CN114438245A

CN114438245A - 与花生抗青枯病主效qtl位点连锁的snp分子标记及其应用

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Publication number: CN114438245A
Application number: CN202210137772.4A
Authority: CN
Inventors: 廖伯寿; 罗怀勇; 雷永; 晏立英; 姜慧芳; 陈玉宁; 刘念; 淮东欣; 周小静; 黄莉; 康彦平; 陈伟刚; 王欣; 王志慧
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2022-02-15
Filing date: 2022-02-15
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2042-02-15
Also published as: CN114438245B

Abstract

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及与花生抗青枯病主效QTL位点连锁的SNP分子标记及其应用。本发明所提供的SNP分子标记BWRB03‑R中SNP多态性位点位于如SEQ ID NO.1所示序列的第201位，多态性为G/A。具体地，SNP分子标记BWRB03‑R中，多态性位点的基因型为A，对应的花生表型为具备较强的青枯病抗性，多态性位点的基因型为G，对应的花生表型为较弱的青枯病抗性。采用本发明提供的SNP分子标记，可以辅助选择抗青枯病的花生材料，有利于推动抗青枯病花生品种的选育，提高育种效率。

Description

与花生抗青枯病主效QTL位点连锁的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及与花生抗青枯病主效QTL位点qBWRB03连锁的SNP分子标记及其应用。

背景技术

花生(Arachis hypogea L.)是重要的油料作物之一。由青枯菌(Rastoniasolanacearum)引起的青枯病是危害花生生产最重要的细菌性病害。青枯菌从土壤侵入植物根部，沿维管束向上扩展并大量繁殖，最终导致植物导管丧失输水能力而快速枯委死亡。在花生生产中，一般病地的植株病死率为10-30％，重病地的植株病死率可达到80％以上，极端情况下甚至会全部死亡导致绝收。因此，有效地防控青枯病是花生产业发展的重大需求之一。

选育和利用抗病品种是防治花生青枯病最为经济有效的措施之一。花生对青枯病的抗性表型为数量抗性，发掘和利用稳定的主效QTL是选育抗青枯病品种的关键基础。通过构建重组自交系群体，在多个环境下对青枯病抗性进行鉴定，结合分子标记基因型进行QTL分析，可鉴定出稳定表达的主效QTL；利用与QTL连锁的分子标记可以进行分子标记辅助选择，提高育种效率。

目前对花生抗青枯病的QTL定位研究还较少，仅在B02染色体上发掘出了稳定的主效QTL及其分子标记。为了进一步提高青枯病抗性水平，发掘和利用新的抗病QTL主效位点至关重要的。

发明内容

本发明的目的是提供检测花生抗青枯病主效QTL位点qBWRB03的方法，快速判断花生的青枯病抗性。

具体地，本发明第一方面，提供一种花生抗青枯病SNP分子标记BWRB03-R。更具体地，本发明提供的SNP分子标记BWRB03-R与花生抗青枯病主效QTL位点qBWRB03连锁。

本发明提供的SNP分子标记BWRB03-R，与位于B03染色体上的抗青枯病主效QTL位点qBWRB03紧密连锁。

本发明提供的SNP分子标记BWRB03-R，SEQ ID NO.1所示序列的第201位存在多态性位点G/A。

在所述SNP分子标记BWRB03-R中，具有第201位多态性位点的基因型为A，对应于含有抗青枯病主效QTL位点qBWRB03，基因型为G，对应于不含qBWRB03。

本发明提供的SNP分子标记BWRB03-R，使用SEQ ID NO.2-3所示的引物对扩增得到。

第二方面，本发明提供一种引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示。本发明提供的引物对，用于扩增上述SNP分子标记BWRB03-R。

BWRB03-R的引物对：

正向引物序列5’-ATGAAAAGTGAAAAATGAAAAGTGAAAAGGGA-3’(如SEQ ID NO.2所示)，

反向引物序列5’-CAGCGGGGGCAAGTTCAC-3’(如SEQ ID NO.3所示)。

第三方面，本发明请求保护含有上述引物对的试剂或试剂盒。

根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护上述的SNP分子标记BWRB03-R，或如SEQ ID NO.2-3所示的引物对，或含有SEQ ID NO.2-3所述的引物对的试剂或试剂盒，在检测花生抗青枯病主效QTL位点qBWRB03中的应用。

具体地，第四方面，本发明提供一种检测花生抗青枯病主效QTL位点qBWRB03的方法，包括：

(1)利用SEQ ID NO.2-3所示引物对，对待测花生的DNA进行PCR扩增；

(2)分析PCR扩增产物中SNP分子标记BWRB03-R的基因型，根据所述基因型判断待测花生是否含有抗青枯病主效QTL位点qBWRB03。

在本发明提供的检测花生抗青枯病主效QTL位点qBWRB03的方法中，若SNP分子标记BWRB03-R的基因型为A，待测花生含有抗青枯病主效QTL位点qBWRB03；若SNP分子标记BWRB03-R的基因型为G，待测花生不含qBWRB03。

