KR20220071209A - 리간드 스크리닝을 위한 마이크로 방사성 결합 분석 - Google Patents

리간드 스크리닝을 위한 마이크로 방사성 결합 분석 Download PDF

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KR20220071209A
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Abstract

본 개시내용은 마이크로 방사성 결합 분석에서 특정 단백질 표적에 대한 리간드의 결합을 측정할 수 있는 결합 분석에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 건강하거나 질병에 걸린 인간 공여체 샘플로부터 단리된 재조합 또는 조직 유래 단백질과 같은 저 존재비의 단백질에 유용한 마이크로 방사성 결합 분석에 관한 것이다.

Description

리간드 스크리닝을 위한 마이크로 방사성 결합 분석
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 10월 1일에 출원된 미국 가출원 제62/909,101호 및 2020년 2월 6일에 출원된 미국 가출원 제62/970,977호의 우선권의 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용은 어떤 목적으로든 그 전체가 본원에 참조로 원용된다.
분야
본 출원은 코팅된 표면 상에 고정된 단백질에서의 리간드 특성화 및 스크리닝을 위한 마이크로 방사성 결합 분석(micro-radiobinding assay)을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
방사성 결합 분석은 리간드와 표적 사이의 상호작용을 통제하는 결합 매개변수를 결정하는 것을 목표로 한다. 이러한 분석은 리간드-표적 상호작용의 고유한 매개변수를 정의하기 위해 포화, 경쟁 및 동력학 결합 실험을 포함한 다양한 실험 패러다임에 사용될 수 있다.
낮은 존재비의 생물학적 표적에 대한 고감도 분석이 필요하다.
요약
포화 분석은 Kd로 지칭되는, 표적에 대한 리간드의 친화도를 측정하는 것을 목표로 한다. Kd는 평형에서의 해리 상수이며 주어진 표적의 결합 부위의 50%를 차지하는 데 필요한 리간드의 농도로 정의된다. Kd를 결정하기 위해, 표적 단백질은 방사성 표지된(radiolabeled) 시험 리간드(test ligand)와 함께 인큐베이션되며, 여기서 단백질은 일정한(고정) 농도인 반면, 방사성 표지된 시험 리간드의 농도는 다양하다. 평형에서, 결합된 리간드의 양이 포화가 발생할 때까지 방사성 표지된 시험 리간드의 각 농도에 대해 정량화된다. 얻어진 데이터는 표적 단백질에 결합된 리간드의 몰 농도로 표현될 수 있고 따라서 리간드의 Kd를 계산할 수 있다. 방사성 결합 실험의 두 번째 유형은 경쟁적 방사성 결합 분석이다. 경쟁 형식에서, 방사성 결합 분석은 방사성 표지된 시험 리간드를 치환할 수 있는 비방사성 표지 (저온) 시험 리간드의 능력을 측정한다. 방사성 표지된 시험 리간드는 그의 Kd에 근접한 고정 농도로 사용되고, 비방사성 표지 시험 리간드는 억제 (또는 치환) 상수(Ki)를 결정할 수 있도록 다양한 농도에서 사용된다. 이 경쟁 모드는 또한 하나 또는 여러 개의 비방사성 표지된 시험 리간드/시험 화합물이 단일 또는 다중 농도에서 하나의 공통 방사성 표지된 도구 리간드(radiolabeled tool ligand)를 치환할 수 있는 능력에 대해 시험되는 스크리닝 분석에 사용될 수 있다. 경쟁 비율(시험 리간드가 단일 농도에서 사용되는 경우), 또는 Ki(시험 리간드가 다중 농도에서 사용되는 경우)의 계산을 통해, 시험 리간드/시험 화합물은 방사성 표지된 도구 리간드를 치환하는 효능에 따라 순위가 매겨질 수 있다. 순위는 정의된 표적 단백질에 대한 강력한 리간드를 식별하여 발견 프로그램을 추진하는 데 사용할 수 있다.
방사성 결합 분석에서, 방사성 표지된 리간드는 방사성 동위원소로 표지되고 이에 따라 표적에 대한 그의 결합 분획의 정량화가 가능해질 수 있다. 이것은 광전자 증배관 장치가 포함된 검출기로 리간드 고유 이온화 방사능을 측정하여 얻는다. 평형에서 표적에 결합된 리간드의 양을 추정하기 위해서는, 표적-리간드 복합체(리간드의 결합 부분)와 결합되지 않은 리간드(리간드의 자유 부분)를 분리하는 것이 필요하다. 기존 방사성 결합 분석에서, 물리적 분리는 보통 여과에 의해 수행되며, 여기서는 일반적으로 니트로셀룰로오스 또는 유리 섬유로 만들어진 필터에 결합된 리간드-표적 복합체만 유지하는 반면, 자유 리간드는 필터를 통과하여 제거된다. 이후 리간드의 결합된 분획을 정량화할 수 있다. 기존 필터 기반 방사성 결합 분석은 여과 공정에 필요한 대량의 필요한 단백질 농도를 달성하기 위해 다량의 표적 단백질을 필요로 한다. 상당한 양의 단백질이 필요하기 때문에, 인간 조직 샘플로부터 특히 낮은 수준으로 존재할 수 있는 표적 단백질을 단리해야 하는 경우 분석의 사용이 제한된다.
본원에 기술된 마이크로 방사성 리간드 결합 분석은 뇌 또는 환자의 다른 조직 또는 체액에서 유래된 것과 같은 낮은 존재비의 단백질에 대한 리간드의 결합의 특성화를 가능하게 한다. 여기에는 신경퇴행성 질환과 관련된 단백질이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 실제로, 이러한 단백질은 단백질 침착으로 이어지는 구조적 변화를 겪는 것으로 알려져 있으며, 이러한 단백질성 침착물의 축적은 질환 발현 및 진행과 직접적으로 연결된다. 이러한 단백질의 예는 다음과 같다: 아밀로이드 베타(Abeta) 및 타우(Tau) - 여기서의 침착물은 알츠하이머병(AD), 다운 증후군 및 기타 타우병증의 특징임 -, 알파-시누클레인(a-syn) - 여기서의 침착물은 파킨슨병(PD) 및 루이소체를 동반한 치매의 특징임, 및 TAR DNA-결합 단백질 43(TDP-43) - 여기서의 침착물은 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 TDP-전두측두엽 변성(TDP-FTLD)의 특징임(Serrano-Pozo et al., 2011, Spillantini et al., 1997, Neumann et al., 2006 and Nelson et al., 2019). 이들 병리학적 단백질 침착물은 재조합 단백질로부터 시험관 내에서 인공적으로 생성될 수 있지만, 시험관 내에서 생성된 침착물(예컨대 응집체)은 환자 조직에서 단리된 단백질과 형태가 다르다는 것이 널리 알려져 있다. 따라서, 치료제 또는 진단제로 이러한 단백질 침착물(예컨대 응집체)을 표적으로 하는 발견 프로그램은 이상적으로는 더 높은 번역 가치를 지닌 전임상 데이터 생성을 보장하기 위해 뇌 유래 단백질 샘플을 약리학적 분석의 표적으로 사용할 것이다.
기존 필터 기반 방사성 결합 분석에 필요한 생물학적 표적의 양을 최소화해야 할 필요성 때문에 세포주에서 단리된 단백질 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에 대한 리간드 결합을 조사하기 위한 마이크로어레이(microarray) 기술이 개발되었다(Posner et al., 2007). 그러나, 예를 들어 인간 뇌 샘플에서 유래된 것과 같은 저 존재비의 병리학적 단백질에 적합한 정확하고 매우 민감한 분석 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
본 출원은 환자 뇌 샘플로부터 유래된 병리학적 단백질 침착물에 특히 적합하도록 낮은 존재비의 단백질 표적을 위해 특별히 설계된 소형화된 방사성 결합 분석을 기술한다. 필요한 환자 유래 조직의 양을 최소화하면서 인간 유래의 병리학적 단백질 침착물에 대한 화합물을 스크리닝할 수 있는 능력은 일반적으로 사용되는 필터 기반 방사성 결합 분석의 주요 한계와 본원에 기술된 마이크로 방사성 결합 분석의 주요 이점을 나타낸다. 마이크로 방사성 결합 분석은 기존 필터 기반 방사성 결합 분석보다 최대 500배 적은 양의 단백질 표적 물질을 사용함으로써, 매우 적은 양의 단백질 표적을 사용할 수 있다. 이 분석은 리간드 라이브러리의 스크리닝을 위한 고처리량 분석뿐만 아니라 Kd 및 Ki 값을 생성하는 데 사용할 수 있다. 분석은 기존 필터 기반 방사성 결합 분석과의 직접 비교로 성공적으로 검증되었다.
