CN114410629B

CN114410629B - 巨核细胞条件性敲除tymp基因小鼠模型的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN114410629B
Application number: CN202210008011.9A
Authority: CN
Inventors: 接力刚; 杜红延; 张玉萍; 朱小彤; 刘丹丹
Original assignee: Southern Medical University; Southern Medical University Zhujiang Hospital
Current assignee: Southern Medical University; Southern Medical University Zhujiang Hospital
Priority date: 2022-01-05
Filing date: 2022-01-05
Publication date: 2024-07-26
Anticipated expiration: 2042-01-05
Also published as: CN114410629A

Abstract

本发明公开了巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型的构建方法及其应用，涉及生物技术领域。巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型的构建方法为基于CRISPR/Cas9系统特异性敲除巨噬细胞TYMP基因，敲除位点为TYMP基因的第2外显子序列上游和第4外显子序列下游。通过该方法构建的巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型能够存活五个月以上，在筛选抑制血小板活化相关药物和研究血栓和炎症相关疾病的分子机制方面具有很好的应用前景。

Description

巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型的构建方法及其应用。

背景技术

血小板活化是血栓形成和很多炎症性疾病的重要因素，且与脑梗死、冠心病、恶性肿瘤和系统性红斑狼疮等多种疾病密切相关。已有研究证明，TYMP基因与血小板活化密切相关，但是关于其基因表达产物的功能以及基因突变导致的血栓以及炎症性疾病的分子机制尚未阐明。因此，利用巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型研究血栓以及炎症相关疾病的分子机制能为相关疾病的诊断、治疗提供理论基础。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型，该巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型在筛选抑制血小板活化相关药物以及研究血栓和炎症相关疾病的分子机制中具有很好的应用前景。

本发明的第一个方面，提供巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

S1：设计并体外转录gRNA，同时对TYMP基因进行flox修饰，构建Donor DNA；

S2：将gRNA、Donor DNA和Cas9蛋白共同注射入小鼠受精卵后，将受精卵植入假孕母鼠子宫内，生产得到的F0代小鼠与野生型小鼠交配，得到的F1代条件性敲除TYMP基因的杂合子小鼠；

S3：然后将F1代条件性敲除TYMP基因的杂合子小鼠相互交配，得到F2代条件性敲除TYMP基因的纯合子小鼠；

S4：然后将F2代条件性敲除TYMP基因的纯合子小鼠与巨核细胞特异表达Cre的PF4-Cre鼠交配，得到F3代巨核细胞条件性敲除TYMP基因杂合子小鼠；

S5：然后将F3代巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠相互交配，得到F4代巨核细胞条件性敲除TYMP基因纯合子小鼠。

在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，对TYMP基因进行flox修饰具体为在TYMP基因的序列两端插入LoxP序列.

在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S1中，对TYMP基因进行flox修饰具体为在TYMP基因的第2-4外显子序列两端插入LoxP序列。

在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，所述gRNA包括gRNA1和gRNA2，其中所述gRNA1序列为如SEQ ID NO.1所示，所述gRNA2序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，所述CRISPR/Cas9技术中的Donor DNA的序列核苷酸序列为如SEQ ID NO.19所示。

在本发明的一些实施方式中，所述小鼠的筛选方法包括PCR、测序和Southernblot。

在本发明的一些实施方式中，筛选所述小鼠的方法包括PCR方法，所用的引物包括：F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4和F5/R5；

其中，F1序列为：5’-GTAACTTACCCCACCCCAGTTCT-3’(SEQ ID NO.3)；

R1序列为：5’-GTGGATTCGGACCAGTCTGA-3’(SEQ ID NO.4)；

F2序列为：5’-TTACAGACTGGAGCAATAACTTC-3’(SEQ ID NO.5)；

R2序列为：5’-CTGAGCGCAGGGCCGTCTAGGTG-3’(SEQ ID NO.6)；

F3序列为：5’-GATTTGTGAGGTCGAGAAATGGAA-3’(SEQ ID NO.7)；

R3序列为：5’-TCATTAACTTCTAGGGACGGACC-3(SEQ ID NO.8)；

F4序列为：5’-AGTGGTGTCTCAATATCCCTTACA-3’(SEQ ID NO.9)；

R4序列为：5’-GCACGAAGTTTCTGATATCTGCTTC-3’(SEQ ID NO.10)；

F5序列为：5’-ATCTGGGTTGAGGGAGTCACTGG-3’(SEQ ID NO.11)；

R5序列为：5’-GAGTCAGTATGGTTCTGATGGCT-3’(SEQ ID NO.12)。

在本发明的一些实施方式中，F1/R1或F2/R2或F3/R3的扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，65℃180s，33个循环；65℃10min。

在本发明的一些实施方式中，F4/R4或F5/R5的扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃35s，35个循环；72℃5min。

在本发明的一些实施方式中，筛选所述小鼠的方法包括Southern blot，所用的探针包括5’探针和3’探针；

其中，5’探针的序列如SEQ ID NO.21所示；

3’探针的序列如SEQ ID NO.22所示。

在本发明的一些实施方式中，筛选所述小鼠的方法包括Southern blot，所用5’探针的扩增引物为F6/R6，F6序列为：5’-CCAATTAGCCAGATAGCAGGTGGG-3’(SEQ ID NO.13)；

