CN114410690A

CN114410690A - 抗萎锈灵草菇及其遗传转化方法

Info

Publication number: CN114410690A
Application number: CN202111413737.2A
Authority: CN
Inventors: 刘明; 杨松光; 周慧; 肖自添; 徐江; 何焕清; 彭洋洋
Original assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2021-11-25
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2041-11-25
Also published as: CN114410690B

Abstract

本发明公开了一种抗萎锈灵的草菇及其遗传转化方法，包括以下步骤：向裂解酶酶液中加入小块的草菇子实体酶解，收集所得原生质体；调整为适当浓度，依次加入STC溶液、含有抗萎锈灵基因的片段，以及PTC缓冲液，混匀，离心去除上清；加入CYM培养基，倒平板，培养18‑24h后；加铺含有4μg/ml萎锈灵的PDA培养基，能够萌发的原生质体为抗萎锈灵的草菇。本发明方法提供一种不含外源物种DNA的草菇转化方法，并用此方法获得了亲本生物学特性维持较好、遗传稳定的抗萎锈灵草菇，使得使用杀菌剂萎锈灵来控制草菇培养料中的担子菌类杂菌成为可能。

Description

抗萎锈灵草菇及其遗传转化方法

技术领域

本发明属于食用菌分子育种领域，具体涉及一种抗萎锈灵的草菇及其遗传转化方法。

背景技术

目前，草菇栽培过程中由于培养料并非完全灭菌，经常会受到竞争性杂菌的污染。墨汁鬼伞、膜鬼伞等担子菌是草菇栽培过程中最常见的竞争性杂菌。草菇栽培过程中担子菌类杂菌的防治较难，它们喜高温、高湿，一般在草菇播种后一周或出菇后出现，一旦发生，会污染料面并大量消耗培养料中的养分和水分，从而影响草菇菌丝的正常生长和发育，致使草菇减产。

萎锈灵是一种杀菌剂，对担子菌有较强的抑制作用，对人和动物毒性很低。在草菇培养料中施加萎锈灵能杀灭墨汁鬼伞等杂菌，但由于草菇也属于担子菌类，施加萎锈灵会抑制草菇生长。因此需要开发抗萎锈灵草菇，使得在栽培中施加萎锈灵杀菌剂杀灭其他杂菌而不抑制草菇生长，这将提高草菇生产效率，降低生产成本。

萎锈灵的主要作用位点是琥珀酸脱氢酶的β亚基(SdhB)，β亚基上与萎锈灵耦合位点的氨基酸残基发生改变，可使萎锈灵无法与之结合而失去杀菌能力，真菌即获得对萎锈灵的抗性。

目前在香菇中通过直接合成的方法将SdhB蛋白第243位组氨酸的密码子CAC改造为亮氨酸的密码子CTC，构建了香菇的萎锈灵抗性基因，并通过农杆菌介导的遗传转化法将外源质粒转化进香菇菌丝获得了抗萎锈灵菌株，但其采用质粒作为载体含有外源物种DNA，并且双核菌株抗性在传代5代后抗性表型消失，表明抗性遗传不稳定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗萎锈灵的草菇及其遗传转化方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

抗萎锈灵草菇的遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)配制质量体积浓度0.5-3％的裂解酶酶液，加入小块的草菇子实体，30-35℃酶解0.5-3.5h，收集所得原生质体；

步骤(1)所述的裂解酶酶液，其质量体积浓度优选2％，具体配制方法如下：

称取0.2g裂解酶(L1412 sigma aldrich)，加入250μl 0.2M pH值5.7的MES缓冲液、7.5ml 0.8M的甘露醇溶液、1.7ml ddH₂O，混匀；