본원에 기술된 방법은 코팅된 표면 상에 병리학적 단백질의 국소화 마이크로샘플을 갖는 마이크로어레이를 사용한다. 일부 측면에서, 병리학적 단백질 표적의 생화학적으로 풍부화된(enriched) 샘플은 코팅된 표면(예컨대 코팅된 유리 표면) 상에 스폿팅되어 잘 정의된 위치에 스폿이 있는 병리학적 단백질 어레이를 형성한다. 일부 측면에서, 뇌 유래 단백질 샘플은 단백질 침착물을 농축하고(분석으로부터의 적절한 신호를 보장하기 위해), 코팅된 표면 상의 적절한 분배 또는 스폿팅에 적절한 점도를 갖는 농축된 샘플을 생성하기 위해 풍부화 단계를 거친다. 신호 검출은 상이한 인큐베이션 단계 끝에 형광체 이미징 필름 또는 스크린에 노출된 건조된 코팅 표면을 사용해 형광체 이미징에 의해 얻어진다. 적절한 시간 동안 스크린이나 필름에 표면을 노출시킨 후, 스크린을 인광체 이미징 스캐너로 스캔하고 ImageJ-win 64 소프트웨어와 같은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 신호를 정량화한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 풍부화된 생물학적 샘플에서 병리학적 단백질에 대한 시험 리간드의 결합 친화도(binding affinity; Kd)를 결정하는 방법에 관한 것으로서,
마이크로어레이 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액(aliquot)을 저온(cold) 시험 리간드와 포화 고정 농도(saturating fixed concentration)에서 접촉시키는 단계;
분취액을 방사성 표지된 시험 리간드와 다중 농도에서 접촉시켜 방사성 표지된 시험 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 시험 리간드를 제거하는 단계;
각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 시험 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
각 분취액에서 검출된 신호로부터 Kd를 계산하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 풍부화된 생물학적 샘플에서 병리학적 단백질에 대한 시험 리간드의 결합 친화도(Kd)를 결정하는 방법에 관한 것으로서,
마이크로어레이 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액을 방사성 표지된 시험 리간드와 다중 농도에서 접촉시켜 방사성 표지된 시험 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
분취액을 저온 시험 리간드와 포화 고정 농도에서 접촉시키는 단계;
분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 시험 리간드를 제거하는 단계;
각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 시험 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
각 분취액에서 검출된 신호로부터 Kd를 계산하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 풍부화된 생물학적 샘플에서 병리학적 단백질에 대한 시험 리간드의 결합 친화도(Kd)를 결정하는 방법에 관한 것으로서,
마이크로어레이 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액을 다중 농도에서의 방사성 표지된 시험 리간드 및 포화 고정 농도에서의 저온 시험 리간드와 접촉시켜 방사성 표지된 시험 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 시험 리간드를 제거하는 단계;
각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 시험 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
각 분취액에서 검출된 신호로부터 Kd를 계산하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 풍부화된 생물학적 샘플에서 병리학적 단백질에 대한 시험 리간드의 억제 상수(Ki)를 결정하는 방법에 관한 것으로서,
마이크로어레이 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액을 방사성 표지된 시험 리간드와 시험 화합물에 대한 Kd에 근접한 고정 농도에서 접촉시켜 방사성 표지된 시험 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
분취액을 저온 시험 리간드와 다중 농도에서 접촉시키는 단계;
분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 시험 리간드를 제거하는 단계;
각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 시험 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
각 분취액에서 검출된 신호로부터 Ki를 계산하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 풍부화된 생물학적 샘플에서 병리학적 단백질에 대한 시험 리간드의 억제 상수(Ki)를 결정하는 방법에 관한 것으로서,
마이크로어레이 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액을 저온 시험 리간드와 다중 농도에서 접촉시키는 단계;
분취액을 방사성 표지된 시험 리간드와 시험 리간드에 대한 Kd에 근접한 고정 농도에서 접촉시켜 방사성 표지된 시험 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 시험 리간드를 제거하는 단계;
각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 시험 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
각 분취액에서 검출된 신호로부터 Ki를 계산하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 풍부화된 생물학적 샘플에서 병리학적 단백질에 대한 시험 리간드의 억제 상수(Ki)를 결정하는 방법에 관한 것으로서,
마이크로어레이 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액을 시험 리간드에 대한 Kd에 근접한 고정 농도에서의 방사성 표지된 시험 리간드 및 다중 농도에서의 저온 시험 리간드와 접촉시켜 방사성 표지된 시험 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 시험 리간드를 제거하는 단계;
각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 시험 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
각 분취액에서 검출된 신호로부터 Ki를 계산하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 풍부화된 생물학적 샘플 중의 병리학적 단백질로 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 도구 리간드를 치환할 수 있는 능력에 대해 시험 화합물을 평가하는 방법에 관한 것으로서,
마이크로어레이 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액을 방사성 표지된 도구 리간드와 도구 리간드의 Kd에 근접한 고정된 농도에서 접촉시켜 방사성 표지된 도구 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
분취액을 저온 시험 화합물과 단일 농도 또는 다중 농도에서 접촉시키는 단계;
분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 도구 리간드를 제거하는 단계;
각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 도구 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
(a) 저온 시험 화합물이 단일 농도에서 접촉되는 경우, 각 분취액에서 검출된 신호로부터 저온 시험 화합물에 대한 경쟁 퍼센트; 또는 (b) 저온 시험 화합물이 다중 농도에서 접촉되는 경우, 각 분취액에서 검출된 신호로부터 저온 시험 화합물에 대한 Ki를 계산하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 풍부화된 생물학적 샘플 중의 병리학적 단백질로 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 도구 리간드를 치환할 수 있는 능력에 대해 시험 화합물을 평가하는 방법에 관한 것으로서,
마이크로어레이 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액을 저온 시험 화합물과 단일 농도 또는 다중 농도에서 접촉시키는 단계;
분취액을 방사성 표지된 도구 리간드와 도구 리간드의 Kd에 근접한 고정 농도에서 접촉시켜 방사성 표지된 도구 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 도구 리간드를 제거하는 단계;
각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 도구 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
(a) 저온 시험 화합물이 단일 농도에서 접촉되는 경우, 각 분취액에서 검출된 신호로부터 저온 시험 화합물에 대한 경쟁 퍼센트; 또는 (b) 저온 시험 화합물이 다중 농도에서 접촉되는 경우, 각 분취액에서 검출된 신호로부터 저온 시험 화합물에 대한 Ki를 계산하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 풍부화된 생물학적 샘플 중의 병리학적 단백질로 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 도구 리간드를 치환할 수 있는 능력에 대해 시험 화합물을 평가하는 방법에 관한 것으로서,
마이크로어레이 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액을 단일 농도 또는 다중 농도에서의 저온 시험 화합물 및 도구 리간드의 Kd에 근접한 고정 농도에서의 방사성 표지된 도구 리간드와 접촉시켜 방사성 표지된 도구 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 도구 리간드를 제거하는 단계;
각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 도구 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
(a) 저온 시험 화합물이 단일 농도에서 접촉되는 경우, 각 분취액에서 검출된 신호로부터 저온 시험 화합물에 대한 경쟁 퍼센트; 또는 (b) 저온 시험 화합물이 다중 농도에서 접촉되는 경우, 각 분취액에서 검출된 신호로부터 저온 시험 화합물에 대한 Ki를 계산하는 단계를 포함한다.
도 1은 마이크로 방사성 결합 분석의 구성을 나타낸다. 고체 표면(예컨대 아미노프로필실란(APS)과 같은 소수성 접착 표면으로 코팅된 유리 슬라이드)(A)이 단백질 표적을 스폿팅하기 위한 지지체로 사용된다. 자동 스폿팅 장치를 사용하여 단백질로 표면을 스폿팅한 후, 각각 9개 스폿의 64 패드를 얻는다(B). 일부 실시양태에서, 표면 상에 방수 챔버(chamber)가 있는 표면(C)이 단백질 표적으로 수동으로 스폿팅된다(D).
도 2는 기존 필터 기반 방사성 결합 분석(A) 및 마이크로 방사성 결합 분석(B)을 사용하여 AD 인간 뇌 유래 타우 침착물에서 도구 리간드에 대한 결합 친화도(Kd)를 측정한 결과를 나타낸다. 도 2A의 Y 축은 분당 카운트(cpm)로 표현된, 표적에 결합된 특이적 방사성 표지된 리간드 양의 측정을 나타낸다. 도 2B의 Y 축은 표적에 결합된 특이적 방사성 표지 리간드의 양으로 얻은 신호에 비례하는 필름에 존재하는 신호 강도의 정량화를 나타낸다. 도구 리간드 화합물은 필터 기반 분석 (A)에 의해 11.8 nM의 Kd를, 마이크로 방사성 결합 분석(B)에 의해 7.9 nM의 Kd를 나타내었다. 두 Kd 모두 우수한 적합성을 나타내었다((A)의 경우 R2 = 0.97, (B)의 경우 R2 = 0.85).
도 3은 마이크로 방사성 결합 분석을 사용하여 PD 인간 뇌 유래 a-syn 및 전두측두엽 치매(FTD) 인간 뇌 유래 TDP-43 침착물에서의 시험 화합물에 대한 결합 상수(Kd)의 결정 결과를 나타낸다(화합물 3, a-syn, A; 화합물 2, a-syn, B; 화합물 3, TDP-43, C). 각 도면의 Y 축은 표적에 결합된 특이적 방사성 표지 리간드의 양으로 얻은 신호에 비례하는 필름에 존재하는 신호 강도의 정량화를 나타낸다. 화합물 3은 PD-뇌 유래 a-syn에서 10.8 nM의 Kd로 우수한 적합성을 나타내었고(R2 = 0.87; A), FTD-뇌 유래 TDP-43에서 138 nM의 Kd로 우수한 적합성을 나타내었다(R2 = 0.79; C). 화합물 2는 PD-뇌 유래 a-syn에서 7.8 nM의 Kd로 우수한 적합성을 나타내었다(R2 = 0.80; B).