R6序列为：5’-TCCAAACCTTGCTCTTACAGGGTCTC-3’(SEQ ID NO.14)；

所用3’探针的扩增引物为F7/R7，F7序列为：5’-TTCTGGTCTTCGCAGCTTCAATCCT-3’(SEQ ID NO.15)；

R7序列为：5’-ATTGGATAGGGTAGGAGGGCTGGAAA-3’(SEQ ID NO.16)。

在本发明的一些实施方式中，F6/R6和F7/R7的扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃35s，35个循环；72℃5min。

在本发明的一些实施方式中，筛选F3代或F4代小鼠时，所述PCR的检测引物还包括F8和R8；

所述F8的序列为：5’-GAACGCACTGATTTCGACCA-3’(SEQ ID NO.17)；

R8的序列为：5’-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC-3’(SEQ ID NO.18)。

本发明的第二方面，提供一种CRISPR/Cas9系统在构建巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型中的应用，所述系统包含Cas9蛋白、序列如SEQ ID NO.l所示的gRNA1、序列如SEQ ID NO.2所示的gRNA2和序列如SEQ ID NO.19所示的Donor DNA。

本发明的第三方面，提供根据本发明第一方面所述的方法构建得到的巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型在筛选抑制血小板活化相关药物中的应用。

本发明的第四方面，提供根据本发明第一方面所述的方法构建得到的巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型在研究血栓和炎症相关疾病的分子机制中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述血栓和炎症相关疾病包括动脉粥样硬化、缺血性脑卒中、深静脉血栓形成、脓毒症和肾病综合征。

本发明的有益效果是：

本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以gRNA引导Cas9蛋白和donor DNA定点剪切并同源重组修复，在TYMP第2-4外显子的上游和下游分别插入LoxP位点，使得打靶成功率更高。本发明只特异性敲除巨核细胞的TYMP基因，使得构建得到的小鼠模型的存活率更高，存活率100％，存活周期长，可以存活五个月以上，能够有效保证实验的顺利进行。通过本发明巨核细胞特异性TYMP基因敲除小鼠模型的构建方法得到的巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型在筛选抑制血小板活化相关药物和研究血栓和炎症相关疾病的分子机制方面具有很好的应用前景。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例中小鼠基因型PCR鉴定的引物F1、R1、F2、R2、F3和R3的设计示意图。

图2为本发明实施例中小鼠基因型PCR鉴定的引物F4、R4、F5和R5设计示意图。

图3为本发明实施例中小鼠基因型Southern blot鉴定的酶切位点、5’探针和3’探针设计示意图。

图4为本发明实施例中F1/R1和F2/R2对F1代小鼠基因组的扩增结果。

图5为本发明实施例中F3/R3对F1代小鼠基因组的扩增产物的测序结果。

图6为本发明实施例中F1代小鼠基因型的Southern blot结果。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。

以下实施例中所使用的实验材料和试剂，如无特别说明，均为常规可从商业途径获得的耗材和试剂。

下述实施例中的C57BL6/N小鼠和巨核细胞特异表达Cre的PF4-Cre鼠由赛业生物公司提供。

本发明通过CRISPR/Cas9技术在TYMP基因第2-4外显子上游、下游插入LoxP序列，得到TYMP基因第2-4外显子两端均有LoxP位点的flox小鼠。根据Cre-LoxP系统原理，然后将flox小鼠与PF4-Cre鼠杂交，通过Cre重组酶敲除LoxP位点间的元件，以获得巨核细胞特异性TYMP基因敲除小鼠。

小鼠基因组提取方法

1)方式一：

采用TaKaRa Mini BEST Universal genomic DNA extraction kit(Ver.5.0_CodeNo.9765)获得高纯度的基因组DNA。具体步骤如下：

①剪取小鼠尾巴约3mm；

②向微量离心管中加入180μL缓冲液GL、20μL蛋白酶K、10μL RNaseA(为TaKaRaMini BEST Universal基因组DNA提取试剂盒提供)和步骤①中的小鼠尾巴，56℃孵育过夜；

③将步骤②中的微量离心管在微量离心机中，12,000rpm离心2min，取上清，弃沉淀；

④向步骤③中的上清中加入200μL Buffer GB(为TaKaRa Mini BEST Universal基因组DNA提取试剂盒提供)和200μL无水乙醇，充分混合后转入离心柱中(为TaKaRa MiniBEST Universal基因组DNA提取试剂盒提供)；

⑤将离心柱置于收集管中，12,000rpm离心2min，弃去收集管中的液体；

⑥向离心柱中加入500μL Buffer WA(为TaKaRa Mini BEST Universal基因组DNA提取试剂盒提供)，12,000rpm离心1分钟，弃去收集管中的液体；

⑦向离心柱中加入700μL Buffer WB(为TaKaRa Mini BEST Universal基因组DNA提取试剂盒提供)，12,000rpm离心1min，弃去收集管中的液体(注意：确保Buffer WB使用前已与无水乙醇按体积比3：7预混。将Buffer WB沿管壁加入，以洗掉收集管壁上残留的盐分)；

