CN114410474B

CN114410474B - 一种简单高效制备葛仙米类菌胞素氨基酸粗品的方法

Info

Publication number: CN114410474B
Application number: CN202111502960.4A
Authority: CN
Inventors: 陈珍; 陈雄文; 李伟智; 徐魁; 金艳霞; 冯海; 袁祖汶; 罗唯欣; 邬珣
Original assignee: Hubei Normal University
Current assignee: Hubei Normal University
Priority date: 2021-12-09
Filing date: 2021-12-09
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2041-12-09
Also published as: CN114410474A

Abstract

本发明提供了一种简单高效制备葛仙米类菌胞素氨基酸(MAAs)粗品的方法，包括葛仙米藻殖段种质制备、获得直径约1mm葛仙米、定向诱导葛仙米MAAs高效合成、培养、采收葛仙米、获得MAAs粗品等步骤。本发明利用紫外A/B剂量梯度长期辐照和一定比例甲醇低温浸提等创新性方法，能诱导葛仙米MAAs高效合成，显著提高其MAAs产率，且该发明提取步骤简单，成本低，葛仙米MAAs稳定性好。当使用本发明设计的特定微藻光生物反应器进行定向诱导葛仙米MAAs高效合成时，效果更好。本发明具有广阔的应用前景。

Description

一种简单高效制备葛仙米类菌胞素氨基酸粗品的方法

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种简单高效制备葛仙米类菌胞素氨基酸粗品的方法。

【背景技术】

类菌胞素氨基酸(mycosporine-like amino acids，MAAs)是一种无色、分子量低(<400Da)的水溶性物质，由核心骨架环己烯酮与不同类型氨基酸缩合而成，通常在309-362nm紫外光区有光吸收峰。该物质具有高效抗紫外和抗氧化特性，以及抗黑色素肿瘤增值、抗乳腺癌细胞增值等活性，在护肤品开发和医疗保健领域具有良好的应用前景。它在蓝藻、真核藻类、海洋细菌和真菌等中合成，广泛存在于水生生物中。目前已发现超过40种的MAAs，其种类多样性主要是由于核心骨架环己烯酮C3和C1位置取代基团不同造成，不同取代基团也促成了紫外吸收波长的多样性。目前少数蓝藻中存在寡糖修饰的MAAs，该MAAs具有更高稳定性，在防晒霜等护肤品开发方面具有更大应用潜力。

葛仙米属蓝藻门念珠藻属，学名为拟球状念珠藻，拉丁文为Nostoc sphaeroides。它由许多念珠状藻丝包埋于凝胶状多糖基质中，形成直径可达2cm的墨绿色拟球状原植体。该藻具有1700多年的食用和药用历史，在《本草纲目拾遗》和《药性考》等医学专著中均有记载，其主要营养成分具有抗氧化、抑癌等药理活性，是一种极具开发利用价值的特色低等藻类植物。葛仙米主要分布于我国湖北省鹤峰县走马镇周围的水稻田中，对关键生态因子紫外辐射具有较强耐受性。申请者发现葛仙米在紫外光区具有光吸收峰，且其基因组存在MAAs合成基因簇，并初步鉴定该紫外吸收物质为糖基化MAAs。如何提高葛仙米MAAs的生产能力，以及如何简单高效制备葛仙米MAAs粗品，亟待进一步探究。