도 4는 마이크로 방사성 결합 분석을 사용하여 AD 인간 뇌 유래 타우 침착물 상의 삼중수소화 도구 리간드(A) 및 PD 인간 뇌 유래 a-syn 침착물 상의 화합물 3(B)의 Ki로 측정된 치환능의 결정 결과를 나타낸다. 각 도면의 Y 축은 백분율로 표시된 표지된 화합물의 치환을 나타내며, 여기서 100%는 완전한 치환에 해당한다. 도구 리간드는 1 nM의 Ki로 우수한 적합성을 나타내었다(R2 = 0.97). 화합물 3은 41 nM의 Ki로 우수한 적합성을 나타내었다(R2 = 0.84).
도 5는 도구 리간드로서 방사성 표지된 화합물 3을 사용하는 마이크로 방사성 결합 분석에서 화합물 4, 5 및 6(각각 A, B 및 C)의 스크리닝 결과를 나타낸다. 각 도면의 Y 축은 백분율로 표시된 표지된 화합물의 치환을 나타내며, 여기서 100%는 완전한 치환에 해당한다. 화합물 4, 5 및 6의 Ki는 13, 37 및 147 nM에서 측정되었고, 모두 우수한 적합성을 나타냈다(각각 R2 = 0.97, 0.80 및 0.64).
상세한 설명
본 개시내용의 추가적인 측면 및 이점은 본 개시내용의 예시적인 측면이 예시되고 설명되는 다음의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이해되는 바와 같이, 본 개시내용은 다른 측면 및 상이한 측면이 가능하고, 그의 여러 세부 사항은 모두 개시내용으로부터 벗어남이 없이 다양한 측면에서 변경될 수 있다. 따라서, 설명은 본질적으로 예시적인 것이지 제한적인 것으로 간주되어서는 안된다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로서 본원에 포함된다.
병리학적 단백질은 인간 조직 또는 체액에 비정상적으로 축적될 때 병리학적 효과를 일으키는 단백질이다. 일부 실시양태에서, 병리학적 단백질은 이러한 축적 시 필라멘트, 엉킴 또는 기타 응집체와 같은 침착물을 형성하는 단백질이고, 이러한 침착물은 기능장애 및 질환 진행을 유발한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 분석에 사용된 병리학적 단백질은 당업자에게 공지된 방법을 통해 생성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 사용된 병리학적 단백질은 인간 생물학적 샘플로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 병리학적 단백질은 인간 생물학적 샘플에 존재하며, 이는 본원에 기재된 분석에 사용하기 위해 더 농축된 생물학적 샘플을 제공하도록 당업자에게 공지된 방법을 통해 풍부화된다. 일부 실시양태에서, 풍부화된 생물학적 샘플은 약 1 내지 약 6.5 mg/mL의 총 단백질(병리학적 단백질 표적 + 기타 샘플 단백질)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 풍부화된 생물학적 샘플은 약 1 내지 약 2 mg/mL의 총 단백질(병리학적 단백질 표적 + 기타 샘플 단백질)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 풍부화된 생물학적 샘플은 약 3.5 내지 약 6.5 mg/mL의 총 단백질(병리학적 단백질 표적 + 기타 샘플 단백질)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 풍부화된 생물학적 샘플은 또한 지질, RNA, DNA, 또는 기타 세포 성분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 생물학적 샘플은 인간 체액(예컨대 비강 분비물, 소변 샘플, 혈액 샘플, 혈장 샘플, 혈청 샘플, 간질액(ISF) 샘플 또는 뇌척수액 (CSF) 샘플) 또는 인간 조직 샘플(예를 들어, 심장, 근육, 뇌 등의 조직에서 유래됨)이다. 다른 실시양태에서, 인간 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 뇌척수액 샘플이다. 일부 실시양태에서, 인간 생물학적 샘플은 뇌 피질 샘플 또는 해마 샘플과 같은 뇌 샘플이다. 일부 실시양태에서, 병리학적 단백질은 신경퇴행성 질환과 연관된다. 일부 실시양태에서, 풍부화된 생물학적 샘플은 신경퇴행성 질환을 앓는 환자 또는 사망한 환자로부터의 인간 생물학적 샘플에서 유래된다. 일부 실시양태에서, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 다운 증후군, 파킨슨병, 전두측두엽 치매, 근위축성 측삭 경화증, 루이소체를 동반한 치매, 진행성 핵상 마비(PSP), 다계통 위축(MSA), 또는 외상성 뇌 손상, 변연계 우위 연령 관련 TDP-43 뇌병증(LATE), 만성 외상성 뇌병증(CTE)이다. 일부 실시양태에서, 병리학적 단백질은 타우, Abeta, α-시누클레인, 인플라마솜 성분(ASC를 포함하나 이에 제한되지 않음), C9 또는 f72에서 유래된 디펩티드 반복체(DPR) 또는 TDP-43이다. 바람직한 실시양태에서, 병리학적 단백질은 타우, Abeta, α-시누클레인, 또는 TDP-43이다.
일부 실시양태에서, 마이크로어레이는 풍부화된 생물학적 샘플의 분취액을 고체 지지체 상에 반복 패턴으로 분배함으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 분취액은 고체 지지체 상에 분배된다. 일부 실시양태에서, 분취액은 고체 지지체 상의 스폿이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 풍부화된 생물학적 샘플의 분취액을 유리 슬라이드 상에 분배함으로써 마이크로어레이를 제조하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 풍부화된 생물학적 샘플의 분취액은 마이크로어레이 상에서 실질적으로 건조된다. 일부 실시양태에서, 마이크로어레이는 적어도 25, 또는 적어도 50, 또는 적어도 100, 또는 적어도 200, 또는 적어도 300, 또는 적어도 400, 또는 적어도 500개의 스폿, 또는 250 내지 600개의 스폿, 또는 500 내지 600개의 스폿을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스폿은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 스폿, 또는 4 내지 10개의 스폿, 또는 9개의 스폿을 포함하는 패드 프로파일로 그룹화된다. 일부 실시양태에서, 마이크로어레이 고체 지지체는 챔버로 분할되고, 각 챔버는 챔버 내의 스폿의 수로 정의된 패드 프로파일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 별개의 챔버는 상이한 유체 또는 시약이 챔버 사이에서 혼합 없이 각각의 개별 챔버에 첨가될 수 있도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 마이크로어레이는 적어도 2, 또는 적어도 5, 또는 적어도 10, 또는 적어도 15, 또는 적어도 20, 또는 적어도 25, 또는 적어도 30, 또는 적어도 40, 또는 적어도 45, 또는 적어도 50, 또는 적어도 55, 또는 적어도 60, 또는 약 64개의 챔버를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상이한 공지 농도의 시험 리간드가 마이크로어레이의 상이한 분취액, 스폿, 패드 프로파일 또는 챔버에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 분취액을 다중 농도와 접촉시키는 것은 마이크로어레이의 각 챔버를 상이한 농도로 접촉시키는 것을 포함한다. 각 챔버가 여러 개의 분취액 또는 스폿을 포함하는 경우, 이러한 분취액 또는 스폿은 해당 챔버의 시험 조건(예컨대 시험 화합물 또는 시험 농도)에 대한 중복물 역할을 한다.
일부 실시양태에서, 풍부화된 생물학적 샘플로부터 병리학적 단백질의 분취액 분배 또는 스폿팅은 자동 스폿팅 장치(예컨대 Nano-Plotter)와 같은 스폿팅 장치를 사용하거나 수동 피펫팅에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 스폿팅은 Nano-Plotter 2.1TM(GESIM; 독일)을 사용하여 수행된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 배열된 병리학적 단백질을 포함하는 풍부한 생물학적 샘플의 부피는 적어도 300 피코리터, 또는 적어도 1 나노리터, 또는 적어도 10 나노리터, 또는 적어도 36 나노리터이거나, 약 200 피코리터 내지 약 36 나노리터, 또는 약 200 피코리터 내지 약 10 나노리터, 또는 약 200 피코리터 내지 약 1 나노리터 범위의 부피이다.
마이크로어레이는 코팅된 고체 지지체를 포함하고, 고체 지지체는 유리 또는 중합체와 같은 임의의 적합한 고체 물질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 유리 슬라이드이다. 일부 실시양태에서, 마이크로어레이 고체 지지체는 접착제로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 접착제는 실란, 티올, 이황화물, 에폭시드, 및/또는 중합체이다. 일부 실시양태에서, 접착제는 실란이다. 일부 실시양태에서, 접착체는 아미노프로필실란이다. 일부 실시양태에서, 마이크로어레이 고체 지지체는 아미노프로필실란으로 코팅된 유리 슬라이드이다.
리간드, 도구 리간드, 시험 화합물 또는 시험 리간드는 유기 화합물, 항원, 항체, 펩티드, 단백질, 또는 항체에 의해 포획된 단백질이다. 일부 실시양태에서, 리간드, 도구 리간드, 시험 화합물 또는 시험 리간드는 유기 화합물, 예컨대 화학 화합물 또는 소분자 화합물이다. 일부 실시양태에서, 도구 리간드 및 시험 리간드는 둘 다 소분자 화합물이다. 일부 실시양태에서, 도구 리간드 및 시험 화합물은 모두 소분자 화합물이다.