⑧重复步骤⑦；

⑨将离心柱置于收集管中，12,000rpm离心2min，弃去收集管中的液体；

⑩将离心柱转入新的1.5mL离心管中，在柱膜中心加入50-200μL无菌水或洗脱缓冲液，静置5min后，12,000rpm离心2min，1.5mL离心管底部的洗脱液即为洗脱下来的基因组DNA(注意：无菌水或洗脱缓冲液在使用前预加热至65℃，可提高基因组DNA的洗脱效率)；

向离心柱的柱膜中心加入步骤⑩中的洗脱液和/或50～200μL无菌水或洗脱缓冲液，静置5min后，12,000rpm离心2min，以增加DNA的产量，离心后1.5mL离心管底部的液体即为小鼠基因组DNA；

基因组DNA定量：洗脱得到的基因组DNA可以通过电泳定量。

2)方式二

一种低成本、粗提取基因组DNA的方法，具体步骤如下：

①剪取小鼠尾巴2-5mm；

②向微量离心管中加入步骤①中的小鼠尾巴和100μL鼠尾消化缓冲液，56℃孵育过夜；

③步骤②中的微量离心管转入98℃孵育13min，以使蛋白酶K变性；

④将微量离心管在微量离心机中15,000rpm离心15min，取上清液，上清液中即为粗提取的小鼠基因组DNA。

其中，鼠尾消化缓冲液包括50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH9.0)、0.1％TritonX-100和0.4mg/mL蛋白酶K。

巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型的构建

(1)F0代小鼠的构建和筛选：

基于CRISPR/Cas9技术，根据编码TYMP蛋白的外显子，定位TYMP基因的第2外显子上游和第4外显子下游并设计对应的gRNA，在其他位点不会出现与该位点高度同源的序列；同时设计含有LoxP位点的donor DNA载体(序列如SEQ ID NO.17所示)。

TYMP基因的gRNA的序列如下：

第2外显子上游的识别序列gRNA1(SEQ ID NO.1)：5’-ACTGGAGCAATGGCAGC TCC-3’；

第4外显子下游的识别序列gRNA2(SEQ ID NO.2)：5’-CTTTGATCGGGATCGTTA CT-3’；

Donor DNA的序列如下：

其中，加粗部分为LoxP位点，下划线部分为外显子区域，灰色背景区为cKO区，斜体部分为同源臂，第2外显子上游的同源臂包括Odf3b基因的第3-5外显子和非编码区、Tymp基因的第1外显子和非编码区、Tymp基因的第2外显子的非编码区，第4外显子下游的同源臂包括TYMP基因的第5-9外显子和Sco2基因5’端的部分非编码区，下游LoxP位点后的序列5’-GTCAGACTGGTCCGAATCCACAGTACTGAATTC-3’中，5’-GTCAGACTGGTCCGAATCCAC-3’是额外引入的鉴定引物序列，5’-AGTACT-3’是引入的ScaI酶切位点，5’-GAATTC-3’是引入的EcoRI酶切位点。

预测LoxP位点间的靶序列的核苷酸序列为：5’-ATGGCAGCTCCAGGGACACCACCTCCCTCGGCCTCAGGGGGAGGAGGTGGGGAGCCCAGGCAGCTGCCTGAGCTGATCCGCCTGAAGCGAGATGGAGGGCATCTGAGAGAAGCAGATATCAGAAACTTCGTGCACGCGGTGATAGATGGAAGAGCACAGGACACACAAATTGGTGTGTGGTAACTAGACCCCAACACCCCTTCCAGCTGCCCCATACGCACCTCAGGGATCCACAGTACCCCACCACCATCACGGCCCCAGAAAACTCAGACTGCGTGAACACCTCGCTCATTGTATCCATACTTAGGGGCCATGCTAATGGCCATTCGGCTGCAGGGAATGAACCTAGAAGAGACATCTGTGCTGACTCGGGCCCTTGCAGAGTCTGGGCAGCAACTGGAGTGGCCCAAAGCCTGGCACCAGCAGCTTGTTGACAAACACTCCACAGGAGGTGTGGGTGACAAGGTTAGCCTGGTTCTGGCACCTGCCCTGGCTGCATGCGGCTGTAAGGTTAGTGACCACGTCCTCTACAGACCTCTGACCCGCTCACAGGAACCTCCAACCCTCCAGCCTGGCTCAAAGCTCTCAAAGACAAAATCCAGGGCAGTCCCATCGCTCAATACACAAATTCCACCATGGAGTAGAGTTGCCTCTGTACCCAAGAGGACCCTTTAAGAGCTAGCAGGCCCCACAAAGAAAGAGCGGGGCCTTCCTCTTCCTGTCCTTCAGACTTGGGCCCCAGATGAGTGTGTGCCAACTCCTGACCTACTGACAAACTGCTCCCACCAAGTACAGTTTATCTTCCTTTCCACCAATTGGGCACCCTCATTAACTGTTTAAAAGACTCTAAAATAGCCGGGCGTGGTGGCGCACGCCTTTAATCCTAGCACTTGGGAGGCAGAGGCAGGCGGATTTCTGAGTTCTAGGCCAGCCTGGTCTACAAAGTGAGTTCCAGGACAGCCAGACCTACACAGAGAAACCCTGTCTCGAAAAACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACTCTAAAATATAACTGCTTTTTTAAAAGTAATTTCATATGAGGATAGGATAGGTTCTTAGTAGAGGATAGGTAAAATGAGGTTAAGGGCCTGCGTGGGGGCAGTCAGCATCCCTCTCCACCAGGTGCCAATGATCAGCGGCCGCAGTCTGGGACACACAGGGGGCACACTGGATAAGCTGGAATCGATTCCTGGGTTCGGTGTCACCCAGAGCCCAGAGCAGGTACAGGTGGGCCACTAACTGATCAATGATCTGGGTTGAGGGAGTCACTGGCCCGAATCACAGGATGATCAATGGACAGGTTATTTATCTGGGTCACTAATGAGAGAGAACATTGACTATTCAAAAGGTCATTGGTTGTAAATAGGCCTGGAGTCATCGAGAGAACTTTGATCGGGATCGT-3’(SEQ ID NO.20)。

