CN114457153A - 一种孤独症血清神经元来源外泌体标志物chrm1的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种孤独症血清神经元来源外泌体标志物CHRM1的应用，属于生物医药技术领域，通过人类全转录组芯片联合qRT‑PCR个例验证对混合血清和个例血清样本分别检测和验证了在ASD血清NDEs中高表达的CHRM1，此mRNA可以作为孤独症诊断的血清NDEs标记物，本发明填补了ASD生化诊断的空白。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种孤独症血清神经元来源外泌体标志物CHRM1的应用。
背景技术
孤独症谱系障碍(Autistic spectrum disorder,ASD)是一类发病于儿童早期，以社会交往障碍和局限的重复行为为主要特征的广泛的神经精神障碍性疾病。该类疾病严重影响患儿社会功能，是导致学龄前儿童精神残疾的最主要疾病之一，给患者、家庭和社会造成极大精神和社会负担。
目前，孤独症诊断的主要依据是《孤独症诊断访谈(修订版)》和《孤独症诊断观察程序表》，以及必要的心理评估、躯体和神经系统检测，还有一些必要的辅助检测。但这种诊断方式有一定的缺陷性：首先，需要临床医师能够准确掌握客观的病史，充分了解患儿的精神心理发展情况，否则容易和其他精神疾病相混淆；其次，测验耗时长，从初诊到最终确诊需要一年时间；最后，问卷调研对于小于3岁的儿童，存在困难。因此，急需一种在上述病史基础上能够辅助诊断孤独症的客观指标。
外泌体(exosome)是细胞分泌囊泡的一种亚型，由真核细胞分泌，直径约30-150nm，有典型的“杯盘”形态。外泌体广泛存在于血液、唾液、脑脊液、乳汁等体液和细胞间隙中，携带蛋白质、脂类、糖链、信使核糖核酸(mRNA)和非编码核糖核酸(ncRNA)等多种信号分子，一定程度反映了母体细胞的组成。血清中神经元来源外泌体(neuron-derivedeosomes,NDEs)在不同条件下都非常稳定，可以保护“生物货物”免于在细胞外环境中被降解和变性；它可以提供比生物体液本身更可靠的神经疾病生物标志物，比纯净的脑脊液、血液或尿液更准确；最重要的，它可以穿过血脑屏障，具有低免疫源性的特点，这些都为它成为神经系统疾病生物标志物及其治疗的“药物”递送载体奠定了理论基础。
血清NDEs因表面带有神经元标记分子可被特异捕获，所携带信息既可能作为ASD可量化生物学指标，又可能通过追溯其在神经元的功能进一步验证标志物对ASD诊断的重要价值。因此，通过一定检测手段寻找ASD血清NDEs差异表达mRNA对ASD具有重要的诊断和治疗意义，本领域迫切需要开发可用于检测或判断ASD的血清特异标志物。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种孤独症血清神经元来源外泌体标志物毒蕈碱乙酰胆碱受体M1(CHRM1)的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了神经元来源外泌体标志物CHRM1作为孤独症血清诊断标记物的应用。
优选地，所述神经元来源外泌体标志物CHRM1的mRNA在孤独症血清中显著高表达。
进一步优选地，所述神经元来源外泌体标志物CHRM1的mRNA在ASD患者中的表达相较于TD儿童上调1.65倍。
进一步优选地，通过qRT-PCR、测序和探针杂交技术对血清中神经元来源外泌体CHRM1表达进行检测。
本发明还公开了用于检测神经元来源外泌体标志物CHRM1的试剂在制备用于孤独症血清诊断剂或诊断试剂盒中的应用。
优选地，所述神经元来源外泌体标志物CHRM1的mRNA在孤独症血清中显著高表达。
进一步优选地，所述神经元来源外泌体标志物CHRM1的mRNA在ASD患者中的表达相较于TD儿童上调1.65倍。
进一步优选地，通过qRT-PCR、测序和探针杂交技术对血清中神经元来源外泌体CHRM1表达进行检测。
本发明还公开了一种孤独症血清诊断试剂盒，包括用于检测待测孤独症的血清样品中神经元来源外泌体标志物CHRM1的试剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了孤独症血清神经元来源外泌体标志物CHRM1的应用，通过人类全转录组芯片联合qRT-PCR个例验证对混合血清和个例血清样本分别检测和验证了在ASD血清NDEs中高表达的OSTC，此mRNA可以作为孤独症诊断的血清NDEs标记物，本发明有效填补了ASD生化诊断的空白。