표지된 리간드, 방사성 표지된 리간드, 표지된 도구 리간드, 방사성 표지된 도구 리간드, 표지된 시험 리간드, 표지된 시험 화합물, 방사성 표지된 시험 화합물 또는 방사성 표지된 시험 리간드는 유기 화합물, 항원, 항체, 펩티드, 단백질 또는 리간드, 도구 리간드, 시험 화합물 또는 시험 리간드의 정량화를 가능하게 하는 표지를 포함하는 항체에 의해 포획된 단백질이다. 일부 측면에서, 표지는 병리학적 단백질에 결합된 리간드, 도구 리간드, 시험 화합물, 또는 시험 리간드의 양의 정량화를 허용한다. 표지의 유형은 특별히 제한이 없으며 선택한 검출 방법에 따라 달라질 것이다. 검출가능한 표지가 본 발명의 리간드에 부착되는 위치는 특별히 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 방사성 표지된 시험 리간드는 시험 리간드의 방사성 표지된 버전이다. 일부 실시양태에서, 방사성 표지된 도구 리간드는 공지된 리간드의 방사성 표지된 버전이다. 일부 실시양태에서, 도구 리간드 또는 방사성 표지된 도구 리간드는 관심 있는 병리학적 단백질에 대한 공지 리간드이다. 예시적인 방사성 표지된 도구 리간드는 Abeta([11C]PiB(피츠버그 화합물 B), [18F]플로로베타피르, [18F]플로로베타벤, 또는 [18F]플루테마타몰); 타우([18F]T-807(AV1451이라고도 함), 플로르타우시피르[18F]MK-6240, [18F]RO6958948, [18F]PI-2620, [18F]-GTP-1, [18F]JNJ-067, [18F]PM-PBB3, 또는 [11C]PBB3), THK-5351, THK-5562; 또는 알파-시누클레인([3H]SIL26)을 포함한다. 예시적인 도구 리간드는 이들 예시적인 방사성 표지된 도구 리간드의 비표지 버전을 포함한다.
예시적인 표지는 방사성핵종, 양전자 방출체 또는 감마 방출체와 같은 동위원소 뿐만 아니라 형광성, 발광성 및/또는 발색성 표지를 포함한다. 본원에 사용된 방사성 동위원소 표지는 방사성 동위원소의 자연적 존재비와 동일하지 않은 존재비로 존재한다. 또한, 사용된 양은 선택된 검출 방법으로 검출할 수 있어야 한다. 일부 실시양태에서, 표지는 방사성핵종 표지이다. 방사성핵종으로서 적합한 동위원소의 예는 2H, 3H, 18F, 123I, 124I, 125I, 131I, 11C, 13N, 15O 및 77Br을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방사성핵종 표지는 2H, 3H, 11C, 13N, 15O, 또는 18F이다. 일부 실시양태에서, 방사성핵종 표지는 2H, 3H 및 18F이다. 일부 실시양태에서, 방사성핵종 표지는 3H이다. 본원에 기재된 바와 같은 방사성 표지된 화합물은 일반적으로 상업적으로 입수가능하거나 공지된 합성 기술에 의해 제조되는 적합한 시약의 적절한 동위원소 변형을 사용하여 당업자에게 공지된 통상적인 절차에 의해 제조된다.
도구 리간드, 방사성 표지된 도구 리간드, 시험 리간드, 시험 화합물 및 방사성 표지된 시험 리간드는 또한 차단제, 진단적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 완충액 중 하나 이상과 함께 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 차단제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 차단제는 소 혈청 알부민(BSA), 카제인, 또는 계란 난백(chicken egg white)으로부터의 알부민이다. 일부 실시양태에서, 차단제는 BSA이다. 차단제는 병리학적 단백질 상의 비특이적 결합 부위를 차단하고 배경 신호를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 분취액의 제1 접촉 전에 또는 이와 동시에 풍부화된 생물학적 샘플의 분취액을 차단제로 처리하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분취액을 차단제로 처리하는 것은 분취액을 차단제를 포함하는 분석 완충액으로 처리하는 것을 포함하며, 선택적으로 분석 완충액은 Tris-HCl 또는 인산 완충 식염수(PBS)를 포함한다.
본원에 사용된 "포화 고정 농도"는 특정 단백질에 대한 특이적 결합을 포화시키는 농도를 의미한다.
본원에 사용된, 마이크로어레이 상의 분취액을 "다중 농도"의 리간드 또는 화합물과 접촉시키는 것은 상이한 분취액 또는 분취액 세트를 상이한 농도의 리간드 또는 화합물과 접촉시키는 것을 의미한다. 마이크로어레이 상의 분취액 세트가 주어진 농도로 접촉되는 경우, 해당 세트의 분취액은 시험 농도에 대한 중복물로서 제공된다. 분취액 또는 분취액 세트는 예를 들어 개별 챔버의 마이크로어레이에서 다른 분취액 또는 분취액 세트와 분리될 수 있다. 결합 친화도의 결정을 포함하는 방법의 경우, 일부 실시양태에서, 시험 농도의 적합한 범위는 포화 고정 농도에 비해 적어도 50배 낮다.
시험 리간드의 억제 상수를 결정하는 방법에서, 분취액은 "시험 리간드에 대한 Kd에 근접(Kd의 약 2배 이내를 지칭)한 고정 농도에서" 방사성 표지된 시험 리간드와 접촉된다.
일부 실시양태에서, 결합되지 않은 리간드(예를 들어, 시험 리간드, 시험 화합물 또는 방사성 표지된 리간드)를 제거하는 것은 마이크로어레이를 세척하여 단백질 표적에 결합되지 않은 리간드(비결합 리간드)를 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척은 완충액으로 세척하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충액은 PBS이다.
일부 실시양태에서, 검출은 방사선 표지된 도구 리간드 또는 방사선 표지된 시험 리간드를 포함하는 복합체를 포함하는 마이크로어레이를 필름에 노출시킨 후 필름 상의 신호를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 필름은 포스포스크린 필름(phosphoscreen film)이다. 일부 실시양태에 따른 신호의 정량화는 스캐닝에 의해, 또는 Phosphoimager Typhoon IP와 같은 포토이미저 소프트웨어에 의해 구현된다. ImageJ-win 64 소프트웨어와 같은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 정량화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출은 방사성 표지된 시험 또는 도구 리간드를 포함하는 마이크로어레이를 포스포스크린 필름과 같은 필름에 노출시켜 필름 상에 신호를 생성하고 필름 상에서 신호를 정량화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출은 방사성 표지된 도구 리간드 또는 방사성 표지된 시험 리간드를 포함하는 복합체를 포함하는 마이크로어레이를 차세대 가스 검출기(예컨대 BeaQuant 기기 [ai4R], BetaIMAGER, [Biospace Lab])를 기반으로 하는 실시간 자동방사선촬영 시스템에 노출시킴으로써 방사능 신호(붕괴 횟수)를 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시예에 따른 신호의 정량화는 디지털 이미징에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 이미지는 이미지 분석 소프트웨어(Beamage [ai4R], M3 vision [Biospace Lab])를 사용하여 정량화될 수 있다. 일부 실시예에서, 이미지는 이미지 처리 도구로 내보낼 수 있고 ImageJ-win 64 소프트웨어와 같은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화될 수 있다.
일부 실시양태에서 방법은,
패드 프로파일의 유리 지지체, 예를 들어 아미노프로필실란(APS)으로 코팅된 유리 슬라이드 상에 병리학적 단백질을 스폿팅하는 단계;
스폿팅된 단백질을 비표지된 (저온) 리간드와 접촉시켜 리간드와 단백질 사이에 복합체를 형성하는 단계;
복합체를 표지된 리간드와 접촉시켜 표지된 리간드와 단백질 사이에 표지된 복합체를 형성하는 단계;
완충액, 예를 들어 PBS 완충액으로 표지된 복합체를 세척하는 단계;
예를 들어, 실온에서 또는 아르곤 흐름하에 유리 지지체를 건조하는 단계;
유리 지지체를 필름, 예를 들어 포스포스크린 필름에 노출시키는 단계; 및
단백질에 결합된 표지된 리간드의 노출 후 필름에서 신호를 정량화하는 단계를 함한다.
일부 실시양태에서, 스폿팅된 단백질은 차단제와 접촉된다. 일부 이러한 실시양태에서, 차단제는 저온 리간드를 갖는 분석 완충액 및/또는 표지된 리간드를 갖는 분석 완충액에 존재한다.