目前类菌孢素氨基酸的制备方法在发菜、紫菜、麒麟菜和南极磷虾等生物材料中已有报道，如中国专利文献CN105684880B公布了一种可提高脐型紫菜中类菌胞素氨基酸含量的培养方法，利用紫外灯、紫光灯、绿光灯、黄光灯等不同光质光源培养紫菜，采用氨基酸分析仪和UHPLC法制备紫菜MAAs；中国专利文献CN104887615B公布了一种制备发菜细胞类菌胞素氨基酸粗品的方法，对发菜种子液先进行短期紫外辐射处理，然后利用低盐胁迫长期诱导培养，最后利用微波破壁、氯仿去除色素等方法制备MAAs粗品；中国专利文献CN105037201B公布了一种从南极磷虾中提取类菌胞素氨基酸的方法，利用离子交换柱层析法制备南极磷虾MAAs。由前期专利文献报道可知，根据不同生物材料特性，提高MAAs含量的方法有不同光质光源照射、短期紫外辐照、低盐诱导处理等方法，MAAs提取方法有超声波破壁、氯仿去除色素、高效液相色谱分离或离子交换树脂分离等。因为不同生物材料的生长特性不同，其MAAs种类和物理化学性质也各有差异，导致不同生物材料MAAs的定向诱导和制备方法不同。因此，目前已公布的MAAs制备方法是根据不同生物材料特性而设计，不存在普适性，定向诱导MAAs方法功效不甚明确，产量不高，提取步骤繁琐，对设备要求高，成本高，MAAs稳定性差，不适于规模化生产。

本发明根据葛仙米耐紫外辐射特性，及其所含MAAs具有寡糖基团修饰等特征，建立一种简单高效制备葛仙米类菌胞素氨基酸粗品的方法。

【发明内容】

本发明的目的是克服现有技术的上述缺陷，根据葛仙米生长特性及其所含类菌胞素氨基酸理化特性，提供一种简单高效、操作方便、成本低，能满足规模化制备葛仙米类菌胞素氨基酸粗品的方法。

为实现上述技术目的，本发明提供了一种简单高效制备葛仙米类菌胞素氨基酸(MAAs)粗品的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)、葛仙米藻殖段种质制备：将生长旺盛的葛仙米，利用无菌水清洗干净后，置于新鲜BG11₀培养液中，在生长光强为50μmol photons m^-2s^-1的条件下通气培养10-12天，转到5-10μmol photons m^-2s^-1的弱光下静置3-7天，获得葛仙米藻殖段；

2)、在装有BG11₀培养液的石英锥形瓶中，按20-40μg叶绿素a/L浓度接种葛仙米藻殖段，在20-30μmol photons m^-2s^-1可见光+0.05-0.1Wm^-2 UV-B或者20-30μmol photons m^- ²s^-1可见光+5-10Wm^-2 UV-A条件下，通入无菌空气，让藻丝充分悬浮，培养一个月，获得直径约1mm葛仙米；

3)、将步骤2)获得的直径约1mm葛仙米，按照20g鲜重/L的密度接种于装有BG11₀培养基的培养装置中，在20-30μmol photons m^-2s^-1可见光+0.4-0.5Wm^-2 UV-B或者20-30μmolphotons m^-2s^-1可见光+10-15Wm^-2 UV-A条件下，充分通气培养，每隔20天更换一次BG11₀培养基，2-3月后，形成直径4-7mm葛仙米；

4)、将步骤3)形成的的直径4-7mm葛仙米在20-30μmol photons m^-2s^-1可见光+1-1.5Wm^-2 UV-B或者20-30μmol photons m^-2s^-1可见光+15-20Wm^-2 UV-A条件下通气培养3天，采收鲜品备用，或将鲜品制成干品后低温储存备用；

5)、取步骤取4)获得的鲜品或干品回复吸水6-10h后，按照料液比1g:10-15ml加入体积百分比浓度60％的甲醇，0-4℃浸提10-24h，过滤，取无色滤液，35℃旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥，获得MAAs粗品。

优选地，步骤2)所述的培养条件为20μmol photons m^-2s^-1可见光+0.06Wm^-2UV-B或者25μmol photons m^-2s^-1可见光+8Wm^-2 UV-A，步骤3)所述的培养条件为20μmol photonsm^-2s^-1可见光+0.4Wm^-2 UV-B或者25μmol photons m^-2s^-1可见光+10Wm^-2 UV-A，步骤4)所述的培养条件为20μmol photons m^-2s^-1可见光+1.2Wm^-2 UV-B或者25μmol photons m^-2s^-1可见光+16Wm^-2 UV-A，步骤4)所述的低温储存为4℃储存。