本发明还请求保护上述的SNP分子标记BWRB03-R，或如SEQ ID NO.2-3所示的引物对，或含有SEQ ID NO.2-3所述的引物对的试剂或试剂盒，在以下任一的应用：

(1)在花生种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；

(2)在花生青枯病抗性早期预测中的应用；

(3)在筛选抗青枯病花生中的应用。

第五方面，本发明提供一种鉴定花生青枯病抗性的方法，包括：

(1)利用SEQ ID NO.2-3所示引物对待鉴定花生的DNA进行PCR扩增；

(2)分析PCR扩增产物中SNP分子标记BWRB03-R的基因型，根据所述基因型判断待鉴定花生的青枯病抗性。

在本发明所提供的鉴定花生青枯病抗性的方法中，若SNP分子标记BWRB03-R的基因型为A，待鉴定花生的青枯病抗性强；SNP分子标记BWRB03-R的基因型为G，待鉴定花生的青枯病抗性弱。

本发明的有益效果在于：

本发明筛选得到与花生抗青枯病主效位点qBWRB03连锁的SNP分子标记BWRB03-R，并设计得到检测SNP分子标记的引物对，采用花生抗青枯病主效位点qBWRB03的SNP分子标记的检测方法，可以辅助选择抗青枯病的花生材料，有利于推动抗青枯病花生品种的选育，提高育种效率。

本发明的SNP分子标记主要是检测是否含有抗青枯病位点qBWRB03，含有qBWRB03位点的花生材料抵抗青枯病的能力更强。在育种应用中，可以用ICG12625或具有qBWRB03的其他材料做亲本进行杂交，在其后代中会产生含有或不含有qBWRB03的许多个体，通过标记辅助选择保留含有qBWRB03位点的个体材料，再从这些个体材料中再选择产量高、品质优的，最终就可以形成抗青枯病的花生新品种。

附图说明

图1为为本发明中花生抗青枯病主效位点qBWRB03在染色体B03的定位图，其中纵向垂直线表示花生染色体B03，B03右侧横向短线段表示染色体上的遗传重组bin；左侧横向短线段表示bin间的遗传距离(cM)；抗青枯病主效位点qBWRB03定位于bin位点c13b013和c13b014之间1cM的区域，B03右侧列出了该QTL在2019～2020两年间检测到的置信区间。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例提供与花生抗青枯病主效QTL位点qBWRB03连锁的SNP分子标记BWRB03-R的开发过程，如下。

供试材料：以花生感青枯病品种中花10为母本，花生抗青枯病种质ICG12625为父本进行杂交，通过单粒传法获得包含140个株系的重组自交系(RIL)群体。

表现型鉴定：2019年和2020年在中国农业科学院油料作物研究所红安青枯病病圃鉴定了中花10、ICG12625及RIL群体140个株系的青枯病抗性。采用完全随机区组实验设计，3次重复。每次重复每份材料种植1行20株，行距30厘米，株距10厘米。采取标准的田间管理方式。全部出苗后，统计每份材料的总株数。在青枯病开始发病后，统计病死株数，直至收获。然后计算成活率：(总株数-病死株数)/总株数×100％，成活率越高的材料对青枯病的抗性越好。

遗传连锁图谱的构建：用CTAB法提取亲本和RIL群体140个单株叶片DNA；每个样本DNA建一个300-500bp Illumina Paired-end(PE)文库，进行PE150测序。下机的原始数据进行质控后得到高质量的cleandata，然后使用BWA软件将cleandata比对到四倍体栽培花生参考基因组上(https://www.peanutbase.org/data/public/Arachis_hypogaea/Tifrunner.gnm1.KYV3/)，最后使用GATK的HaplotypeCaller模块进行SNP检测。将基因型相同的SNP位点合并成bins，最后计算bins遗传图距从而得到终连锁图谱。该连锁图谱包含2701个bin位点，总长度为1469.56cM，标记间平均距离为0.54cM。

QTL的定位：利用WinQTLCart软件的区间作图法开展成活率的QTL分析，两个环境的成活率表型数据均在染色体B03上c13b013～c13b014区间检测到主效QTL位点qBWRB03，主效QTL位点qBWRB03在两个环境的LOD值分别为4.82和5.11，表型解释率分别为12.01％和10.58％。

两个环境的置信区间相互重叠，位于一个1cM的区间(6.7～7.7cM)，其位置的示意图见图1。因此，花生抗青枯病主效位点qBWRB03能在两年实验中稳定表达，其抗性等位基因来源于ICG12625。

利用c13b013～c13b014区间中的一个SNP(位于上述参考基因组B03染色体125,198,196bp(G/A变异))开发出一个SNP分子标记BWR B03-R(SEQ ID NO.1)，扩增产物二代高通量测序检测SNP位点碱基组成：在ICG12625中检测出A碱基，属于含有qBWRB03抗青枯病等位基因；而在中花10号中检测出G碱基，则不含有qBWRB03抗青枯病等位基因。

