrが約42,000ダルトンのヌクレ
    オチド結合蛋白を含む哺乳類の脳脊髄液サンプルを、ヌ
    クレオチド結合部位でヌクレオチド結合蛋白に結合させ
    るのに有効な量のラベル化されたATP−またはGTP−類似
    のホトアフィニティラベル化試薬と接触させてヌクレオ
    チド結合蛋白をホトアフィニティラベル化し、 （ｂ） 有効量の沈澱剤を用いてサンプルからホトアフ
    ィニティラベル化された蛋白を沈澱させ、 （ｃ） 沈澱したホトアフィニティラベル化された蛋白
    を溶解し、 （ｄ） 溶解したホトアフィニティラベル化された蛋白
    を電気泳動しでホトアフィニティラベル化された蛋白を
    分離し、 （ｅ） 分離したホトアフィニティラベル化された蛋白
    の存在を検出し、 （ｆ） ホトアフィニティラベル化された蛋白の存在を
    アルツハイマー病の存在と相関させる。
  8. 【請求項８】ラベル化されたホトアフィニティラベル化
    試薬が放射線でラベル化されている請求項７に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】ホトアフィニティラベル化試薬が光活性化
    を行うのに十分な紫外線光で活性化する請求項７または
    ８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】溶解したホトアフィニティラベル化され
    た蛋白をゲル電気泳動で分離する請求項７〜９のいずれ
    か一項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】放射線でラベル化されたホトアフィニテ
    ィラベル化試薬が［32P］８−アジドアデノシン−５′
    −トリホスフェート（［32P］8N3ATP）または［32P］２
    −アジドアデノシン−５′−トリホスフェート
    （［32P］2N3ATP）である請求項８〜10のいずれか一項
    に記載の方法。
  12. 【請求項１２】見掛け分子量Mrが約68,000ダルトンの所
    に検出される［32P］8N3cAMP）でホトラベル化された蛋
    白をサンプルが含まない請求項７〜11のいずれか一項に
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】下記（ａ）〜（ｆ）からなる脳脊髄液サ
    ンプル中のグルタミンシンテターゼのインビトロ検出方
    法： （ａ） 見掛け分子量（Mr）が約42,000ダルトンのヌク
    レオチド結合蛋白のグルタミンシンテターゼを含む脳脊
    髄液サンプルを、グルタミンシンテターゼ−抗体複合体
    が形成できる条件下で、グルタミンシンテターゼ特異抗
    体と接触させ、 （ｂ） グルタミンシンテターゼ−抗体複合体の存在を
    検出し、 （ｃ） グルタミンシンテターゼ−抗体複合体の存在を
    アルツハイマー病の存在と相関させる。
  14. 【請求項１４】グルタミンシンテターゼ特異的抗体を第
    ２のラベル化された抗体に結合してラベル化する請求項
    13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】グルタミンシンテターゼ−抗体複合体の
    形成を、エンザイムリンクトイムノソルベントアッセ
    イ、ラジオイムノアッセイ、イムノラジオメトリックア
    ッセイ、サンドウィッチイムノラジオメトリックアッセ
    イ、フルオロイムノアッセイ、ケミルミネッセントアッ
    セイ、バイオルミネッセントアッセイまたはウエスタン
    ブロット法で検出する請求項13に記載の方法。
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