将gRNA、Donor DNA载体和Cas9蛋白混合注射入从孕鼠体内取出的受精卵中，随后将上述受精卵移植入假孕小鼠子宫内，繁育出F0代小鼠。通过上述实施例的小鼠基因组提取方法来提取F0代小鼠基因组，并通过PCR和测序进行基因型鉴定。

(2)F1代小鼠的繁育和筛选：

将上述鉴定为阳性的F0代小鼠与野生型小鼠杂交，获得F1代小鼠。

F1代共出生6只小鼠，分别标记为62、63、64、65、66和68。通过PCR、测序和Southernblot进行基因型鉴定。

PCR鉴定使用的引物F1、R1、F2、R2、F3和R3的设计示意图如图1所示，F1/R1用于扩增LoxP片段的前段同源臂至TYMP基因第4外显子后段(含LoxP位点)，以验证LoxP片段的前段同源臂和TYMP基因条件性敲除区域是否正确；F2/R2用于扩增TYMP基因第2外显子前段(含LoxP位点)至LoxP片段的后段同源臂，以验证LoxP片段的后段同源臂和TYMP基因条件性敲除区域是否正确；F3用于测序验证F1/R1扩增得到的片段中的TYMP基因第2外显子前段LoxP位点序列是否正确，R3用于测序验证F2/R2扩增得到的片段中TYMP基因第4外显子后段LoxP位点序列是否正确，以验证靶序列两端LoxP位点插入是否在同一条染色体上。其中，对于LoxP位点插入正确的小鼠，F1/R1所扩增的基因序列长度为3.3kb，F2/R2所扩增的基因序列长度为3.3kb。F1/R1、F2/R2和F3/R3的具体序列如下：

F1：5’-GTAACTTACCCCACCCCAGTTCT-3’(SEQ ID NO.3)；

R1：5’-GTGGATTCGGACCAGTCTGA-3’(SEQ ID NO.4)；

F2：5’-TTACAGACTGGAGCAATAACTTC-3’(SEQ ID NO.5)；

R2：5’-CTGAGCGCAGGGCCGTCTAGGTG-3’(SEQ ID NO.6)；

F3：5’-GATTTGTGAGGTCGAGAAATGGAA-3’(SEQ ID NO.7)；

R3：5’-TCATTAACTTCTAGGGACGGACC-3(SEQ ID NO.8)；

F1/R1和F2/R2的PCR反应体系如下：

PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，65℃180s，33个循环；65℃10min。

此外，当小鼠基因组DNA不纯或没有足够的PCR延伸时间时，可以使用F4/R4和F5/R5对小鼠基因组按相应体系和程序扩增。其中，F4/R4和F5/R5的设计示意图如图2所示，F4/R4用于扩增包含上游LoxP位点和TYMP基因第2外显子5’端序列的基因片段，F5/R5用于扩增包含下游LoxP位点和LoxP片段后段同源臂5’端序列的基因片段。其中F4/R4和F5/R5的具体序列如下：

F4：5’-AGTGGTGTCTCAATATCCCTTACA-3’(SEQ ID NO.9)；

R4：5’-GCACGAAGTTTCTGATATCTGCTTC-3’(SEQ ID NO.10)；

F5：5’-ATCTGGGTTGAGGGAGTCACTGG-3’(SEQ ID NO.11)；

R5：5’-GAGTCAGTATGGTTCTGATGGCT-3’(SEQ ID NO.12)；

其中，对于F4/R4扩增的等位基因片段，LoxP位点插入成功的小鼠的等位基因长度为201bp，野生型小鼠为167bp，杂合子小鼠则可同时扩增到长度分别为167bp和201bp的基因序列；对于F5/R5扩增的等位基因片段，LoxP位点插入成功的小鼠的等位基因长度为325bp，野生型小鼠为258bp，杂合子小鼠则可同时扩增到长度分别为325bp和258bp的基因序列。按以下体系和程序扩增：

PCR反应体系如下：

PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃35s，35个循环；72℃5min。

此外，为进一步验证，还用ScaI限制性内切酶对小鼠基因组DNA进行酶切，随后进行Southern blot检测。Southern blot的实验策略如图3所示，与5’探针互补的序列为LoxP片段的前段同源臂上的一段序列，与3’探针互补的序列为LoxP片段的后段同源臂上的一段序列；如果为野生型小鼠，基因组经ScaI限制性内切酶酶切后得到一段能够与5’探针和3’探针同时互补杂交的基因片段；如果LoxP位点插入成功，基因组经ScaI限制性内切酶酶切后得到两段能够分别与5’探针和3’探针互补杂交的基因片段。其中，野生型小鼠基因组经酶切后得到的对应等位基因片段长度预期为9.16kb，LoxP位点插入成功的小鼠的两段等位基因片段长度分别为4.48kb(含与5’探针互补杂交的序列)和4.77kb(含与3’探针互补杂交的序列)。