일부 실시양태에서, 방법은 단백질에 결합된 표지된 리간드의 노출 후 필름 상의 신호를 정량화하고, 예를 들어, 이미지 소프트웨어 분석을 사용하여 그래프에 값을 플로팅하는 것과 같이 정량화된 값을 그래프에 플롯팅함으로써 결합 친화도(Kd) 값을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 패드 프로파일에 조직화된 유리 지지체, 특히 아미노프로필실란(APS)으로 코팅된 유리 슬라이드 상에 병리학적 단백질을 스폿팅하는 단계; 표지된 리간드를 포함하는 조성물을 스폿팅된 단백질과 접촉시키는 단계; 표지된 리간드가 단백질과 복합체를 형성하도록 하는 단계; 비표지 (저온) 리간드를 포함하는 조성물을 단백질 및 표지 리간드를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계; PBS 완충액과 같은 완충액으로 세척하는 단계; APS-코팅된 유리 슬라이드와 같은 유리 지지체를 선택적으로 실온에서 또는 아르곤 플럭스하에 건조시키는 단계; APS-코팅된 유리 슬라이드와 같은 유리 지지체를 포스포스크린 필름과 같은 필름에 노출시키는 단계; 단백질에 결합된 표지된 리간드의 노출 후 필름 상의 신호를 정량화하는 단계; 및 바람직하게는 정량화된 신호를 그래프에 플롯팅하고, 보다 바람직하게는 이미지 소프트웨어 분석을 사용하여 그래프 상에 정량화된 값을 플롯팅함으로써 억제 상수(Ki)를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 패드 프로파일에 조직화된 유리 지지체, 예컨대 아미노프로필실란(APS)으로 코팅된 유리 슬라이드 상에 병리학적 단백질을 스폿팅하는 단계, 표지된 리간드를 포함하는 조성물을 스폿팅된 병리학적 단백질과 접촉시키고 표지된 리간드가 단백질과 복합체를 형성하도록 하는 단계; 표지되지 않은 리간드를 포함하는 조성물을 단백질 및 표지된 리간드를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계; PBS와 같은 완충액으로 세척하는 단계; 선택적으로 실온에서 또는 아르곤 플럭스하에 유리 지지체를 건조하는 단계; 유리 지지체를 포스포스크린 필름과 같은 필름에 노출시키는 단계; 단백질에 결합된 표지된 리간드를 노출시킨 후 필름 상의 신호를 정량화하는 단계; 및 그래프에 정량화된 신호를 플로팅하거나 이미지 소프트웨어 분석을 사용하여 그래프에 정량화된 값을 플로팅함으로써 억제 능력(억제 상수, Ki)을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 건조 전에 포함된 단계는 적어도 6회, 또는 적어도 8회, 또는 적어도 12회 반복된다. 일부 실시양태에서, 리간드의 양은 단계가 반복될 때마다 증가/감소된다. 일부 실시양태에서, Ki 값은 화합물이 단백질에 대한 표지된 리간드의 결합과 경쟁하는 능력을 갖는지 여부를 평가하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, Ki 값은 그 Ki 값에 따라 시험된 화합물의 순위를 매기는 데 사용된다.
또한, 표적에 결합하는 능력 또는 표지된 리간드가 표적에 결합하는 것과 경쟁하는 능력에 대해 시험 리간드/시험 화합물을 스크리닝 또는 평가하는데 사용하기 위한 키트가 본원에 개시된다. 이러한 키트는 예를 들어 완충액, 검출 가능한 염료, 실험실 장비, 반응 용기, 지침서 등과 같은 본원에 기재된 방법을 수행하기 위한 구성요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 병리학적 단백질 표적에 대한 시험 리간드/시험 화합물의 결합 친화도(Kd)를 결정하기 위한 분석을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 병리학적 단백질 표적에 대한 시험 리간드/시험 화합물에 대한 억제 상수(Ki)를 결정하기 위한 분석을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 시험 리간드/시험 화합물 또는 일련의 시험 리간드/시험 화합물의 평가, 선택 및/또는 스크리닝을 위한 분석을 제공하며, 여기서 분석 결과에 따라 시험 리간드/시험 화합물이 선택되거나 시험 리간드/시험 화합물의 순위가 매겨진다.
풍부화된 생물학적 샘플 중의 병리학적 단백질로 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 도구 리간드를 치환할 수 있는 능력에 대해 시험 화합물을 평가하거나 스크리닝하는 일부 방법에서, 방법은
(a) 분취액을 각각의 다수의 저온 시험 화합물과 단일 농도에서 접촉시키거나,
(b) 분취액을 다수의 저온 시험 화합물과 다중 농도에서 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 각 시험 화합물에 대해 계산된 경쟁 퍼센트 또는 Ki에 따라 다수의 시험 화합물의 순위를 매기는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중 저온 시험 화합물은 적어도 2, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 25, 적어도 50, 또는 적어도 100개의 저온 시험 화합물, 또는 2 내지 100개, 또는 5 내지 100개, 또는 10 내지 100, 또는 25 내지 100, 또는 50 내지 100개의 저온 시험 화합물이다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액으로 스폿팅된 코팅된 표면을 비방사성 표지 리간드와 접촉시키는 것은 코팅된 표면을 방사성 표지된 리간드와 접촉시키기 전, 접촉과 동시에, 또는 접촉 후에 일어날 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 개시내용의 일부 실시양태를 추가로 설명하기 위해 포함되며 본 개시내용의 범위를 제한하는데 사용되어서는 안된다. 실시예는 아래의 실험이 수행된 모든 실험 또는 유일한 실험임을 나타내고자 함이 아니다. 사용된 수치(예컨대 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이며, 압력은 대기압 또는 그 부근이다.
본 개시내용의 측면이 본원에서 예시되고 설명되었지만, 이러한 측면이 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다. 수많은 변형, 변경 및 대체가 이제 본 개시내용을 벗어나지 않고 당업자에게서 일어날 것이다. 본원에 기재된 본 개시내용의 측면에 대한 다양한 대안이 본 개시내용을 실시하는데 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다음 청구범위는 본 개시내용의 범위를 정의하고 이러한 청구범위 및 그 균등물의 범위 내의 방법 및 구조가 이에 의해 포함되도록 의도된다.
실시예 1: 마이크로어레이 제작을 위한 단백질의 제조
a) AD 뇌 유래 병리학적 타우 단백질
외부 출처(Tissue Solutions, 영국)로부터 입수한 한 명의 알츠하이머병(AD) 환자의 사후 뇌에서 AD 뇌 유래 타우 쌍 나선 필라멘트(PHF)를 풍부화시켰다. 풍부화 절차는 [Jicha et al., 1997], 및 [Rostagno and Ghiso, 2009]에서의 것이 수정되었고, [Spillantini et al., 1998]에서의 것이 개조되었으며, 이는 원래 알츠하이머병 뇌로부터 분산된 쌍 나선 및 직선 필라멘트를 추출하기 위해 개발되었던 절차(Greenberg, S. G. et al., 1990; Goedert, et al., 1992)를 적용한 PD 사례의 뇌로부터 분산된 a-syn 필라멘트의 추출을 설명한다. 간략하게, 조직을 유리 Dounce 균질화기에서 조직 균질화 완충액 부피[프로테아제 억제제(Complete; Roche 11697498001)가 보충된 RAB 완충액(100 mM 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 중 0.75 M NaCl, 1 mM EGTA, 0.5 mM MgSO4, 2 mM DTT, pH 6.8)]로 1:4 부피당 중량비로 균질화하였다. 이어, 균질액을 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하여 잔류 미세소관을 해중합시킨 후, 폴리카보네이트 원심분리기 병(16 × 76 mm; Beckman 355603)으로 옮기고, 초원심분리기(Beckman, XL100K)에서 예냉시킨 70.1 로터(Beckman, 342184)를 사용하여 4℃에서 20분 동안 11,000 g으로 원심분리하였다. 펠렛을 얼음 위에 유지하였다. 상청액을 폴리카보네이트 병에 모으고 70.1 Ti 로터에서 4℃에서 1시간 동안 100,000 g(38,000 RPM)으로 다시 원심분리하여 PHF가 풍부한 펠릿을 단리하고 가용성 Tau는 상청액에 남겨졌다. 제1 원심분리 및 제2 원심분리에서 얻은 펠렛을 120 mL의 추출 완충액[10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10% 수크로스, 0.85M NaCl, 1% 프로테아제 억제제(Calbiochem 539131), 1 mM EGTA, 1% 포스파타제 억제제(Sigma P5726 및 P0044)]에 재현탁시켰다. 이어, 용액을 폴리카보네이트 원심분리기 병(16 × 76 mm; Beckman 355603)으로 옮기고 70.1 Ti 로터를 사용하여 초원심분리기(Beckman, XL100K)에서 4℃에서 20분 동안 15,000 g(14,800 RPM)으로 원심분리하였다. 10% 수크로스의 존재 및 저속 원심분리에서 대부분의 PHF는 상청액에 남아 있는 반면 온전하거나 단편화된 NFT 및 더 큰 PHF 침전물/응집체는 펠릿화되었다. 펠릿을 버렸다. 상층액에 20% 사르코실(Sigma L7414-10ML)을 최종 농도 1%로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 이 용액을 70.1 Ti 로터에서 4℃에서 1시간 동안 100,000 g(38,000 RPM)으로 폴리카보네이트 병에서 원심분리하고 PHF가 풍부한 물질을 함유하는 펠릿을 PBS에 PBS 조직 1:0.1 부피당 중량 비율로 재현탁한 후, 분취하여 -80℃에서 보관하였다. 샘플을 웨스턴 블롯에 의해 타우에 대해 분석하였다.