针对实施例1提供的分子标记BWRB03-R，设计引物如SEQ ID NO.2-3所示。

实施例2

本实施例提供，利用与抗青枯病主效位点qBWRB03相连锁的SNP分子标记BWRB03-R，对实施例1中两个环境均获得成活率数据的ICG12625和中花10号的131个RIL进行检测。具体步骤如下。

以基因组DNA为模板，SEQ ID NO.2-3所示序列为引物，用KAPA2G Fast MultiplexMix试剂盒扩增SNP分子标记BWRB03-R。PCR条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s、55℃复性30s、72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温。扩增产物添加测序接头后用Illumina HiSeq平台进行Paired-end 150bp(PE150)测序，测序序列比对到参考序列，检测SNP位点的碱基。如果RIL与ICG12625的扩增片段检测出的SNP位点碱基一致，说明该株系含有qBWRB03的抗青枯病等位基因。同时用实际测得的成活率(测试方法见实施例1)结果与分子标记检测结果进行验证。

结果显示，在131个RIL中，62个RIL的SNP分子标记基因型与ICG12625相同(基因型分类1，A)，说明含有纯合的主效抗青枯病QTL位点qBWRB03；而69个RIL的SNP分子标记基因型与中花10号相同(基因型分类2，G)，说明不含有qBWRB03。

T检验发现，含有qBWRB03的62个RIL在2019和2020两年鉴定的成活率中均显著高于不含有qBWRB03的69个RIL(表1)。因此，同时用本发明的与抗青枯病主效位点qBWRB03相连锁的SNP分子标记BWRB03-R预测花生对青枯病抗性有较好的预测效果。

表1利用本发明的SNP分子标记进行选择RIL株系的成活率差异

**表示在0.01水平上，基因型分类1与基因型分类2之间存在显著差异。基因型分类1的基因型与ICG12625相同，基因型分类2的基因型与中花10号相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 与花生抗青枯病主效QTL位点连锁的SNP分子标记及其应用

<130> KHP221110794.7

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 401

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaatctgaa tagaataaaa gtgaaaagtt agaaaagaga agatgaaaag tgaaaaatga 60

aaagtgaaaa gggagaccac gggtttatat atttgggcaa actttctcaa acttcaccga 120

gaggtgcggc gaacttcatg gattatgcga aattcgccaa gggcggcgaa ccttgtgaaa 180

atgatgagat ttgtcgaaga gagcggtgaa cttgcccccg ctgccaaaaa aatgtatctc 240

aaaaaagaac gtgagattta ttttttcgtg aaaataaaat attttttatt ttattccaaa 300

aaaatcatat gtatttgtgt ataaatatat atattattta atttttttaa tgcatatttt 360

atattgtaac atatatttat attagtggtt aattttagta a 401

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaaagtg aaaaatgaaa agtgaaaagg ga 32

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagcgggggc aagttcac 18

Claims

1.花生抗青枯病SNP分子标记BWRB03-R，其特征在于，SEQ ID NO.1所示序列的第201位存在多态性位点G/A。

2.根据权利要求1所述的SNP分子标记BWRB03-R，其特征在于，使用SEQ ID NO.2-3所示的引物对扩增得到。

3.引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示。

4.含有权利要求3所述引物对的试剂或试剂盒。

5.权利要求1或2所述的SNP分子标记BWRB03-R，或权利要求3所述的引物对，或权利要求4所述的试剂或试剂盒，在检测花生抗青枯病主效QTL位点qBWRB03中的应用。

6.检测花生抗青枯病主效QTL位点qBWRB03的方法，其特征在于，包括：

(1)利用SEQ ID NO.2-3所示引物对，对待测花生的DNA进行PCR扩增；

(2)分析PCR扩增产物中权利要求1或2所述的SNP分子标记BWRB03-R的基因型，根据所述基因型判断待测花生是否含有抗青枯病主效QTL位点qBWRB03。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，若SNP分子标记BWRB03-R的基因型为A，待测花生含有抗青枯病主效QTL位点qBWRB03；若SNP分子标记BWRB03-R的基因型为G，待测花生不含qBWRB03。

8.权利要求1或2所述的SNP分子标记，或权利要求3所述的引物对，或权利要求4所述的试剂或试剂盒，在以下任一的应用：

(2)在花生青枯病抗性早期预测中的应用；

(3)在筛选抗青枯病花生中的应用。

9.鉴定花生青枯病抗性的方法，其特征在于，包括：

(1)利用SEQ ID NO.2-3所示引物对待鉴定花生的DNA进行PCR扩增；

(2)分析PCR扩增产物中权利要求1或2所述的SNP分子标记BWRB03-R的基因型，根据所述基因型判断待鉴定花生的青枯病抗性。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，

若SNP分子标记BWRB03-R的基因型为A，待鉴定花生的青枯病抗性强；SNP分子标记BWRB03-R的基因型为G，待鉴定花生的青枯病抗性弱。