本发明应用人全转录组芯片筛选出ASD vs.TD差异表达CHRM1 mRNA。利用qRT-PCR在ASD和TD儿童血清NDEs中对CHRM1进行个例验证，结果显示CHRM1在ASD人群中显著高表达(p＝0.0057)。ROC曲线分析显示CHRM1的AUC值为0.78，最佳界值对应特异性为72.3％，灵敏性为82.6％，具ASD诊断价值。基于以上分析，血清NDEs CHRM1可以作为ASD血清标记物在临床诊断中予以应用。
附图说明
图1为ASD和TD儿童血清NDEs转录组分析流程图；
图2a为ASD和TD组NDEs粒径分析；
图2b为ASD和TD组NDEs电子透射显微镜图像；
图2c为Western blot检测血清外泌体标记分子；
图3为ASD-1～5和TD-1～3血清NDEs中RNA表达归一化；
图4为ASD-1～5和TD-1～3血清NDEs的相关性分析；
图5为ASD血清NDEs中差异表达mRNA；
图6为qRT-PCR的个例样本验证；
图7为ROC曲线分析CHRM1在ASD的诊断价值。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
1、血清样本的采集和分组
ASD患儿100名，年龄匹配TD儿童60名，年龄介于2.5到6岁之间。ASD患儿主要来自西安交通大学附属西安市儿童医院及西北妇女儿童医院。健康对照组人群来自同地区以减少环境差异。两周内有感染或疾病个体样本不予采用。被采集者晨起空腹采血，用真空采血管(黄帽、有隔离胶)采集全血5mL，室温静置30min；室温离心5min(3000×g)，将上层血清分装成100μL/管，立即保存于﹣80℃，避免反复冻融。将ASD和TD血清样本按组每20例等量(每例25μL)混合，分为ASD-1～5和TD-1～3共八个混合样，用于全转录组芯片检测。其余样本单独保存，用于个例验证。
2、血清NDEs的分离
取0.5mL血清样本，加入0.5mL含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，无钙和镁的DBS-2缓冲液混匀，1500×g离心20min，4℃。取上清液，加252μL ExoQuick试剂(EXOQ；System Biosciences,Inc.,Mountainview,CA)4℃下孵育1h。1500×g离心30min，4℃，充分去除上清液，保留沉淀即为外泌体微粒。沉淀中加入150μL DBS-2缓冲液重悬。重悬液中加入100μL 3％BSA(按1:3.33将10％BSA稀释于DBS-2)，再加入2μL生物素标记小鼠抗人L1CAM抗体(clone 5G3,eBioscience,San Diego,CA)，4℃冰箱放置1h。加25μL链霉亲和素连接琼脂糖树脂(Thermo Scientific,Inc.)，再加入50μL 3％BSA，4℃下放置30min。200×g离心10min，4℃，充分去除上清液，保留沉淀即为NDEs。沉淀加入50μL 0.05M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH 3.0)，涡旋10s，重新悬浮NDEs微粒，直接使用或液氮冻存。ASD和TD儿童血清NDEs的分离和转录组分析流程图参见图1。
3、血清NDEs的鉴定
(1)透射电镜观察：将NDEs混合液取出5μL稀释至10μL。吸取样品滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。磷钨酸10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。常温干燥数分钟。80kv进行电镜检测成像，获得透射电镜成像结果。
(2)粒径分析：将NDEs混合液取出5μL稀释到30μL。先用标准品进行仪器性能测试合格后进行外泌体样品上样，需进行梯度稀释避免样本堵塞进样针。待样本完成检测即可获得NanoFCM仪器(福流生物Flow NanoAnalyzer)检测外泌体的粒径和浓度信息。
(3)Western blot(WB)：外泌体样本加入RIPA裂解液，经超声破碎5min(振幅20％，超声5s，停25s)，冰浴进行。在4℃，12000×g离心10min，小心吸取上清并移至预冷的新EP管中。使用BCA法确定蛋白浓度，备用或-80℃冻存。将蛋白样品与5×加样缓冲液以体积比为4:1混合，制备上样液。按照分离胶8％，浓缩胶5％制胶，上样，80V电泳30min后120V电泳60min。再以250mA转印2h，转膜完成后，取出PVDF膜，加入封闭液，室温条件下摇床慢摇1h。分别加入L1CAM、CD81和CD63抗体，4℃孵育过夜。弃去一抗，加HRP标记的抗鼠IgG，室温条件下温和摇动1h。弃去二抗洗膜发光。采用各目的蛋白与内参蛋白条带的光密度比值来表示目的蛋白的相对表达水平变化。