b) PD 뇌 유래 a-syn 단백질
절차는 [Spillantini et al., 1998]에 설명된 프로토콜의 것을 개작하였다. 측두엽 또는 편도체 뇌 영역으로부터의 동결된 조직 블록을 얼음 위에서 해동하고 메스를 사용하여 백질을 제거하였다. 유리 Dounce 균질화기를 사용하여 조직을 1:4 부피당 중량 비율의 조직 대 균질화 완충액으로 균질화하였다. 균질화에 0.75 mM NaCl 및 1x 프로테아제 억제제(Complete; Roche 11697498001)를 포함하는 RAB 완충액(100 mM 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), 1 mM EGTA, 0.5 mM MgSO4, 2 mM DTT, pH 6.8)을 사용하였다. 이어, 균질물을 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하여 잔류 미세소관을 해중합시킨 후, 폴리카보네이트 원심분리기 병(16 × 76 mm; Beckman 355603)으로 옮기고 초원심분리기(Beckman, XL100K)에서 예냉시킨 70.1 로터(Beckman, 342184)를 사용하여 4℃에서 20분 동안 11,000 g (12,700 RPM)으로 원심분리하였다. 펠렛을 얼음 위에 유지하고, 상층액은 폴리카보네이트 병에 모아 70.1 Ti 로터에서 4℃에서 1시간 동안 100,000 g(38,000 RPM)으로 다시 원심분리하여 가용성 a-syn으로부터 a-syn 침착물/응집체를 분리하였다. 제1 원심분리 및 제2 원심분리로부터의 펠릿을 1:10(부피당 중량, w/v) 비율로 추출 완충액[10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10% 수크로스, 0.85 mM NaCl, 1% 프로테아제 억제제(Calbiochem 539131), 1 mM EGTA, 1% 포스파타제 억제제(Sigma P5726 및 P0044)]에 재현탁하였다. 이어, 용액을 폴리카보네이트 원심분리기 병(16 × 76 mm; Beckman 355603)으로 옮기고, 4℃에서 20분 동안 15,000 × g(14,800 RPM, 70.1 Ti 로터)으로 원심분리하였다. 펠렛을 버리고 사르코실(20% 스톡 용액, Sigma L7414)을 상청액에 최종 농도 1%로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 이 용액을 폴리카보네이트 병으로 옮기고 4℃에서 1시간 동안 100,000 g(38,000 RPM, 70.1Ti 로터)에서 원심분리하였다. 풍부화된 a-syn 침착물/응집체를 함유하는 펠렛을 PBS에 1:0.1 부피당 중량의 조직 비율로 재현탁시키고 분취하여 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 이 절차로 얻은 최종 분획을 a-syn에 대한 항체를 사용하여 생화학적으로(예컨대 AlphaLISA, 웨스턴 블럿 및 도트 블럿) 분석하여 a-syn 침착물/응집체의 농축을 확인하였다.
c) 전두측두엽 치매(FTD) 뇌 유래 TDP-43 단백질
TDP-43 병리 인간 뇌로부터의 뇌 조직(피질) 섹션을 P2 lab에서 메스로 절개하고 조직을 페트리 접시에서 칭량하였다. 조직을 핀셋으로 2 ml 균질화 튜브(CKmix)로 옮겼다. 프로테아제 억제제를 함유하는 균질화 완충액을 절개 조직에 1:4(w/v) 비율로 첨가하여 20% 뇌 균질물을 생성하였다. 현탁액을 다음 프로그램을 사용하여 precellys로 4℃에서 균질화하였다: 5000 rpm에서 3x 30초, 일시 중지 - 각 주기 사이에 15초. 균질화된 조직을 모아서 5 ml Eppendorf 튜브에 재현탁하였다. 균질화된 뇌 분취액 600 ㎕를 준비하여 드라이아이스에서 동결하고 -80℃에서 보관하였다. 1.5 mL 단백질 저결합 튜브(Eppendorf)에서 가용화를 수행하였다.
뇌 균질액을 얼음 위에서 해동하고 HS 완충액에서 2% 사르코실, 1 유닛/μL 벤조나제 및 1 mM MgCl2의 최종 농도로 재현탁하고 열혼합기에서 37℃에서 600 rpm의 일정한 진탕하에 45분 동안 인큐베이션하였다. 상층액을 새 튜브에 수집하였다. 펠릿을 1000 ㎕ 미엘린 부유 완충액에 재현탁하고 벤치탑 원심분리기에서 4℃에서 60분 동안 20,000 g으로 원심분리하였다. 모든 부유 지질을 제거하기 위해 상층액을 1000 ㎕ 팁으로 조심스럽게 제거하였다. 단일 원심분리 단계에서 지질을 제거할 수 없는 경우, 재현탁, 원심분리 및 상층액 제거를 반복하였다. 생성된 펠렛을 PBS로 세척하고, 벤치탑 원심분리기에서 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 그런 다음, 펠렛을 200 ㎕ PBS에 재현탁하였다. 농축된 모든 물질을 모아서 -80℃에서 동결하였다.
샘플을 웨스턴 블롯(인산화 TDP-43, TDP-43, 히스톤 H3, Aβ)으로 분석하였다.
실시예 2: 병리학적 단백질용 마이크로어레이의 제조
a) 방법 1 - 자동 스폿팅
단백질 샘플을 PBS 또는 분석 완충액(0.9% NaCl, 0.1% BSA 중 50 mM Tris-HCl pH 7.5)에서 1:3(V/V)으로 희석하고, eppendorf 1.5 ml 튜브에 P200(Eppendorf)으로 피펫팅하여 균질화하였다. 이어, 자동 스폿팅 장치인 비접촉 압전 프린터 Nano-Plotter 2.1(GeSiM; 독일)을 사용하여 아미노프로필실란(APS)으로 코팅된 64-패드 마이크로어레이 유리 슬라이드(Lucerna-Chem, #63475)에 샘플이 자동 스폿팅되도록 준비하였다. 자동 스폿팅 장치는 전기 펄스로 소량의 액체(피코리터 내지 나노리터)를 분배할 수 있는 다목적 비접촉 어레이 프린터이다.
APS 유리 슬라이드(도 1A)를 자동 트레일에 수동으로 배치하고, 챔버로 각 유리 슬라이드가 장착될 때 슬라이드 사이의 스폿팅 및 액적의 우수한 위치화의 높은 재현성을 보장하기 위해 정확히 고정되었는지 확인하였다. 압전 팁을 사용하여 로딩 플레이트로부터 적절한 부피를 피펫팅하였다. 시스템을 패드당 9개의 스폿과 각 슬라이드에 총 64개의 패드로, 스폿당 12 × 3 nL 액적이 분배될 수 있도록 최적화하였다(도 1B). 샘플의 스폿팅을 65% 상대 습도의 습도 조절 대기에서 수행하였다. 분배 전체에 걸쳐 샘플의 부피와 밀도가 일정하도록 보장하기 위해 스폿팅 전에 분배된 액적의 균질화 품질을 평가하였다. 이를 위해, 각 액적을 팁에서 분주되는 대로 측정하고 특정 전압에서 액적의 분산을 측정하였다. 슬라이드가 스폿팅되면, Proplate 다중웰 챔버 64 웰(25 × 75 mm 유리 현미경 유리)로 챔버를 조립하고 유리 슬라이드의 양쪽에 스테인리스 스틸로 만들어진 2개의 ProPlate® Clips를 사용하여 구획 수밀성을 확보하였다. 시스템에는 64개의 독립적인 웰이 있다. 샘플을 가습 챔버에서 15분 동안 건조되도록 두었다가 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.
b) 방법 2 - 수동 스폿팅
마이크로피펫 p2(Eppendorf)를 사용하여 챔버 장착된 유리 슬라이드에 1 μL를 피펫팅하여 단백질 샘플을 수동으로 스폿팅하였다(도 1C 및 1D). 각 위치에 한 방울만이 피펫팅되었고 한 방울은 유리 슬라이드의 한 스폿에 해당한다. 생성된 유리 슬라이드를 실온에서 통상적인 실험실 후드하에 적어도 2시간 동안 건조시켰다.
실시예 3: 저온 샘플의 제조
저온 화합물(시험 리간드 또는 시험 화합물)을 100% DMSO 중 2.5 또는 10 mM의 스톡 용액으로서 재현탁시켰다. 2 내지 3의 희석 배수로 일련의 12 연속 희석 시리즈 포인트로 수행하여 저온 화합물의 희석물을 얻었다. 결합 분석 반응 부피에서 1%에서 2.5%의 최종 DMSO 농도의 일정한 농도를 보장하기 위해 100% DMSO에서 희석을 수행하였다. 사용된 저온 화합물의 최대 농도는 표적에 따라 2 또는 3 μM이었고 이 조건은 신호의 최대 치환을 결정하는 데에도 사용되었다.
실시예 4: 표지된 샘플의 제조
표지된 화합물(방사성 표지된 시험 리간드 또는 방사성 표지된 도구 리간드; 1 mCi/mL)을 합성하고, 100% 에탄올에 용해시켰다. 표지된 화합물을, Kd를 결정하기 위한 실험에서 일련의 농도의 적절한 농도로, 또는 치환 효능을 평가하기 위해 사용된 실험에서 일정한 고정 농도로 분석 완충액에서 희석하였다.
실시예 5: 마이크로 방사성 결합 분석에 의한 타우 결합 친화도(K d )의 결정
스폿팅된 병리학적 타우 단백질 샘플이 있는 챔버를 장착하고, 2 μM의 저온 시험 리간드를 함유하는 분석 완충액(50 mM Tris pH: 7.5, 138 mM NaCl, 0.1% BSA)을 채웠다. 챔버를 실온에서 120분 동안 인큐베이션하였다. 증발을 방지하기 위해 밀봉 필름을 사용하였다. 다양한 농도의 분석 완충액 중 동일한 부피의 삼중수소화 시험 리간드를 각 챔버에 가하여 잘 혼합하고, 실온에서 인큐베이션하였다. 최종 반응 부피는 40 μL였다. 60분 동안 인큐베이션한 후, 방사성 물질을 포함하는 반응 용액을 적절한 용기에 수집하였다. 챔버를 빙냉 세척 완충액으로 5회 세척하였다. ProPlate® 챔버를 유리 슬라이드에서 분해하고, 유리 슬라이드를 이중 증류된 H2O로 세척하였다. 유리 슬라이드를 화학 후드 아래 아르곤 플럭스하에서 건조시켰다. 필름을 Hypercassette(Amersham, RPN 11643)의 BAS-IP TR 2025 후지필름에 최소 3일 동안 노출시켰다. 필름을 50 μm의 해상도와 4000의 감도를 가진 Phosphoimager Typhoon IP로 스캔하였다. 이어, ImageJ-win 64 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하고 정량화하였다. GraphPad Prism 7.03을 사용하여 그래프를 생성하였다. 타우 침착물/응집체를 포함하는 도구 리간드에 대해 우수한 적합도로 7.9 nM의 Kd가 결정되었다(도 2B).