其中，5’探针的序列为：5’探针的序列为：5’-CCAATTAGCCAGATAGCAGGTGGGGAAGAGCTTAAGTGGTGATTGGCCTTACCTTGACAAGTGCCGCCTACTGGGACAGCCCTATTTTTCCACTATTCCTAACCGTAATCCTGGACGGTGAACTGTCTCCTCTGTACCTAAGTCCACGCAGGACTGAGGGATAACAGGCTGGAACCGAGCCAGATCCAGAAAACTGGTAAAGGCCCCTGAATTGAATAGGTACTAGACGTGGGCGGGGGAGTGCGGGGTGGGGGGAGTGATTTGTGAGGTCGAGAAATGGAAGCCAGATGGGGTTGGGAATGGGACAGTGCTGGATAGAGAAAAACATGAGACTGGTGAGTGCCAGAGACCCTGTAAGAGCAAGGTTTGGA-3’(SEQ ID NO.21)；

3’探针的序列为：5’-TTCTGGTCTTCGCAGCTTCAATCCTCAGTAAGAAGGCCGTGGAGGGACTGTCCACTCTGGTGGTAGATGTTAAGTTTGGGGGAGCTGCAGTCTTCCCAGACCAGGAGAAGGCCCGAGAACTGGCAAAGATGTTGGTGAGCCGTGCTAGGCCACAGTGCCCTTTCTATGAAGGGACATGAGCCTCACATTCCGTCCTATCCCTGCCTCTGCCCACTCAACAGTCCTGGAAGAATAAAACGGCAATTCCTCTTTCCAGCCCTCCTACCCTATCCAAT-3’(SEQ ID NO.22)；

用于扩增5’探针和3’探针的引物序列如下(F6/R6用于扩增5’探针，F7/R7用于扩增3’探针)：

F6：5’-CCAATTAGCCAGATAGCAGGTGGG-3’(SEQ ID NO.13)；

R6：5’-TCCAAACCTTGCTCTTACAGGGTCTC-3’(SEQ ID NO.14)；

F7：5’-TTCTGGTCTTCGCAGCTTCAATCCT-3’(SEQ ID NO.15)；

R7：5’-ATTGGATAGGGTAGGAGGGCTGGAAA-3’(SEQ ID NO.16)。

使用PCR DIG探针标记试剂盒(Roche公司)进行探针标记，体系如下：

其中，正向引物为F6时，反向引物为R6；正向引物为F7时，反向引物为R7；

扩增程序为：95℃3min；95℃30s，60℃35s，72℃30s，35个循环；72℃5min。

PCR鉴定结果如图4所示(A：DNA标记(marker)；B：P1/R1对F1代小鼠基因组的扩增结果；C：P2/R2对F1代小鼠基因组的扩增结果；M为marker，WT为野生型)。

由图4可知，F1/R1和F2/R2均对62、63、64、65、66和68小鼠基因组扩增得到了大小约为3.3kb的基因片段。

图5为62号小鼠的测序结果，显示测序结果正确。

63、64、65、66和68号小鼠的测序结果同62号小鼠。

为进一步确定靶向的基因是否正确，对62、63、64和68号小鼠的基因组DNA进行Southern blot检测。

Southern blot检测鉴定结果如图6所示(A：5’探针对F1代小鼠基因组的Southernblot结果；B：3’探针对F1代小鼠基因组的Southern blot结果)。

由图6可知，62、63、64和68号小鼠的Southern blot结果均显示有大小约为4.48kb和4.77kb的条带，这表明LoxP位点成功正确插入62、63、64和68号小鼠基因组。

因此，62、63、64和68号小鼠为F1代阳性小鼠。

(3)F2代小鼠的繁育：

选取上述F1代阳性小鼠进行自交，获得可以稳定遗传的F2代条件性敲除TYMP基因的纯合子小鼠。参考上述实施例中F1代小鼠的鉴定方法进行鉴定。

(3)巨核细胞特异性TYMP基因敲除小鼠的获得：

将鉴定为阳性的F2代纯合子小鼠与PF4-Cre鼠交配，Cre重组酶识别F2代小鼠基因组中的LoxP位点并进行重组切割，获得F3代巨核细胞条件性敲除TYMP基因杂合子小鼠。采用上述实施例中的F3/R3、F4/R4和F5/R5对小鼠基因组进行扩增，以检验LoxP位点的插入情况。

其中，对于通过F3/R3扩增小鼠基因组得到的基因片段长度，Cre无活性的小鼠为445bp，而TYMP基因敲除成功的小鼠，无条带；对于通过F4/R4扩增小鼠基因组得到的基因片段长度，野生型小鼠为167bp，Cre无活性的小鼠为201bp，而TYMP基因敲除成功的小鼠，无条带；对于通过F5/R5扩增小鼠基因组得到的基因片段长度，野生型小鼠为258bp，Cre无活性的小鼠为325bp，而TYMP基因敲除成功的小鼠，无条带。

