CN109055420A - 一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体及其构建方法和应用 Download PDF

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pleurotus eryngii
dna
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resistance screening
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李燕
李焱
杨瑞恒
汪滢
茅文俊
唐利华
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Abstract

本发明涉及一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体及其构建方法和应用，将带有点突变的琥珀酸脱氢酶铁硫亚基的DNA片段连入质粒载体，记为pTSdi。本发明的转化载体可以用于转化杏鲍菇，使其获得对真菌杀菌剂萎锈灵的抗性；另外由于在构建的转化载体中留有插入外源基因片段的酶切位点，可以方便地插入感兴趣的外源基因，转化到杏鲍菇中进行遗传学研究，具有良好的应用前景。

Description

一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体及其构建方法和应用。
背景技术
近年来我国杏鲍菇的工厂化栽培发展迅速，成为继金针菇之后发展最快的设施栽培食用菌品种。利用现代分子生物学技术改良杏鲍菇品种，获得产量高、生长周期短、抗杂菌能力强的菌株，是杏鲍菇遗传研究的重要课题。构建杏鲍菇的遗传转化系统首先要建立分子生物学工具，如抗性筛选标记和驱动外源基因表达的启动子等。
通常对基因进行点突变需要购买商业试剂盒，价格不菲而且操作繁琐。因此，引入突变位点的DNA序列可以为构建萎锈灵抗性遗传转化载体提供基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体及其构建方法和应用，解决了实现对基因进行点突变成本过高的问题。
本发明提供了一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体，将带有点突变的琥珀酸脱氢酶铁硫亚基的DNA片段连入质粒载体，记为pTSdi。
本发明还提供了一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体的构建方法，包括：
(1)提取杏鲍菇单核菌丝全基因组DNA，检测DNA质量和浓度；
(2)在需要进行点突变的位置引入一对互补引物sdi2F和sdi1R；以提取的基因组DNA为模板，利用正向引物sdi1F和反向引物sdi1R扩增第一部分的DNA片段；以提取的基因组DNA为模板，利用正向引物sdi2F和反向引物sdi2R扩增第二部分的DNA片段；利用限制性内切酶MfeI消化两部分DNA片段，再采用T4连接酶将消化后的两部分DNA片段连接成完整DNA片段；
(3)将完整DNA片段通过TA载体连接，导入pGEM-Teasy质粒载体中，获得转化载体pTSdi。
所述步骤(2)中的sdi1F的序列为：TCACGTCCTCAATAAGCGCTC；
sdi1R的序列为：ACAATTGAAAATGGTGAGGC；
sdi2F的序列为：GCCTCACCATTTTCAATTGT；
sdi2R的序列为：AGCACCGCAAGTGAGACCAA。
上述引物为PCR扩增琥珀酸脱氢酶复合物的铁硫蛋白亚基的引物。
本发明还提供了一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体的应用，应用于携带外源基因进行杏鲍菇的遗传转化。
有益效果
本发明的转化载体可以用于转化杏鲍菇，使其获得对真菌杀菌剂萎锈灵的抗性；另外由于在构建的转化载体中留有插入外源基因片段的酶切位点，可以方便地插入感兴趣的外源基因，转化到杏鲍菇中进行遗传学研究，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为用于构建转化载体pTSdi的引物位置；
图2为本发明转化载体pTSdi的示意图；
图3为利用PCR结合酶切鉴定杏鲍菇转化子的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一、杏鲍菇萎锈灵抗性转化载体的构建：
(1)提取杏鲍菇单核菌丝全基因组DNA，检测DNA质量和浓度；
(2)在需要进行点突变的位置引入一对互补引物sdi2F和sdi1R(图1)；以提取的基因组DNA为模板，利用正向引物sdi1F和反向引物sdi1R扩增第一部分的DNA片段(2251bp，如SEQ NO.7所示)；以提取的基因组DNA为模板，利用正向引物sdi2F和反向引物sdi2R扩增第二部分的DNA片段(339bp，如SEQ NO.8所示)；利用限制性内切酶MfeI消化两部分DNA片段，再采用T4连接酶将消化后的两部分DNA片段连接成完整DNA片段(2570bp，如SEQ NO.9所示)；
(3)将完整DNA片段通过TA载体连接，导入pGEM-Teasy质粒载体中，获得转化载体pTSdi。
sdi1F的序列为：TCACGTCCTCAATAAGCGCTC；
sdi1R的序列为：ACAATTGAAAATGGTGAGGC；
sdi2F的序列为：GCCTCACCATTTTCAATTGT；
sdi2R的序列为：AGCACCGCAAGTGAGACCAA。
二、外源基因的导入
(1)转化载体pTSdi在Sdi基因的5’端和3’端都预留了限制性内切酶识别位点，可供导入外源基因使用。
(2)在转化载体pTSdi中Sdi基因的5’端导入外源基因，可以选择三个酶切位点SpeI、SalI和MluI中的任意两个加在外源基因PCR片段两侧，通过双酶切连接到转化载体pTSdi中。
(3)在转化载体pTSdi中Sdi基因的3’端导入外源基因，可以利用酶切位点SacII和SphI加在外源基因PCR片段两侧，通过双酶切连接到转化载体pTSdi中。
三、转化子的鉴定：
杏鲍菇转化子的检测可以用PCR结合酶切鉴定：
1，CTAB法提取杏鲍菇转化子全基因组DNA。
2，琼脂糖电泳检测DNA质量，Nanodrop检测浓度。
3，以提取的基因组DNA为模板，利用PCR引物capsF(GTACGTTGTATCATCGTCGCT)和capsR(TGGACAAGTGCGAGAGCCTT)扩增198bp片段。
4，利用限制性内切酶MnlI酶切PCR产物。
5，琼脂糖电泳检测酶切产物，如果转化载体成功插入到了基因组中，可以检测到PCR产物被酶切成为121bp和77bp的两个片段(图3)。
由此说明，将引物capsF和caspR的PCR扩增和限制性内切酶MnlI的酶切鉴定结合起来，可以非常方便地鉴定杏鲍菇遗传转化后获得的阳性转化子。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体及其构建方法和应用
<130> 1
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcacgtcctc aataagcgct c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acaattgaaa atggtgaggc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcctcaccat tttcaattgt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agcaccgcaa gtgagaccaa 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtacgttgta tcatcgtcgc t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tggacaagtg cgagagcctt 20