실시예 6: 마이크로 방사성 결합 분석과 필터 기반 방사선 결합 분석의 비교
기존 필터 기반 분석과 위에서 설명한 마이크로 방사성 결합 분석을 사용한 Kd 측정의 직접적인 비교를 수행하여 방법 간 차이를 평가하였다. 필터 기반 분석을 수행하기 위해, AD 뇌 유래 타우를 1/80으로 희석하고, 2 μM의 일정(고정) 농도의 저온 시험 리간드의 존재 또는 부재하에 1 내지 50 nM 범위 농도의 삼중수소화 시험 리간드(알려진 타우 결합제)와 25℃에서 120분 동안 인큐베이션하였다. 각 샘플의 부피 35 μL를 GF/C 필터 플레이트(PerkinElmer 6005174)에서 진공 여과하여 시험 리간드가 결합된 AD 뇌 유래 타우를 포획하고, GF/C 필터를 Tris 50 mM 완충액 pH 7-5로 3회 세척하였다. 이어, GF/C 필터를 진공 건조시키고, 50 μL 신틸레이션 액체(Ultimate Gold MB, PerkinElmer)를 각 웰에 첨가한 후, 필터를 Microbeta2 장치에서 분석하였다. 과량의 저온 시험 리간드(2 μM)를 함유하는 샘플로 비특이적 신호를 결정하고, 총 신호에서 비특이적 신호를 빼 특이적 결합을 계산하였다. 모든 측정은 최소 2회의 기술 중복으로 수행하였다. Kd 값을 Prism V7(GraphPad)을 사용하여 한 부위 특이적 결합에 대해 비선형 회귀에 의해 계산하여 11.8 nM의 Kd를 제공하였다(도 2A). 동일한 시험 리간드를 사용하였을 때, 두 가지 방법(11.8 nM(도 2A) 대 7.9 nM(도 2B, 실시예에 설명됨))을 사용하여 독립적인 AD 뇌 유래 Tau 침착물/응집체에 대해 매우 유사한 결합 친화도 값이 얻어진 것으로 나타났다. 결과는 마이크로 방사성 결합 분석 방법이 기존 필터 기반 방사성 결합 분석에 대한 강력한 대안임을 입증한다.
실시예 7: 마이크로 방사성 결합 분석을 사용한 a-syn 및 TDP-43에 대한 K d 의 결정
단백질 표적 a-syn(화합물 2 및 3의 경우) 및 TDP-43(화합물 3의 경우)에 대한 시험 리간드(화합물 2(PCT 출원 번호 WO2019234243 참조) 및 화합물 3)의 결합 상수(Kd)를 결정하기 위해 실시예 5에 기재된 방법을 또한 사용하였다. FTD 뇌로부터 단리된 TDP-43 풍부화 분획 또는 PD 뇌로부터 단리된 a-syn 풍부화 분획을 2 μM의 일정한 양의 저온 화합물 3의 존재 또는 부재하에 방사성 표지된 [3H] 화합물 3의 농도를 증가시키면서(각각 1에서 300 nM 또는 1에서 30 nM) 인큐베이션하였다. 유사하게, PD 뇌로부터 단리된 a-syn-풍부화 분획을 2 μM의 일정한 양의 저온 화합물 2의 존재 또는 부재하에 방사성 표지된 [3H] 화합물 2의 농도를 증가시키면서(1에서 30 nM) 인큐베이션하였다. 일정한 과량 농도의 저온 화합물 2(2 μM) 또는 저온 화합물 3(2 μM)을 사용하여 비특이적 결합을 결정하였다. 화합물 3의 경우 a-syn 및 TDP-43 단백질에 대해 각각 10.8(도 3A) 및 138 nM(도 3C)의 Kd 값이 결정되었고, 화합물 2의 경우는 a-syn에 대해 7.8 nM의 Kd 값이 결정되었다(도 3B). 결과는 기술된 마이크로 방사성 결합 분석에 의해 생물학적 조직에 낮거나 상대적으로 낮은 존재비로 존재하는 것으로 알려진 여러 표적 단백질에 대해 Kd 값이 결정될 수 있음을 보여준다. 예를 들어, 병리학적 a-syn 및 병리학적 TDP-43은 질환에 걸린 인간의 뇌에서 병리학적 타우보다 덜 풍부하게 존재하는 것으로 간주된다.
실시예 8: 시험 리간드 억제 상수(Ki)를 결정하기 위한 마이크로 방사성 결합 분석의 사용
마이크로 방사성 결합 분석을 사용하여 AD-뇌 유래 타우 침착물/응집체 및 PD 뇌-유래 a-syn 침착물/응집체에 대한 시험 리간드의 억제 상수(Ki)를 결정하였다. 실시예 1(단계 a 및 b) 및 2(a)에 기재된 바와 같이 단백질을 제조하고 코팅된 유리 슬라이드에 스폿팅하였다.
3 nM의 삼중수소화된 시험 리간드(알려진 타우 결합제)를 10 pM 내지 3 μM의 농도에서 스폿팅된 타우 침전물/응집체 및 저온 시험 리간드와 함께 인큐베이션하였다(도 4A). 최대 신호(100% 결합)는 저온 도구 리간드의 부재하에 얻어진 반면 최대 치환은 3 μM의 저온 도구 리간드의 존재하에 얻어졌다. Prism V7(GraphPad)을 사용하여 One site - Fit Ki에 의해 Ki 값을 계산하였다. 시험 리간드에 대한 Ki 값은 1 nM에서 R2 = 0.97의 우수한 적합도로 측정되었다.
저온 화합물 3을 40 nM[3H] 화합물 3과 함께 50 pM 내지 2 μM(또는 10 nM 내지 3 μM)의 농도 범위에서 스폿팅된 a-syn 침전물/응집체와 함께 인큐베이션하였다. 최대 신호(100% 결합)는 저온 화합물 3의 부재하에 얻어진 반면 최대 치환은 2 μM의 화합물 3의 존재하에 얻어졌다. 화합물 3에 대한 Ki 값은 41 nM에서 우수한 적합도로 측정되었다(도 4B).
이들 결과는 화합물의 자가 치환 능력(계산된 Ki에 의해 결정됨)이 기술된 마이크로 방사성 결합 분석에 의해 생물학적 조직에 낮거나 상대적으로 낮은 존재비로 존재하는 것으로 알려진 여러 단백질 표적에 대해 결정될 수 있음을 입증한다.
실시예 9: 라이브러리 화합물의 활성 등급을 매기기 위한 마이크로 방사성 결합 분석
시험 화합물을 PD 환자 뇌 유래 a-syn 침착물/응집체에 대한 [3H] 화합물 3(방사성 표지된 도구 리간드)의 결합과 경쟁하는 효능에 대해 스크리닝하였다. 시험 화합물 치환을 스크리닝 형식으로 평가하여 방사성 표지된 도구 리간드를 치환시키는 능력에 기초하여 시험 화합물의 순위를 매길 수 있었다(계산된 Ki 값에 기초한 순위 매김). 단백질 샘플의 제조 및 스폿팅은 상기 실시예 1(b) 및 2(a)에 기재된 바와 같이 수행하였다.
시험 화합물을 2개의 독립적인 실험에서 중복으로 시험하고, 평균값 ± SEM을 도 5A-5C에 나타내었다. 시험 화합물을 방사성 표지된 도구 리간드로서 40 nM의 [3H] 화합물 3을 사용하여 50 pM 내지 2 μM 범위의 농도에서 스크리닝하였다. 화합물 4(도 5A, Ki 13 nM, 강한 결합제), 화합물 5(도 5B, Ki 37 nM, 중간 결합제) 및 화합물 6(도 5C, Ki 147 nM, 약한 결합제)에 대한 대표적인 경쟁 곡선이 제시되었다. 종합하면, 이들 결과는 기술된 마이크로 방사성 결합 분석이 예를 들어 가장 약한 결합제에서 가장 강한 결합제까지, 계산된 Ki 값에 따라 스크리닝된 시험 화합물의 순위를 매길 수 있는 스크리닝 형식에서 시험 화합물의 치환 능력(Ki)을 측정하는 데 사용할 수 있음을 보여준다. 더 낮은 Ki 값을 나타내는 시험 화합물이 더 강한 결합제로 간주되며, 시험된 단백질 표적에 대한 잠재적 히트 화합물을 나타낼 수 있다. 또한, 방사성 표지된 도구 리간드를 치환할 수 있는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 방사성 표지된 도구 리간드의 단백질 결합 부위와 중첩되는 부위에서 단백질 표적에 결합함을 보여준다.
본 개시내용의 측면이 본원에서 예시되고 설명되었지만, 이러한 측면은 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다. 수많은 변형, 변경 및 대체가 이제 본 개시내용을 벗어나지 않고 당업자에게서 일어날 것이다. 본원에 기재된 본 개시내용의 측면에 대한 다양한 대안이 본 개시내용을 실시하는데 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다음 청구범위는 본 개시내용의 범위를 정의하고 이러한 청구범위 및 그 균등물의 범위 내의 방법 및 구조가 이에 의해 포함되도록 의도된다.