血清NDEs鉴定结果参见图2a、图2b和图2c。其中，纳米流式检测仪做粒径分析，结果显示ASD组比TD组NDEs浓度更高(2.04E+10vs 1.20E+10)。ASD组和TD组NDEs平均粒径分别为61.50±20.71nm和62.07±20.75nm，无明显差异(图2a)。透射电子显微镜下，两组NDEs均呈“杯盘”结构(图2b)。Western blot结果显示，与血清总外泌体相比，NDEs中L1CAM表达明显更高；与血清蛋白相比，NDEs中富含外泌体特异性标志蛋白CD63和CD81(图2c)。经鉴定，此分离制备流程可富集到较高纯度的血清NDEs。
4、总RNA提取
采用Trizol(Invitrogen)试剂提取样品Total RNA。利用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific)定量并经Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)检测RNA完整性。总RNA的纯度会影响探针的标记效率和芯片杂交结果，所以使用QIAGEN RNeasyKit纯化总RNA。具体步骤如下：取总RNA 100μg溶解于100μL RNasefree水中加入350μLBuffer RLT并充分混匀。加入250μL无水乙醇，Tip头充分混匀。将共计700μL含总RNA的溶液转入套在2ml离心管内的RNeasy柱子内，8000g离心30秒弃去滤过液。吸取500μL BufferRPE到RNeasymini柱子内，8000g离心洗涤30秒，弃去滤过液，再用500μL Buffer RPE在8000g离心洗涤2min弃去滤过液和2m L的套管将RNeasy mini柱子转入一新的1.5m LEppendorf管中。吸取40μL RNase free的水，8000g离心洗脱1min。重复上一步骤。图3为ASD-1～5和TD-1～3血清NDEs中RNA表达归一化结果。
5、人类全转录组芯片杂交
取纯化后总RNA 250ng，使用Affinity Script RT试剂盒以及PromoterPrimer将RNA反转录成cDNA的第一链，再利用Antisense Promoter生成cDNA的第二链，加入T7 RNApolymerase利用cDNA的第二链扩增生成cRNA。随后使用荧光染料Cyanine3 CTP(Cy3)进行标记，标记后使用QIAGEN 
Kit进行纯化。配制片段化混合液，然后在60℃温浴30min进行片段化，冰浴1min。加入2×GEx Hybridization Buffer混匀。上芯片65℃17小时10rpm滚动杂交。取出芯片于洗液1中洗涤1分钟。再将芯片放入洗液2中洗涤1分钟，37℃。Agilent Scanner G5761A(AgilentTechnologies)扫描仪中扫描，分辨率为3μm/5μm，扫描仪自动以100％扫描一次得到原始图像。
6、图像采集和数据分析
采用Feature Extraction软件(version120.3.1,Agilent处理原始图像，提取原始数据。接着利用Genespring软件(version14.8AgilentTechnologies)进行数据的quantile标准化和后续处理。标准化后的数据进行过滤，在用于比较的每组样本中至少有一组100％标记为Detected的探针留下进行后续分析。利用T检验的p值和倍数变化值进行差异表达的mRNA的筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值>＝2.0且P值<＝0.05。
图4为经全转录组芯片检测后ASD-1～5和TD-1～3血清NDEs相关性分析。结果表明ASD和TD样本组内差异较小，组间差异明显。图5为ASD vs TD血清NDEs中差异表达mRNA。结果显示ASD组167个mRNA上调，1251个mRNA下调。
7、qRT-PCR个例验证
CHRM1 mRNA翻译产物为毒蕈碱乙酰胆碱受体M1(Muscarinic acetylcholinereceptor M1)，主要分布在神经元细胞膜上，介导多种细胞反应，包括腺苷酸环化酶的抑制、磷酸肌醇的分解和通过G蛋白的作用调节钾离子通道。