(2)取步骤(1)所得原生质体，调整为适当浓度，依次加入STC(山梨醇-氯化钙)溶液、含有抗萎锈灵基因的片段，以及PTC缓冲液(聚乙二醇-氯化钙转化缓冲液)，混匀，室温放置2-10min，离心去除上清；加入预冷的CYM液体培养基，混匀后加入CYM固体培养基中，倒平板，30-35℃培养18-24h后；加铺一层含有4μg/ml萎锈灵的PDA培养基，能够萌发的原生质体为抗萎锈灵的草菇；

步骤(2)中，所述原生质体浓度为(0.1-1.0)×10⁸/mL；

步骤(2)中，所述含有抗萎锈灵基因的片段，是将如SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸连接到pMD18-T载体，采用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，回收含有抗萎锈灵基因的片段。

一种抗萎锈灵的草菇，由上述遗传转化方法制得，含有如SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明方法提供一种不含外源物种DNA的草菇转化方法，并用此方法获得了亲本生物学特性维持较好、遗传稳定的抗萎锈灵草菇，使得使用杀菌剂萎锈灵来控制草菇培养料中的担子菌类杂菌成为可能。

附图说明

图1是子实体酶解后形成的原生质体。

图2是阳性转化子的筛选。

图3是阳性转化子的测序分析结果。

图4是不同浓度萎锈灵对野生型草菇菌丝的筛选结果。

图5是本发明阳性转化子与野生型草菇在PDA培养基上的生长情况对比。

图6是本发明阳性转化子与野生型草菇在出菇培养基上的生长情况对比。

图7是传代5代后本发明阳性转化子在筛选培养基上的生长情况。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗萎锈灵草菇的遗传转化方法，包括以下步骤：

1、草菇抗萎锈灵基因片段的获得

采用overlapPCR的方法获得草菇抗萎锈灵基因片段，采用的引物为：

VvSdhB-N1：tgtgcacgttctccgaactaggc(SEQ.ID.NO.2)

VvSdhB-C1：cactcacaattgaagatggtgagacacctatacaagctcat(SEQ.ID.NO.3)

VvSdhB-N2：atgagcttgtataggtgtctcaccatcttcaattgtgagtg(SEQ.ID.NO.4)

VvSdhB-C2：ggcaccttattcattagtcttttatcat(SEQ.ID.NO.5)

①扩增方法为：

使用引物VvSdhB-N1、VvSdhB-C1和VvSdhB-N2、VvSdhB-C2以提取的草菇基因组DNA为模板扩增，分别得到草菇SdhB基因片段1和片段2。将片段1和片段2混合，使用引物VvSdhB-N1、VvSdhB-C2扩增，得到第244位组氨酸密码子CAC突变为亮氨酸密码子CTC的草菇抗萎锈灵基因片段3(即SEQ.ID.NO.1)。

片段1反应程序为：

(1)94℃，3min；

(2)94℃，30sec；

(3)55℃，30sec；

(4)72℃，2min；

(5)72℃，6min。

步骤2-4反应30个循环。

片段2反应程序同片段1。

片段3反应程序为：

(4)72℃，2.5min；其余同片段1。

②将得到的草菇抗萎锈灵基因片段3按说明书操作连接到pMD18-T载体，通过测序确认突变成功。采用EcoRⅠ和HindⅢ内切酶双酶切，得到含有抗萎锈灵基因片段的pMD18-T载体，回收含有片段3的目标片段，并浓缩至浓度1mg/mL以上。

2、草菇的遗传转化与筛选

①以草菇子实体为材料制作原生质体

制2％酶液：称取0.2g裂解酶(L1412 sigma aldrich)于15ml离心管，加入250μl0.2M pH值5.7的MES缓冲液、7.5ml 0.8M的甘露醇溶液、1.7ml ddH₂O。将切成小块的草菇子实体，放入酶液30℃酶解1.5h，收集原生质体(图1)。