此外，通过引物F8/R8检测Cre转基因情况，其中F8/R8的具体序列如下：

F8：5’-GAACGCACTGATTTCGACCA-3’(SEQ ID NO.17)；

R8：5’-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC-3’(SEQ ID NO.18)；

F8/R8扩增得到的Cre基因片段的长度为204bp。

F8/R8的PCR反应体系和扩增程序同上述实施例中的F4/R4。

将鉴定为阳性的F3代巨核细胞条件性敲除TYMP基因杂合子小鼠进行自交，参考F3代小鼠的筛选方法，筛选得到F4代巨核细胞条件性敲除TYMP基因纯合子小鼠。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

序列表

<110> 南方医科大学珠江医院

南方医科大学

<120> 巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型的构建方法及其应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actggagcaa tggcagctcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctttgatcgg gatcgttact 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtaacttacc ccaccccagt tct 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtggattcgg accagtctga 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttacagactg gagcaataac ttc 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctgagcgcag ggccgtctag gtg 23

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gatttgtgag gtcgagaaat ggaa 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcattaactt ctagggacgg acc 23

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agtggtgtct caatatccct taca 24

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcacgaagtt tctgatatct gcttc 25

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atctgggttg agggagtcac tgg 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gagtcagtat ggttctgatg gct 23

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccaattagcc agatagcagg tggg 24

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tccaaacctt gctcttacag ggtctc 26

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttctggtctt cgcagcttca atcct 25

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

attggatagg gtaggagggc tggaaa 26

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaacgcactg atttcgacca 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gctaaccagc gttttcgttc 20

<210> 19

<211> 4888

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cccataggca ggtactaccc agaacgcgcg agaaatgtga cgtaccccag cgctcctcgg 60

cataccatcg ctccccgaaa ctggggcatc ctcgcaaagc aagaaacccc aggtgaggcc 120

tcaagggctg gatccagcac tagggacctt cctatacccc aacccgcagt ctgccgtaaa 180

ggcaaggaga ttggaccatt ggacctcttg ctgactcctc cttaggccct gggtcctaca 240

ccgtgccttc gctcttgggc tcacgagtca taagcaaagt ctcagcccca acttactcca 300

tctacagccg cagccctgtg ggcagctgct tcgaggacct cagcaaggtg gggaagggtc 360

tgcccgctgc atatgcagtc cctagtagtc aagagagtct gtgacgttgg gggtggtgca 420

gaactccagg cacctcacca ctcaggaaac tgaggcagga gttcaaagcc ggcctggggt 480

acatagtgag attttagctt gaggaaaaaa aaaaaaaaat cagctgatca caaggaacag 540

aggctgtacc cagcacccat cctgtcctcc ttagacccca ggcccttgtg cctaccacgt 600

agtgaatcct atgatctaca agactcgagc cccgcagttc acgatgctgg ggaggactct 660

gccaccccga gagaacacca agaagccagg acctgcatcc tacagcgtgg acaaggtggt 720

ctggagtcga gggtcaaggg gcaggggatg agggactgag gtctaaggca tgggtcaaag 780

tccccaggga aatggcatcc ctgtatgaag ccgaacagct ggctcggtaa ggtcagcctc 840

gtctccccga cccgcagcac cggaagcctt gtggctggag cttcgggatc agacactcag 900

actacctagc ccccatgata cagtaccacg tggacgactg atgcctgcaa gcacgcgcgc 960

acaggctctg ggttgtttac ttaaagcttt ctaagtcagt gctgtgtgtc tctctttctt 1020

tctccgaagc gggcaaggag gggtggggga ggagaggacg aggtgagttc gagcattgat 1080

tgtctcagtg gtatctgaac ctagagatct gtcgcttgcc tagagatctg tcgcacagga 1140

caagcagtgc tcgggaccca tagataccaa gaccccaggg aactgggcag agcgaactcc 1200

ggtccggagc gctgtaaccc gacccttaaa ggtcctggca atgccaatta gccagatagc 1260

aggtggggaa gagcttaagt ggtgattggc cttaccttga caagtgccgc ctactgggac 1320

agccctattt ttccactatt cctaaccgta atcctggacg gtgaactgtc tcctctgtac 1380

ctaagtccac gcaggactga gggataacag gctggaaccg agccagatcc agaaaactgg 1440

taaaggcccc tgaattgaat aggtactaga cgtgggcggg ggagtgcggg gtggggggag 1500

tgatttgtga ggtcgagaaa tggaagccag atggggttgg gaatgggaca gtgctggata 1560

gagaaaaaca tgagactggt gagtgccaga gaccctgtaa gagcaaggtt tggacaagtg 1620

accatggatt caaagacctg gatggggtgg aggtggggag ttccagtggt gtctcaatat 1680

cccttacaga ctggagcaat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atatggcagc 1740