<210> 7
<211> 2251
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tcacgtcctc aataagcgct cgcgacaacg cggattcaca tcctgccccc acatcactct 60
ccaagaatct cttgttcaaa ggtatcccgt atttgtaagt caagccaacg tttattccat 120
gatacatggc tggccacatt catggtattc tctccgtaaa tagccattta ccacccatga 180
cacgacatat tcggactcct gccgcttgtg aaccgttcaa ctatgcaaat gctaatgcat 240
ggcttctgag actgccaacg ctgtttggag aaaccttctc aaaaacggct gctgaagacc 300
taagccagcg ctgcaccgac attttctcaa cactcaatag aagttgcaac taggtcaaca 360
aagttggcat tcgatcgcct gtgactacaa attgattcgg ggggttcgac gatggacacc 420
atgactgagc tttggggtcc gttacgacga gaacatccga agtcccttcc tcaactttca 480
agggaatttc gaggcctcag agcgccgttg aactcaggtt tccgagtgat acctcaattg 540
ctttccccct tttctgatca gagtactcga ggtacagctt gggtacggca catattctac 600
cttgtatacc tcactcataa cgttccgagg agagtggcat cacacagcgc gctggcctaa 660
aagtggtgtc aagttggaag ggaagcgagt cggggtcatt ggaactgggg ccagcgccga 720
gttcagatca tccaagaggc aggcaaattg gcacaagagc tcgtggtatt acagcgtaca 780
ccgaatctga cattccaccc gcgacaaccc acgcaagcca aagtgtcaga agttgtcgaa 840
atgcagtgga atcatgctca cgaagaggcc ccgagtagtg accctctcaa gtaaacaagc 900
atcgtcgatt tcttaacact tctagttgct ccgtccacgt gtatatatac cttcgactga 960
agagcatgat tggcgcaaag attacgttct atcgctcttc tctccttatt ttgataatcg 1020
aaagccgcac tactcagcgc agcagttcta catgtttttc taaaaatcta ccgggtcacc 1080
gctgacgcgc tgacggccgg taagcttcaa gctaaatttc aaaagttcca agtaacctgc 1140
agtcccaatc gggcaattcc gaagtgcgcc ggcatttacc gaagagtaac atgtgccctc 1200
tgattggttc ggatcgcggg ggctcctttc ccgctccgaa ttcacgcgac gggatcccgc 1260
cgcatctctc ctcttcaccg tcgtcgttga cgtccccgaa acacagaaat caccgaatca 1320
tgcaggcgct cacctccagg tcgttggctc gctcatcccg ctcgattcgt gctttctcca 1380
cctcatctgg aaggtggcag gctgagcccc tccagaagcc cgttctccag aaagaattca 1440
agatctatcg ttgggtgagc tgagacgctt gtatatccag atgtgttgct cacatcgcag 1500
cccagaatcc ggatgaacca gccaagaagc ctcatctcca atcgtacacc attgacttga 1560
accagacggg ccccatggta cgtacaattc caaggcgatt gtctctatgc tcacgggctc 1620
gtagattctg gacgctctta tcaagatcaa gaacgaaatc gatcctacgc tcacattccg 1680
tcgttcgtgt agagaaggga tttgcggctc gtgcgcgatg aatattgacg gacagaacac 1740
gttggcttgc ctgtgccgaa tcgaccgtaa cgctagcaag gacagcaaga tctacccttt 1800
gccgcacagt atgacatgtc tttcggctcc taatagcatt ggctgacggt cggttacagt 1860
gtacatcgtg aaagacctcg tacccgacct cacgcttttc tacaagcagt acaagtccat 1920
caagccatac ctgcagaacg acaatattcc cgagagggag cacctccagt cgccagagga 1980
ccgcaagaag ttggacggga tgtatgaatg catcctgtgc gcgtgctgca gcacatcgtg 2040
ccccagctat tggtggaacc aagatgagta tttgggaccg gctgctttga tggccgcgta 2100
taggtggatt gcggattcac gagtacgttg tatcctcgtc gctccattcg ctgaataagt 2160
tgacgtttcg taggatacat atggcgcaca acgcaaggag cacttccaga atgagatgag 2220
tttgttccgc tgcctcacca ttttcaattg t 2251
<210> 8
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcctcaccat tttcaattgt acgtcgcttt cgccttgata tggattcgct attaaacata 60
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agatcaagct cgcgcttgct actgagtaaa ccctagtcaa cagtcacgga tcaaaagcat 180
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<210> 9
<211> 2570
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
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atcaaaagca tcaagtcaga ggcagatatc tttcctgtag cagttcgcag ttctttccac 2460
ttcatcgtat ggtgtccatt gcaaacatct aatcatattc attctatcac atccacttgt 2520
tcctgagcca ctcttaaggt aggcatatcc ttggtctcac ttgcggtgct 2570