②原生质体转化与筛选

调节原生质体浓度为1×10⁸/mL，用手轻弹重悬，分装至2ml离心管中；取160μl原生质体，每管加入160μl STC溶液，5μg DNA用手轻弹混匀原生质体；加入50μl PTC缓冲液，轻轻混匀。室温放置5min，2000rpm离心去除上清；加入1ml 4℃预冷的CYM液体培养基，轻轻混匀；加入到100ml冷却的CYM固体培养基中，倒平板，30℃培养22h；原生质体萌发后再铺一层含4μg/ml萎锈灵的PDA固体培养基，30℃培养观察菌株的生长情况(图2)，能够萌发的原生质体为抗萎锈灵的草菇。

提取阳性转化子测序分析，如图3所示，表明草菇SdhB基因第244位编码组氨酸的密码子CAC突变为亮氨酸的密码子CTC。

3、抗萎锈灵草菇抗性遗传稳定性检测

萎锈灵对野生型草菇菌丝生长有强烈抑制作用，野生型草菇在含4μg/mlCarboxin的PDA培养基上几乎不能生长(图4)。因此，选定4μg/ml为萎锈灵筛选浓度。

取步骤2之②最后萌发的原生质体与野生型草菇在PDA培养基上30℃培养3天后，野生型草菇和SdhB基因突变草菇菌丝生长速率无明显差异(图5左图)。

取步骤2之②最后萌发的原生质体与野生型草菇在含4μg/ml萎锈灵的PDA培养基上30℃培养3天，野生型草菇不生长，突变体草菇菌丝生长旺盛(图5右图)。

取步骤2之②最后萌发的原生质体与野生型草菇在出菇培养基(含棉籽壳50％、稻草50％，含水量60％)上30℃培养3天，野生型和突变体草菇均能正常生长；在含有筛选浓度萎锈灵的出菇培养基上，突变体能正常生长，野生型生长缓慢(图6)。

本发明的阳性转化子菌丝传代5代后(将阳性转化子接种到不含Carboxin的PDA培养基培养，菌落长满平板后取外侧菌丝接种至新的PDA培养基为第1代)，将菌丝接入出菇培养基，取成熟的草菇子实体经组织分离，将组织块接种到含4μg/ml Carboxin筛选培养基培养，发现突变体仍具有抗性(图7)。

实施例2

草菇的栽培按照常规方法进行，出菇培养基装塑料框中，121℃灭菌1.5h，分别接种野生型草菇和实施例1所得阳性转化体，30-32℃下培养，接3框，出菇前喷一次出菇水。记录接种后到原基形成的时间。

生物转化率＝草菇鲜重/培养基干重。

菌丝生长速率测定，将活化后的菌株用直径为7mm的打孔器取菌块，接种于PDA培养基平板中间，30℃培养记录菌丝生长速率。

表1野生型草菇和sdhb突变草菇生物学特性比较

由子实体原生质体再生的草菇菌株均能出菇，且抗萎锈灵草菇在原基形成时间和生物转化率方面与野生型草菇无明显差异。表明通过本发明方法获得的草菇菌株除了有萎锈灵抗性以外没有其他的明显生物学特性差异，获得的菌株能很好的保持亲本性状。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 抗萎锈灵草菇及其遗传转化方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3576

<212> DNA

<213> 草菇(Volvariella volvacea (Bull.) Singer)