tccagggaca ccacctccct cggcctcagg gggaggaggt ggggagccca ggcagctgcc 1800

tgagctgatc cgcctgaagc gagatggagg gcatctgaga gaagcagata tcagaaactt 1860

cgtgcacgcg gtgatagatg gaagagcaca ggacacacaa attggtgtgt ggtaactaga 1920

ccccaacacc ccttccagct gccccatacg cacctcaggg atccacagta ccccaccacc 1980

atcacggccc cagaaaactc agactgcgtg aacacctcgc tcattgtatc catacttagg 2040

ggccatgcta atggccattc ggctgcaggg aatgaaccta gaagagacat ctgtgctgac 2100

tcgggccctt gcagagtctg ggcagcaact ggagtggccc aaagcctggc accagcagct 2160

tgttgacaaa cactccacag gaggtgtggg tgacaaggtt agcctggttc tggcacctgc 2220

cctggctgca tgcggctgta aggttagtga ccacgtcctc tacagacctc tgacccgctc 2280

acaggaacct ccaaccctcc agcctggctc aaagctctca aagacaaaat ccagggcagt 2340

cccatcgctc aatacacaaa ttccaccatg gagtagagtt gcctctgtac ccaagaggac 2400

cctttaagag ctagcaggcc ccacaaagaa agagcggggc cttcctcttc ctgtccttca 2460

gacttgggcc ccagatgagt gtgtgccaac tcctgaccta ctgacaaact gctcccacca 2520

agtacagttt atcttccttt ccaccaattg ggcaccctca ttaactgttt aaaagactct 2580

aaaatagccg ggcgtggtgg cgcacgcctt taatcctagc acttgggagg cagaggcagg 2640

cggatttctg agttctaggc cagcctggtc tacaaagtga gttccaggac agccagacct 2700

acacagagaa accctgtctc gaaaaaccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagactc 2760

taaaatataa ctgctttttt aaaagtaatt tcatatgagg ataggatagg ttcttagtag 2820

aggataggta aaatgaggtt aagggcctgc gtgggggcag tcagcatccc tctccaccag 2880

gtgccaatga tcagcggccg cagtctggga cacacagggg gcacactgga taagctggaa 2940

tcgattcctg ggttcggtgt cacccagagc ccagagcagg tacaggtggg ccactaactg 3000

atcaatgatc tgggttgagg gagtcactgg cccgaatcac aggatgatca atggacaggt 3060

tatttatctg ggtcactaat gagagagaac attgactatt caaaaggtca ttggttgtaa 3120

ataggcctgg agtcatcgag agaactttga tcgggatcgt ataacttcgt atagcataca 3180

ttatacgaag ttatgtcaga ctggtccgaa tccacagtac tgaattctac ttgggaacag 3240

ggagaagcca ctgattagct ggtacgcatt aatgtgtctg tcataactaa tcgggatcct 3300

tggtaggtta gccatcagaa ccatactgac tctcgctggc catgttttga acttctgttg 3360

ggtcagtggt cagggccagt gggtgggtcc gtccctagaa gttaatgaag gtgtctgagc 3420

agatgctgca catccttgag gaagtcggct gctgcattgt cggccagagt gcaaagctgg 3480

ttcctgctga tgggatcctg tatgctgcac gagatgtgac agccactgtg gacagtgtcc 3540

cactcattac aggtgacctg aaacggggta ccctgactga cagacagtcc gctaggcact 3600

gccgcttttc tcagagaggc aactcttcct gtgcccaagt ataccctggg atgatgtttc 3660

tggtcttcgc agcttcaatc ctcagtaaga aggccgtgga gggactgtcc actctggtgg 3720

tagatgttaa gtttggggga gctgcagtct tcccagacca ggagaaggcc cgagaactgg 3780

caaagatgtt ggtgagccgt gctaggccac agtgcccttt ctatgaaggg acatgagcct 3840

cacattccgt cctatccctg cctctgccca ctcaacagtc ctggaagaat aaaacggcaa 3900

ttcctctttc cagccctcct accctatcca atcaaagctg tcctgactgc ggacctgggg 3960

aaatcctcca cagaaccccc gccacttagg gcaaccaacc agaacacccc catcccctct 4020

gaggcctggc agtgttggtt tctgatctct aacctaagcc tttactgaca ccttaaccca 4080

gggacagcag gtatgggatt tgataatgcc ggatactgaa taatgcctcc ccaggttaga 4140

gtgggagtga gcctggggct gaaggtcgcc gcagccctga ccgccatgga taaccctctg 4200

ggccgcagcg tgggccatac cctggaggtg gaagaagcgt tgctttgcct ggatggtgcg 4260

gggccgccgg atctgcggga cctggtcatt aggctaggtg agagggctgg agttaagacc 4320

accagtttgt atgccaggag ctctcaatcc ctgcagcttc tgagctccac cccgcccgcc 4380

agcaggaggc gccattcttt ggattagcgg acaggcggaa acacaagacc aaggcgccgc 4440

ccgagtggcc gcggcgttgg atgacggctc cgcgcggcgc cgcttccagc tgatgctttc 4500

ggcgcagggc gtggaccccg gcctagctaa agcattgtgc tccgggagcc ccacgcaacg 4560

ccggcagctg ctgcctcacg cccgagagca agaggagctg ctcgcaccgg cagacggtga 4620

gaccggatat caacggcacc agatcccacc cacttcctct cccgatcttt cctggtcctg 4680

gcacgtgcct ccagtaggtt ctcagtgtcc accctctccc ttaggcattg ttgagtgcgt 4740

ccgagcgctg ccgctggccc gtgtgctgca cgacctcgga gccggacgca gccgagcggg 4800

gcagccgatc agaccgggag tgggtgccga ggtactggtc gacgtgggcc agtgtttgtc 4860

ccgaggtaag cgctgtctgg aatccata 4888

<210> 20

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atggcagctc cagggacacc acctccctcg gcctcagggg gaggaggtgg ggagcccagg 60