优选地，步骤3)所述的培养装置为定向诱导葛仙米MAAs高效合成的光生物反应器，该定向诱导葛仙米MAAs高效合成的光生物反应器包括安装有紫外A/B灯管1的上层灯架2、安装有LED日光灯灯管5的侧面灯架3，还包括无色有机玻璃缸4，在所述无色有机玻璃缸4的靠近最上方的壁上，设置有进水口8和通气管9，所述通气管9一直通到所述无色有机玻璃缸4内底部，在所述无色有机玻璃缸4的靠近底面的壁上，设置有出水口7，所述出水口7处设置有滤藻网6。

优选地，所述出水口7位于滤藻网6中央。

本发明的有益效果是：通过设计特定微藻光生物反应器，利用紫外A/B剂量梯度长期辐照和一定比例甲醇低温浸提等创新性方法，能诱导葛仙米MAAs高效合成，显著提高其MAAs产率，且该发明提取步骤简单，成本低，葛仙米MAAs稳定性好。

【附图说明】

图1为定向诱导葛仙米MAAs高效合成的光生物反应器结构示意图；

图2为定向诱导葛仙米MAAs高效合成的光生物反应器左视图；

图3为无色有机玻璃缸主视图；

图4为无色有机玻璃缸左视图；

图5为无色有机玻璃缸结构示意图。

【具体实施方式】

现结合附图和实施例详细说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中，所述的BG11₀培养液为常规蓝藻培养基BG11₀(即不添加氮源的蓝藻BG11培养基)，配制方法为先配制出母液(1000×)：A溶液：20g/L碳酸钠溶液，B溶液：75g/L硫酸镁溶液，C溶液：25g/L氯化钙溶液，D溶液：柠檬酸6g/L+柠檬酸铁铵6g/L+Na2-EDTA 1g/L；E溶液即微量元素A₅溶液。在配制新鲜培养基时，各种母液按照1:1000稀释加入。

以下实施例均通过定向诱导葛仙米MAAs高效合成的光生物反应器实现。所述定向诱导葛仙米MAAs高效合成的光生物反应器的结构和尺寸如图1-5所示，包括安装有辐照强度可调的紫外A/B灯管1的上层灯架2、安装有LED日光灯灯管5的侧面灯架3，还包括无色有机玻璃缸4，在所述无色有机玻璃缸4的靠近最上方的壁上，设置有进水口8和通气管9，所述通气管9一直通到所述无色有机玻璃缸4内底部，在所述无色有机玻璃缸4的靠近底面的壁上，设置有出水口7，所述出水口7处设置有滤藻网6，出水口7位于滤藻网6中央，以保证水从出水口7处放出时无色有机玻璃缸4中的藻仍被留置在无色有机玻璃缸4中。图中的尺寸数据单位为毫米。

以下实施例中所述常规培养葛仙米方法均为每个实施例中的方法除去紫外处理。

实施例一

1)、葛仙米藻殖段种质制备：将生长旺盛的葛仙米，利用无菌水清洗干净后，置于新鲜BG11₀培养液中，在生长光强为50μmol photons m^-2s^-1的条件下通气培养10天，转到5μmol photons m^-2s^-1的弱光下静置6天，可获得大量藻殖段。

2)、在装有600mL BG11₀培养液的石英锥形瓶中，按20μg叶绿素a/L浓度接种葛仙米藻殖段，在20μmol photons m^-2s^-1可见光+0.05Wm^-2 UV-B条件下，通入无菌空气，让藻丝充分悬浮，培养一个月，可形成直径约1mm葛仙米。

3)、将2)培养的直径约1mm葛仙米，按照20g鲜重/L的密度接种于上述定向诱导葛仙米MAAs高效合成的光生物反应器中，在20μmol photons m^-2s^-1可见光+0.4Wm^-2 UV-B条件下，充分通气培养，每隔20天更换一次BG11₀培养基，2月后，可形成直径4-7mm葛仙米。