<400> 1

tgtgcacgtt ctccgaacta ggcttatgca aaattggatc ttgccatgac cagccctcca 60

gtagacgaca tgctgtcctt tgcatattct cagtgaggaa tcggaggatg agatggatat 120

ggctgtgtta ttcgagaact acctcgctgt caatagaaaa acgatttgga attacacgga 180

gagagggaga gaatttaggt gttgaaagag gtgtttagga ttggcattga atgcattgag 240

gaggcgatgc gttggcgcga tgagagtaat accattgaca taagtactgt tatcgttcac 300

atgagccata tcatctgaat gataccatgg caatgaccgc ggatgctatg ggaggttgtt 360

ggtatcgata tcggccacga agaatgatat cctaaacatt ggtcctgcag tgtctactac 420

gagtggaacg ctgagacgcg gatcaggtgg gggaggtgca acaaaagtta tttttatatg 480

cgaactgtct ctagtggtcg tacactcttg gcagcacggt gccacatatt gacggggagg 540

agggtaaggg aaaaggcagt ggaaatgcac acactggcga tcacaagagg gtgttctgac 600

cgtttacacc gctctactgt tgatcgactt attcatcctc agaataaata tgtcatatcg 660

cattagtatg atgggcttgt tgcaaggccc aatggggacc gaagaattgg gcgagaatgt 720

tctcgatagt agtgtttttc ttgtgcaatt atcatgggta ttgatggcgt atatatatca 780

ctgaccacga ctaatcgacc aacaaccagc tgcacaactg tcgactacta gaggagacga 840

cgtcatggcc attgtagcgc gttcaaccca gtcccaggaa gatagaccgt ggattaggca 900

tccgtttcaa gttgactctc cgtacaccta taccccggct caagttctcg cttacctcaa 960

ggaaatcgag ttcccgttac cagaatcagc atctttagtg gatccccagg gggcgaagac 1020

gcggaaaagg ttatcgaaga agtgaagcct acatggaata accttgtcaa gatcctcaga 1080

ggacatctat taagattccc attcgacgac acagaggtgc attagttggg tgttatcctc 1140

cgatctagtt gcgaatgcta gatgccgact ttcgatacag cactgcatcg cacgacgtgg 1200

acgtcactcc tcaagtgata ttcaagagga tggtggaaga caaaaggtgg atcgctgtgt 1260

tttggcatga ctgggctgat atatgggtta ctgagaggac ttggatatcg atctgtttct 1320

tccctaccag gtcgtctcgg caggcgctaa tgacccctct aaacaggtca tacacaggcg 1380

cagcccgcgt caatcaaacg cctggattcg cgcagcccta caactgggca cctatcggcc 1440

acatgatcat tctcgtccag cccttcgcgg attacgaaat gctgtcggac cagatggagg 1500

gagtaccgca acatacgtcg tggacgctgg gcatcccggg ggccggtgca gcccattctg 1560

ctcacagaca cggaggagag cgagagggag gggatctgtt tggcatcgac gtcggggatg 1620

ccgacgaggc cgtcgagcgc atcgccggtc gcgatgctgc aatggcggca gcgcagcggc 1680

gttaacctgt agcctccgtc tagattttgc ttacctaata atcagtgtga aaagcaagga 1740

gtgtgattgg tccggagcaa ggacaacccg tgttcacccc gaaatcacgc gactgaaatc 1800

gaccgctccg cttcagtccg cccgcgcgag gaaataaact ctaaaccgaa tctctcctct 1860

cctccacttt cattctcctc ctcgttcctg ctgctcactc catcgtattg tgtcgggagc 1920

aagaatgcag tccatcatcg cgcgaacggc gccaaagcgt gcctccacct ctttcttggc 1980

tgcccgcggt ttcgcatcca cagcgaggac tttccaggct gagcctacac agaagccggt 2040

gctgatgaag gagttcaaga tctaccgttg ggtgagtggg tggttgtact ttcgatttgg 2100

aggtttgagc gggggttctc attgctagct gcttgcttcc gtgcctcgtg catgctggcc 2160

gtctaccttt gcgctgttgc gatgggccgc ttctagaacc cggatgagcc agcgaacaag 2220

cctactctcc aatcatacaa gattgacctc aaccagtgcg gtcctatggt atgtccacga 2280

taaggctgtc acctctgtcg acgctgatac atgccgctgt cggtagatcc tagacgctct 2340