참고문헌
Figure pct00001

Claims (29)

  1. 풍부화된(enriched) 생물학적 샘플에서 병리학적 단백질에 대한 시험 리간드(test ligand)의 결합 친화도(binding affinity; Kd)를 결정하는 방법으로서,
    마이크로어레이(microarray) 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액(aliquot)을 저온(cold) 시험 리간드와 포화 고정 농도(saturating fixed concentration)에서 접촉시키는 단계;
    분취액을 방사성 표지된(radiolabeled) 시험 리간드와 다중 농도에서 접촉시켜 방사성 표지된 시험 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
    분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 시험 리간드를 제거하는 단계;
    각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 시험 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
    각 분취액에서 검출된 신호로부터 Kd를 계산하는 단계를 포함하는,
    방법.
  2. 풍부화된 생물학적 샘플에서 병리학적 단백질에 대한 시험 리간드의 결합 친화도(Kd)를 결정하는 방법으로서,
    마이크로어레이 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액을 방사성 표지된 시험 리간드와 다중 농도에서 접촉시켜 방사성 표지된 시험 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
    분취액을 저온 시험 리간드와 포화 고정 농도에서 접촉시키는 단계;
    분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 시험 리간드를 제거하는 단계;
    각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 시험 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
    각 분취액에서 검출된 신호로부터 Kd를 계산하는 단계를 포함하는,
    방법.
  3. 풍부화된 생물학적 샘플에서 병리학적 단백질에 대한 시험 리간드의 결합 친화도(Kd)를 결정하는 방법으로서,
    마이크로어레이 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액을 다중 농도에서의 방사성 표지된 시험 리간드 및 포화 고정 농도에서의 저온 시험 리간드와 접촉시켜 방사성 표지된 시험 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
    분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 시험 리간드를 제거하는 단계;
    각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 시험 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
    각 분취액에서 검출된 신호로부터 Kd를 계산하는 단계를 포함하는,
    방법.
  4. 풍부화된 생물학적 샘플에서 병리학적 단백질에 대한 시험 리간드의 억제 상수(Ki)를 결정하는 방법으로서,
    마이크로어레이 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액을 방사성 표지된 시험 리간드와 시험 화합물에 대한 Kd에 근접한 고정 농도에서 접촉시켜 방사성 표지된 시험 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
    분취액을 저온 시험 리간드와 다중 농도에서 접촉시키는 단계;
    분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 시험 리간드를 제거하는 단계;
    각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 시험 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
    각 분취액에서 검출된 신호로부터 Ki를 계산하는 단계를 포함하는,
    방법.
  5. 풍부화된 생물학적 샘플에서 병리학적 단백질에 대한 시험 리간드의 억제 상수(Ki)를 결정하는 방법으로서,
    마이크로어레이 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액을 저온 시험 리간드와 다중 농도에서 접촉시키는 단계;
    분취액을 방사성 표지된 시험 리간드와 시험 리간드에 대한 Kd에 근접한 고정 농도에서 접촉시켜 방사성 표지된 시험 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
    분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 시험 리간드를 제거하는 단계;
    각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 시험 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
    각 분취액에서 검출된 신호로부터 Ki를 계산하는 단계를 포함하는,
    방법.
  6. 풍부화된 생물학적 샘플에서 병리학적 단백질에 대한 시험 리간드의 억제 상수(Ki)를 결정하는 방법으로서,
    마이크로어레이 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액을 시험 리간드에 대한 Kd에 근접한 고정 농도에서의 방사성 표지된 시험 리간드 및 다중 농도에서의 저온 시험 리간드와 접촉시켜 방사성 표지된 시험 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
    분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 시험 리간드를 제거하는 단계;
    각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 시험 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
    각 분취액에서 검출된 신호로부터 Ki를 계산하는 단계를 포함하는,
    방법.
  7. 풍부화된 생물학적 샘플 중의 병리학적 단백질로 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 도구 리간드(radiolabeled tool ligand)를 치환할 수 있는 능력에 대해 시험 화합물을 평가하는 방법으로서,
    마이크로어레이 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액을 방사성 표지된 도구 리간드와 이러한 도구 리간드의 Kd에 근접한 고정된 농도에서 접촉시켜 방사성 표지된 도구 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
    분취액을 저온 시험 화합물과 단일 농도 또는 다중 농도에서 접촉시키는 단계;
    분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 도구 리간드를 제거하는 단계;
    각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 도구 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
    (a) 저온 시험 화합물이 단일 농도에서 접촉되는 경우, 각 분취액에서 검출된 신호로부터 저온 시험 화합물에 대한 경쟁 퍼센트; 또는 (b) 저온 시험 화합물이 다중 농도에서 접촉되는 경우, 각 분취액에서 검출된 신호로부터 저온 시험 화합물에 대한 Ki를 계산하는 단계를 포함하는,
    방법.
  8. 풍부화된 생물학적 샘플 중의 병리학적 단백질로 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 도구 리간드를 치환할 수 있는 능력에 대해 시험 화합물을 평가하는 방법으로서,
    마이크로어레이 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액을 저온 시험 화합물과 단일 농도 또는 다중 농도에서 접촉시키는 단계;
    분취액을 방사성 표지된 도구 리간드와 이러한 도구 리간드의 Kd에 근접한 고정 농도에서 접촉시켜 방사성 표지된 도구 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
    분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 도구 리간드를 제거하는 단계;
    각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 도구 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
    (a) 저온 시험 화합물이 단일 농도에서 접촉되는 경우, 각 분취액에서 검출된 신호로부터 저온 시험 화합물에 대한 경쟁 퍼센트; 또는 (b) 저온 시험 화합물이 다중 농도에서 접촉되는 경우, 각 분취액에서 검출된 신호로부터 저온 시험 화합물에 대한 Ki를 계산하는 단계를 포함하는,
    방법.
  9. 풍부화된 생물학적 샘플 중의 병리학적 단백질로 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 도구 리간드를 치환할 수 있는 능력에 대해 시험 화합물을 평가하는 방법으로서,
    마이크로어레이 상의 풍부화된 생물학적 샘플의 다수의 분취액을 단일 농도 또는 다중 농도에서의 저온 시험 화합물 및 도구 리간드의 Kd에 근접한 고정 농도에서의 방사성 표지된 도구 리간드와 접촉시켜 방사성 표지된 도구 리간드와 각 분취액 중의 병리학적 단백질 간에 방사성 표지된 복합체를 형성하는 단계;
    분취액으로부터 결합되지 않은 방사성 표지된 도구 리간드를 제거하는 단계;
    각 분취액에서 방사성 표지된 복합체 중의 방사성 표지된 도구 리간드로부터 신호를 검출하는 단계; 및
    (a) 저온 시험 화합물이 단일 농도에서 접촉되는 경우, 각 분취액에서 검출된 신호로부터 저온 시험 화합물에 대한 경쟁 퍼센트; 또는 (b) 저온 시험 화합물이 다중 농도에서 접촉되는 경우, 각 분취액에서 검출된 신호로부터 저온 시험 화합물에 대한 Ki를 계산하는 단계를 포함하는,
    방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 분취액을 각각의 다수의 저온 시험 화합물과 단일 농도에서 접촉시키거나,
    (b) 분취액을 다수의 저온 시험 화합물과 다중 농도에서 접촉시키는 단계를 포함하는,
    방법.
  11. 제10항에 있어서, 각각의 시험 화합물에 대해 계산된 경쟁 퍼센트 또는 Ki에 따라 다중 시험 화합물의 순위를 매기는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 풍부화된 생물학적 샘플의 분취액을 차단제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 분취액은 방사성 표지된 도구 리간드, 저온 도구 리간드 및/또는 저온 시험 화합물 이전에 또는 이와 동시에 차단제와 접촉되는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 차단제는 방사성 표지된 도구 리간드, 저온 도구 리간드, 또는 저온 시험 화합물을 또한 포함하는 하나 이상의 분석 완충액에 존재하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 분석 완충액은 Tris-HCl 또는 인산 완충 식염수(PBS)를 포함하는, 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 차단제는 BSA, 카제인, 또는 계란 난백(chicken egg white)으로부터의 알부민인, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 병리학적 단백질은 Abeta, 타우(Tau), α-시누클레인 및 TDP-43으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 풍부화된 생물학적 샘플의 각 분취액은 약 3.5 내지 약 6.5 mg/mL의 총 단백질을 포함하는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 각 분취액은 스폿(spot)인, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로어레이는 적어도 5개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 45개, 또는 적어도 50개, 또는 적어도 55개, 또는 적어도 60개, 또는 약 64개의 챔버(chamber)를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 각 챔버는 풍부화된 생물학적 샘플의 적어도 1개의 분취액, 또는 적어도 6개의 분취액, 또는 적어도 9개의 분취액, 또는 9개의 분취액을 포함하는, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 분취액을 다중 농도와 접촉시키는 단계는 마이크로어레이에서의 각 챔버를 상이한 농도로 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 검출은 마이크로어레이를 필름에 노출시킨 후 필름 상의 신호를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 필름은 포스포스크린 필름(phosphoscreen film)인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로어레이는 유리 슬라이드(glass slide)인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 유리 슬라이드는 아미노프로필실란으로 코팅된 유리 슬라이드인 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 풍부화된 생물학적 샘플의 분취액을 유리 슬라이드 상에 분배함으로써 마이크로어레이를 제조하는 단계를 포함하는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성 표지된 시험 리간드 또는 저온 시험 리간드 또는 화합물과 접촉시키기 전에 마이크로어레이 상의 다수의 분취액을 건조시키는 단계를 포함하는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 신호를 검출하기 전에 건조하는 단계를 포함하는 방법.
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