4)、将3)培养的直径4-7mm葛仙米在20μmol photons m^-2s^-1可见光+1Wm^-2 UV-B下通气培养3天，然后采收鲜品备用，或将其自然晾干后低温储存备用。

5)、取4)培养的3kg葛仙米鲜品(相当于100g干品)，按照料液比1:15(克：毫升)加入体积百分比浓度60％的甲醇，2℃浸提10h，过滤，取无色滤液，35℃旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥，可获得6.8克MAAs粗品，相对于干品而言其得率为6.8％，其MAAs含量比常规培养葛仙米(没有采取紫外-A/B剂量梯度长期辐照法，得率5％)显著高36％。

实施例二

1)、葛仙米藻殖段种质制备：将生长旺盛的葛仙米，利用无菌水清洗干净后，置于新鲜BG11₀培养液中，在生长光强为50μmol photons m^-2s^-1的条件下通气培养12天，转到10μmol photons m^-2s^-1的弱光下静置3天，可获得大量藻殖段。

2)、在装有600mL BG11₀培养液的石英锥形瓶中，按40μg叶绿素a/L浓度接种葛仙米藻殖段，在25μmol photons m^-2s^-1可见光+0.07Wm^-2 UV-B条件下，通入无菌空气，让藻丝充分悬浮，培养一个月，可形成直径约1mm葛仙米。

3)、将2)培养的直径约1mm葛仙米，按照20g鲜重/L的密度接种于上述定向诱导葛仙米MAAs高效合成的光生物反应器中，在25μmol photons m^-2s^-1可见光+0.45Wm^-2 UV-B条件下，充分通气培养，每隔20天更换一次BG11₀培养基，3月后，可形成直径4-7mm葛仙米。

4)、将3)培养的直径4-7mm葛仙米在25μmol photons m^-2s^-1可见光+1.2Wm^-2 UV-B下通气培养3天，然后采收鲜品备用，或将其自然晾干后低温储存备用。

5)、取4)培养的100g葛仙米干品回复吸水6h后，按照料液比1:10(克：毫升)加入体积百分比浓度60％的甲醇，3℃浸提24h，过滤，取无色滤液，35℃旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥，可获得7.3克MAAs粗品，相对于干品而言其得率为7.3％，其MAAs含量比常规培养葛仙米(没有采取紫外-A/B剂量梯度长期辐照法，得率5.2％)显著高40％。

实施例三

1)、葛仙米藻殖段种质制备：将生长旺盛的葛仙米，利用无菌水清洗干净后，置于新鲜BG11₀培养液中，在生长光强为50μmol photons m^-2s^-1的条件下通气培养11天，转到8μmol photons m^-2s^-1的弱光下静置5天，可获得大量藻殖段。

2)、在装有600mL BG11₀培养液的石英锥形瓶中，按40μg叶绿素a/L浓度接种葛仙米藻殖段，在30μmol photons m^-2s^-1可见光+0.1Wm^-2 UV-B条件下，通入无菌空气，让藻丝充分悬浮，培养一个月，可形成直径约1mm葛仙米。

3)、将2)培养的直径约1mm葛仙米，按照20g鲜重/L的密度接种于上述定向诱导葛仙米MAAs高效合成的光生物反应器中，在30μmol photons m^-2s^-1可见光+0.5Wm^-2 UV-B条件下，充分通气培养，每隔20天更换一次BG11₀培养基，3月后，可形成直径4-7mm葛仙米。

4)、将3)培养的直径4-7mm葛仙米在30μmol photons m^-2s^-1可见光+1.5Wm^-2 UV-B下通气培养3天，然后采收鲜品备用，或将其自然晾干后低温储存备用。

5)、取4)培养的100g葛仙米干品回复吸水10h后，按照料液比1:12(克：毫升)加入体积百分比浓度60％的甲醇，4℃浸提16h，过滤，取无色滤液，35℃旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥，可获得8克MAAs粗品，相对于干品而言其得率为8％，其MAAs含量比常规培养葛仙米(没有采取紫外-A/B剂量梯度长期辐照法，得率5.5％)显著高45％。