catcaagatc aagaacgaga tggatcccac cctcactttc cgccgaagct gccgcgaggg 2400

catctgcggc tcctgcgcca tgaacattga cggccaaaac acgctcgcct gtctctgccg 2460

catcgaccgt gacggcggca aggactccaa gatctaccct ctcccccaca gtacgtcacc 2520

cgcttacata ccctctccct cctagcctcc tctcaccccc ctccccctcc tcagtgtaca 2580

tcgtcaaaga cctcgtaccc gacctgaccc tcttctacaa gcaatacaaa tccatccagc 2640

cctggctgca aaacgacaac cccccggcgc agggcgagtt cctccagtcg cccgaggacc 2700

gcaagaagct cgacgggctg tacgagtgca tcctctgcgc gtgctgctcc acctcgtgcc 2760

cgagctactg gtggaaccag gacgagtacc tcggccccgc gaccctcatg caggcctaca 2820

ggtggatcgc ggacagcaga gacgcgtacg gcgcgcagag gaaggaaaag ctgcagaacg 2880

agatgagctt gtataggtgt ctcaccatct tcaattgtga gtgactttct ctcttctttt 2940

gtcgcgtcgt ggtgggcgtt gttgtgtgac tctgggactg atcacttgtg ttctaggctc 3000

ccgaacttgt ccaaagggac tgaaccccgc ccaagccatc gcaaagatca agctcgagct 3060

cgcagcggat taaatgcggg gatgaaaaag tttggcgttt tcctggcctt agacatgcat 3120

gcacacgtac acgcacttcc gacttgtcaa tgtcaacgcc acgttcactc cgtatctcca 3180

ctaggccttt cgcttgcact tcatcccgac ctgtcctcct ttcctccttc ccacccctcc 3240

cccttttctt cgtttaaatg tataggtttg ggcatgtaca gggcattcat acatttgaag 3300

aaatgcattc tgttttcaat tatatttatt caattttggt ggcgtcgatt tagtttcaag 3360

gggttcgcaa aatgagtagt aataggcaat ctttctttat tcccgcaacc ggttgcggta 3420

gacggacttc cacaacgcgg gaagtgataa ggataaggta cgaagcgaag tacaagtata 3480

acaggttaca cgcggacaca agagacaaaa acctgcaggc agagaacatc gcaatactac 3540

aacagccaat gataaaagac taatgaataa ggtgcc 3576

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VvSdhB-N1

<400> 2

tgtgcacgtt ctccgaacta ggc 23

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VvSdhB-C1

<400> 3

cactcacaat tgaagatggt gagacaccta tacaagctca t 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VvSdhB-N2

<400> 4

atgagcttgt ataggtgtct caccatcttc aattgtgagt g 41

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VvSdhB-C2

<400> 5

ggcaccttat tcattagtct tttatcat 28

Claims

1.抗萎锈灵草菇的遗传转化方法，其特征在于包括以下步骤：

(2)取步骤(1)所得原生质体，调整为适当浓度，依次加入STC溶液、含有抗萎锈灵基因的片段，以及PTC缓冲液，混匀，室温放置2-10min，离心去除上清；加入预冷的CYM液体培养基，混匀后加入CYM固体培养基中，倒平板，30-35℃培养18-24h后；加铺一层含有4μg/ml萎锈灵的PDA培养基，能够萌发的原生质体为抗萎锈灵的草菇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的裂解酶酶液，其质量体积浓度为2％。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述裂解酶酶液的配制方法如下：称取0.2g裂解酶，加入250μl 0.2M pH值5.7的MES缓冲液、7.5ml 0.8M的甘露醇溶液、1.7mlddH₂O，混匀。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述原生质体浓度为(0.1-1.0)×10⁸/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述含有抗萎锈灵基因的片段，是将如SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸连接到pMD18-T载体，采用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，回收含有抗萎锈灵基因的片段。

6.一种抗萎锈灵的草菇，其特征在于含有如SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸。

7.根据权利要求6所述的草菇，其特征在于：所述草菇由权利要求1-5任一项所述的遗传转化方法制得。