Claims (4)

1.一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体，其特征在于：将带有点突变的琥珀酸脱氢酶铁硫亚基的DNA片段连入质粒载体，记为pTSdi。
2.一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体的构建方法，包括：
(1)提取杏鲍菇单核菌丝全基因组DNA，检测DNA质量和浓度；
(2)在需要进行点突变的位置引入一对互补引物sdi2F和sdi1R；以提取的基因组DNA为模板，利用正向引物sdi1F和反向引物sdi1R扩增第一部分的DNA片段；以提取的基因组DNA为模板，利用正向引物sdi2F和反向引物sdi2R扩增第二部分的DNA片段；利用限制性内切酶MfeI消化两部分DNA片段，再采用T4连接酶将消化后的两部分DNA片段连接成完整DNA片段；
(3)将完整DNA片段通过TA载体连接，导入pGEM-Teasy质粒载体中，获得转化载体pTSdi。
3.根据权利要求2所述的一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)中的sdi1F的序列为：TCACGTCCTCAATAAGCGCTC；
sdi1R的序列为：ACAATTGAAAATGGTGAGGC；
sdi2F的序列为：GCCTCACCATTTTCAATTGT；
sdi2R的序列为：AGCACCGCAAGTGAGACCAA。
4.一种如权利要求1所述的杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体的应用，其特征在于：应用于携带外源基因进行杏鲍菇的遗传转化。
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