实施例四

1)、葛仙米藻殖段种质制备：将生长旺盛的葛仙米，利用无菌水清洗干净后，置于新鲜BG11₀培养液中，在生长光强为50μmol photons m^-2s^-1的条件下通气培养10天，转到10μmol photons m^-2s^-1的弱光下静置3天，可获得大量藻殖段。

2)、在装有600mL BG11₀培养液的石英锥形瓶中，按照约25μg叶绿素a/L浓度接种葛仙米藻殖段，在20μmol photons m^-2s^-1可见光+5Wm^-2 UV-A条件下，通入无菌空气，让藻丝充分悬浮，培养一个月，可形成直径约1mm葛仙米。

3)、将2)培养的直径约1mm葛仙米，按照20g鲜重/L密度接种于上述定向诱导葛仙米MAAs高效合成的光生物反应器中，在20μmol photons m^-2s^-1可见光+10Wm^-2 UV-A条件下，充分通气培养，每隔20天更换一次BG11₀培养基，3月后，可形成直径4-7mm葛仙米。

4)、将3)培养的直径4-7mm葛仙米置于20μmol photons m^-2s^-1可见光+15Wm^-2 UV-A条件下通气培养3天，然后采收鲜品备用，或将其自然晾干后低温储存备用。

5)、取4)培养的100g葛仙米干品回复吸水6h后，按照料液比1:15(克：毫升)加入体积百分比浓度60％的甲醇，2℃浸提10h，过滤，取无色滤液，35℃旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥，获得6克MAAs粗品，相对于干品而言其得率为6％，其MAAs含量比常规培养葛仙米(没有采取紫外-A/B剂量梯度长期辐照法，得率4.5％)显著高出33％。

实施例五

1)、葛仙米藻殖段种质制备：将生长旺盛的葛仙米，利用无菌水清洗干净后，置于新鲜BG11₀培养液中，在生长光强为50μmol photons m^-2s^-1的条件下通气培养12天，转到5μmol photons m^-2s^-1的弱光下静置7天，可获得大量藻殖段。

2)、在装有600mL BG11₀培养液的石英锥形瓶中，按照约30μg叶绿素a/L浓度接种葛仙米藻殖段，在25μmol photons m^-2s^-1可见光+8Wm^-2 UV-A条件下，通入无菌空气，让藻丝充分悬浮，培养一个月，可形成直径约1mm葛仙米。

3)、将2)培养的直径约1mm葛仙米，按照20g鲜重/L密度接种于上述定向诱导葛仙米MAAs高效合成的光生物反应器中，在25μmol photons m^-2s^-1可见光+12Wm^-2 UV-A条件下，充分通气培养，每隔20天更换一次BG11₀培养基，2月后，可形成直径4-7mm葛仙米。

4)、将3)培养的直径4-7mm葛仙米置于25μmol photons m^-2s^-1可见光+18Wm^-2 UV-A条件下通气培养3天，然后采收鲜品备用，或将其自然晾干后低温储存备用。

5)、取4)培养的3kg葛仙米鲜品(相当于100g干品)，按照料液比1:10(克：毫升)加入体积百分比浓度60％的甲醇，3℃浸提24h，过滤，取无色滤液，35℃旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥，获得6.5克MAAs粗品，相对于干品而言其得率为6.5％，其MAAs含量比常规培养葛仙米(没有采取紫外-A/B剂量梯度长期辐照法，得率4.8％)显著高出36％。

实施例六

1)、葛仙米藻殖段种质制备：将生长旺盛的葛仙米，利用无菌水清洗干净后，置于新鲜BG11₀培养液中，在生长光强为50μmol photons m^-2s^-1的条件下通气培养11天，转到8μmol photons m^-2s^-1的弱光下静置4天，可获得大量藻殖段。