利用Primer 3.0设计CHRM1特异引物并通过生工生物工程股份有限公司合成。为了确保引物的特异性和qPCR的精确性，我们严格遵循以下引物设计原则：荧光定量产物长度80-150bp，最长300bp；引物长度在17-25碱基之间，上下游引物不能相差太大；G+C含量在40％～60％之间，45-55％最佳；TM值在58-62度之间；尽量避免引物二聚体和自二聚体，不要出现超过4对连续互补的碱基发卡结构，如果不可避免，使ΔG<4.5kJ/mol；3′端不可修饰，而且要避开AT，GC rich的区域，避开T/C，A/G连续结构(2-3个)；引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。采用可以特异结合到polyA尾巴的oligo(dt)引物反转录。管家基因作为内参。采用TaKaRa公司SYBR Green荧光实时定量PCR试剂盒进行qRT-PCR。制定标准品，做标准曲线。根据溶解曲线分析PCR扩增反应的特异性。读取Ct值，通过标准曲线计算OSTC在ASD和TD样本表达情况。统计分析采用SPSS 13.0软件进行unpaired t-test检验计算P值。ROC曲线分析，确定AUC值、临界值及其特异性和灵敏度。
图6为利用qRT-PCR对CHRM1在23例ASD和22例TD儿童血清NDEs中的相对表达分析。结果显示CHRM1在ASD人群中显著高表达(p＝0.0057)。图7为ROC曲线分析CHRM1在ASD的诊断价值。CHRM1的AUC值值为0.78，最佳界值对应特异性为72.3％，灵敏性为82.6％，表明CHRM1具良好的ASD诊断价值。
综上所述，本发明通过全转录组芯片对混养样本分析和qRT-PCR对个例样本验证，都表明ASD血清NDEs中CHRM1显著高表达，此mRNA可以作为孤独症诊断的血清标记物，填补了孤独症生化诊断的空白。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (9)
1.神经元来源外泌体标志物CHRM1作为孤独症血清诊断标记物的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述神经元来源外泌体标志物CHRM1的mRNA在孤独症血清中显著高表达。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述神经元来源外泌体标志物CHRM1的mRNA在ASD患者中的表达相较于TD儿童上调1.65倍。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，通过qRT-PCR、测序和探针杂交技术对血清中神经元来源外泌体CHRM1表达进行检测。
5.用于检测神经元来源外泌体标志物CHRM1的试剂在制备用于孤独症血清诊断剂或诊断试剂盒中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述神经元来源外泌体标志物CHRM1的mRNA在孤独症血清中显著高表达。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述神经元来源外泌体标志物CHRM1的mRNA在ASD患者中的表达相较于TD儿童上调1.65倍。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，通过qRT-PCR、测序和探针杂交技术对血清中神经元来源外泌体CHRM1表达进行检测。
9.一种孤独症血清诊断试剂盒，其特征在于，包括用于检测待测孤独症的血清样品中神经元来源外泌体标志物CHRM1的试剂。
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| YANNAN QIN 等: "Whole-Transcriptome Analysis of Serum L1CAMCaptured Extracellular Vesicles Reveals Neural And Glycosylation Changes In Autism Spectrum Disorder", 《RESEARCH SQUARE》, pages 10 - 13 * |
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