cagctgcctg agctgatccg cctgaagcga gatggagggc atctgagaga agcagatatc 120

agaaacttcg tgcacgcggt gatagatgga agagcacagg acacacaaat tggtgtgtgg 180

taactagacc ccaacacccc ttccagctgc cccatacgca cctcagggat ccacagtacc 240

ccaccaccat cacggcccca gaaaactcag actgcgtgaa cacctcgctc attgtatcca 300

tacttagggg ccatgctaat ggccattcgg ctgcagggaa tgaacctaga agagacatct 360

gtgctgactc gggcccttgc agagtctggg cagcaactgg agtggcccaa agcctggcac 420

cagcagcttg ttgacaaaca ctccacagga ggtgtgggtg acaaggttag cctggttctg 480

gcacctgccc tggctgcatg cggctgtaag gttagtgacc acgtcctcta cagacctctg 540

acccgctcac aggaacctcc aaccctccag cctggctcaa agctctcaaa gacaaaatcc 600

agggcagtcc catcgctcaa tacacaaatt ccaccatgga gtagagttgc ctctgtaccc 660

aagaggaccc tttaagagct agcaggcccc acaaagaaag agcggggcct tcctcttcct 720

gtccttcaga cttgggcccc agatgagtgt gtgccaactc ctgacctact gacaaactgc 780

tcccaccaag tacagtttat cttcctttcc accaattggg caccctcatt aactgtttaa 840

aagactctaa aatagccggg cgtggtggcg cacgccttta atcctagcac ttgggaggca 900

gaggcaggcg gatttctgag ttctaggcca gcctggtcta caaagtgagt tccaggacag 960

ccagacctac acagagaaac cctgtctcga aaaaccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020

aaagactcta aaatataact gcttttttaa aagtaatttc atatgaggat aggataggtt 1080

cttagtagag gataggtaaa atgaggttaa gggcctgcgt gggggcagtc agcatccctc 1140

tccaccaggt gccaatgatc agcggccgca gtctgggaca cacagggggc acactggata 1200

agctggaatc gattcctggg ttcggtgtca cccagagccc agagcaggta caggtgggcc 1260

actaactgat caatgatctg ggttgaggga gtcactggcc cgaatcacag gatgatcaat 1320

ggacaggtta tttatctggg tcactaatga gagagaacat tgactattca aaaggtcatt 1380

ggttgtaaat aggcctggag tcatcgagag aactttgatc gggatcgt 1428

<210> 21

<211> 371

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccaattagcc agatagcagg tggggaagag cttaagtggt gattggcctt accttgacaa 60

gtgccgccta ctgggacagc cctatttttc cactattcct aaccgtaatc ctggacggtg 120

aactgtctcc tctgtaccta agtccacgca ggactgaggg ataacaggct ggaaccgagc 180

cagatccaga aaactggtaa aggcccctga attgaatagg tactagacgt gggcggggga 240

gtgcggggtg gggggagtga tttgtgaggt cgagaaatgg aagccagatg gggttgggaa 300

tgggacagtg ctggatagag aaaaacatga gactggtgag tgccagagac cctgtaagag 360

caaggtttgg a 371

<210> 22

<211> 275

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ttctggtctt cgcagcttca atcctcagta agaaggccgt ggagggactg tccactctgg 60

tggtagatgt taagtttggg ggagctgcag tcttcccaga ccaggagaag gcccgagaac 120

tggcaaagat gttggtgagc cgtgctaggc cacagtgccc tttctatgaa gggacatgag 180

cctcacattc cgtcctatcc ctgcctctgc ccactcaaca gtcctggaag aataaaacgg 240

caattcctct ttccagccct cctaccctat ccaat 275

Claims

1.巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1中，对TYMP基因进行flox修饰具体为在TYMP基因的第2-4外显子序列两端插入LoxP序列；步骤S1中，所述gRNA包括gRNA1和gRNA2；其中，所述gRNA1序列如SEQ ID NO.l所示，所述gRNA2序列如SEQ ID NO.2所示；步骤S1中，所述Donor DNA的序列核苷酸序列如SEQID NO.19所示；

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，筛选所述小鼠的方法包括PCR方法，所用的引物包括：F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4和F5/R5；

其中，所述F1序列如SEQ ID NO.3所示；所述R1序列如SEQ ID NO.4所示；所述F2序列如SEQ ID NO.5所示；所述R2序列如SEQ ID NO.6所示；所述F3序列如SEQ ID NO.7所示；所述R3序列如SEQ ID NO.8所示；F4序列如SEQ ID NO.9所示；R4序列如SEQ ID NO.10所示；F5序列如SEQ ID NO.11所示；R5序列如SEQ ID NO.12所示。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，筛选所述小鼠的方法包括Southernblot，所用的探针包括5’探针和3’探针；

其中，5’探针的序列为如SEQ ID NO.21所示；

3’探针的序列为如SEQ ID NO.22所示。

4.一种CRISPR/Cas9系统在构建巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型中的应用，其特征在于，所述系统包含Cas9蛋白、序列如SEQ ID NO.l所示的gRNA1、序列如SEQ ID NO.2所示的gRNA2和序列如SEQ ID NO.19所示的Donor DNA。