2)、在装有600mL BG11₀培养液的石英锥形瓶中，按照约30μg叶绿素a/L浓度接种葛仙米藻殖段，在30μmol photons m^-2s^-1可见光+10Wm^-2 UV-A条件下，通入无菌空气，让藻丝充分悬浮，培养一个月，可形成直径约1mm葛仙米。

3)、将2)培养的直径约1mm葛仙米，按照20g鲜重/L密度接种于上述定向诱导葛仙米MAAs高效合成的光生物反应器中，在30μmol photons m^-2s^-1可见光+15Wm^-2 UV-A条件下，充分通气培养，每隔20天更换一次BG11₀培养基，3月后，可形成直径4-7mm葛仙米。

4)、将3)培养的直径4-7mm葛仙米置于30μmol photons m^-2s^-1可见光+20Wm^-2 UV-A条件下通气培养3天，然后采收鲜品备用，或将其自然晾干后低温储存备用。

5)、取4)培养的100g葛仙米干品回复吸水8h后，按照料液比1:12(克：毫升)加入体积百分比浓度60％的甲醇，4℃浸提18h，过滤，取无色滤液，35℃旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥，获得7.3克MAAs粗品，相对于干品而言其得率为7.3％，其MAAs含量比常规培养葛仙米(没有采取紫外-A/B剂量梯度长期辐照法，得率5.2％)显著高出41％。

Claims

1.一种制备葛仙米类菌胞素氨基酸粗品的方法，其特征在于包括如下步骤：

2)、在装有BG11₀培养液的石英锥形瓶中，按20-40μg叶绿素a/L浓度接种葛仙米藻殖段，在20-30μmol photons m^-2s^-1可见光+0.05-0.1Wm^-2 UV-B或者20-30μmol photons m^-2s^-1可见光+5-10Wm^-2 UV-A条件下，通入无菌空气，让藻丝充分悬浮，培养一个月，获得直径约1mm葛仙米；

4)、将步骤3)形成的直径4-7mm葛仙米在20-30μmol photons m^-2s^-1可见光+1-1.5Wm^-2UV-B或者20-30μmol photons m^-2s^-1可见光+15-20Wm^-2 UV-A条件下通气培养3天，采收鲜品备用，或将鲜品制成干品后低温储存备用；

5)、取步骤4)获得的鲜品或干品回复吸水6-10h后，按照料液比1g:10-15ml加入体积百分比浓度60％的甲醇，0-4℃浸提10-24h，过滤，取无色滤液，35℃旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥，获得MAAs粗品。

2.如权利要求1所述的一种制备葛仙米类菌胞素氨基酸粗品的方法，其特征在于：步骤2)所述的培养条件为20μmol photons m^-2s^-1可见光+0.06Wm^-2 UV-B或者25μmol photonsm^-2s^-1可见光+8Wm^-2 UV-A，步骤3)所述的培养条件为20μmol photons m^-2s^-1可见光+0.4Wm^-2UV-B或者25μmol photons m^-2s^-1可见光+10Wm^-2 UV-A，步骤4)所述的培养条件为20μmolphotons m^-2s^-1可见光+1.2Wm^-2 UV-B或者25μmol photons m^-2s^-1可见光+16Wm^-2 UV-A，步骤4)所述的低温储存为4℃储存。

3.如权利要求2所述的一种制备葛仙米类菌胞素氨基酸粗品的方法，其特征在于：步骤3)所述的培养装置为定向诱导葛仙米MAAs高效合成的光生物反应器，该定向诱导葛仙米MAAs高效合成的光生物反应器包括安装有辐照强度可调的紫外A/B灯管的上层灯架、安装有LED日光灯灯管的侧面灯架，还包括无色有机玻璃缸，在所述无色有机玻璃缸的靠近最上方的壁上，设置有进水口和通气管，所述通气管一直通到所述无色有机玻璃缸内底部，在所述无色有机玻璃缸的靠近底面的壁上，设置有出水口，所述出水口处设置有滤藻网。

4.如权利要求3所述的一种制备葛仙米类菌胞素氨基酸粗品的方法，其特征在于：所述出水口位于滤藻网中央。