CN114395037A - 靶向钙网蛋白的纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向钙网蛋白的纳米抗体及其应用,所述靶向钙网蛋白的纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区为如SEQ ID NO:2所示的CDR1、如SEQ ID NO:4所示的CDR2、如SEQ ID NO:6所示的CDR3;或如SEQ ID NO:9所示的CDR1、如SEQ ID NO:11所示的CDR2、如SEQ ID NO:13所示的CDR3。本发明的204和215纳米抗体,通过与CRT结合情况的验证,显示了其与CRT蛋白具有很强的结合力,而且与CRT蛋白的亲和力均在纳摩尔水平,具有较高的亲和力;而且该纳米抗体更好的组织穿透性,可以使用大肠杆菌系统进行表达纯化,制备成本极大地降低。

Description

靶向钙网蛋白的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于免疫学或分子生物学技术领域,尤其涉及一种靶向钙网蛋白的纳米抗体及其应用。
背景技术
多个靶向实体肿瘤相关抗原(tumor associated antigens,TAAs)的单克隆抗体在肿瘤的靶向治疗中得到广泛使用,经典的该类单克隆抗体如EGFR抗体、Her2抗体以及VEGF抗体在相应分子表达阳性的结直肠癌、肺癌、头颈部肿瘤、胃癌、胶质瘤、卵巢癌、宫颈癌、肾癌以及乳腺癌等肿瘤治疗中已被证实具有较好的疗效。同时基于上述单克隆抗体的衍生药物如双特异抗体(bispecfic antibody)、抗体偶联药物(antibody drugconjugates, ADC)以及嵌合型受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells, CAR-T)均有在临床试验各阶段进行尝试,其中Her2抗体偶联药物T-DXd(trastuzmab deruxtecan)已经被批准用于胃癌的治疗。但是绝大部分肿瘤相关抗原均在部分正常组织适量表达,上述药物(单克隆抗体或衍生药物)均存在靶向表达该分子的正常组织而诱发的非肿瘤相关靶向效应从而产生副作用(on-target off-tumor adverse effects),如EGFR/CD3双特异性抗体对表达EGFR的正常组织产生严重的损害作用,HER2/CD3双特异性抗体也存在相同问题,多种CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)疗法如(gp-100 CAR T, CMA CAR-T等)存在对表达相应分子的正常组织攻击而产生严重的副作用,这些副作用极大的限制了如上药物的临床应用。
虽然肿瘤特异性抗原(tumor specific antigens, TSAs)被认为是由于肿瘤细胞内基因突变、重排或者病毒感染而产生的一类新抗原,其可由肿瘤细胞通过MHCI类分子递呈到细胞表面而被免疫系统识别,但是筛选可作为药物靶点的TSA(tumor specificantigen,肿瘤特异性抗原)以及有效的筛选方法均限制了靶向TSA的药物发展,肿瘤细胞具有大量的突变,但是仅仅极少一部分能够满足抗原特性来作为药物靶点;而且肿瘤强烈的异质性和患者明显的个体差异,均使得靶向TSA或者通过TSA制备肿瘤疫苗具有极大的挑战。因此,发展新的靶向药物策略并开发相对广谱适用的靶向药物在抗肿瘤药物研究中具有重要意义。
肿瘤免疫原性死亡(immunogenic cell death,ICD)是一种免疫相关的调控性死亡模式,其可以激发而非抑制机体T细胞针对正在发生死亡的癌细胞的免疫反应;其主要特征是引起癌细胞大量转位或释放免疫刺激分子,也即发生肿瘤细胞损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)反应,目前研究已发现某些化疗药物(如阿霉素(adriamycin)、蒽环类药物(anthracyclines)、表阿霉素(epirubicin)、米托葱醌(mitoxantrone,MTX)和奥沙利铂(oxaliplatin,OXP)等)、光热治疗(photothermaltherapy,PTT)、光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)、放疗等肿瘤治疗方法均可诱导ICD的发生。
ICD的核心事件是DAMP分子的转位或者释放,主要包括如下三个层级:1)内质网应激相关分子伴侣蛋白如钙网蛋白(calreticulin,CRT)、蛋白二硫化物异构酶A3(proteindisulfide isomerase-associated 3,PDIA3,又名ERp57)、热休克蛋白70(HSPA1A)和90(HSP90AA1)以及膜联蛋白A1(Annexin A1)从ER转位至细胞膜表面;2)ATP、高迁移率蛋白1(high-mobiity group box 1,HMGB1)以及各种免疫活化细胞因子(IFN,CXCL1,CXCL10等)的分泌释放;3)ICD晚期降解产物的释放,如DNA、RNA以及线粒体成分。以往对ICD转位或释放的这些信号分子的研究主要集中在上述的增强免疫应答以及调节方面,由于ICD过程中,多个正常状态下或者在非肿瘤细胞中位于内质网的分子伴侣蛋白会在ICD发生时转位到细胞膜表面,这些转位到癌细胞膜表面的蛋白是否可以作为新型肿瘤相关抗原应用到肿瘤的靶向治疗中尚未被探究。
ICD的核心事件是内质网应激导致的CRT转位至质膜表面,其与CRT转位相关的真核细胞起始因子2α( eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)磷酸化一起可作为预测ICD的关键分子标志。
目前检测CRT转位的方法有流式细胞术、免疫荧光、免疫组化或生物素化细胞表面CRT后用链霉素磁珠pull down CRT蛋白进行免疫印记分析。然而这些方法都是基于体外CRT的转位分析,不适合体内评估CRT蛋白的转位情况。仅有的一项通过体内检测CRT的转位来评估ICD应答的研究,是基于靶向CRT的7肽,将其与18F偶联用于正电子发射型计算机断层显像(positron emission computed tomography,PET)成像。这一研究进一步证明了通过检测CRT的转位情况来体现患者对ICD药物反应程度的可行性。然而,该研究选取的7肽与CRT蛋白的亲和力只有1.868 μM,存在检测不灵敏和脱靶的风险。因此,迫切需要一种更高亲和力的CRT靶向分子用于有关ICD成像以及治疗。
发明内容
针对以上技术问题,本发明公开了一种靶向钙网蛋白的纳米抗体及其应用,与CRT蛋白具有很强的结合力,可以用于有关ICD成像以及治疗。
对此,本发明的技术方案为:
靶向钙网蛋白的纳米抗体,所述靶向钙网蛋白的纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区为如SEQ ID NO:2所示的CDR1、如SEQ ID NO:4所示的CDR2、如SEQ ID NO:6所示的CDR3;
或如SEQ ID NO:9所示的CDR1、如SEQ ID NO:11所示的CDR2、如SEQ ID NO:13所示的CDR3。
具体来说,CDR1的序列为GRPFSLYAV,CDR2的序列为SRSGSTTD,CDR3的序列为ARSTRGYDY;CDR1的序列为GRTFSMYTM,CDR2的序列为SRSGAGTN,CDR3的序列为NQGSWANARSGRGFGS。
作为本发明的进一步改进,所述靶向钙网蛋白的纳米抗体的框架区为SEQ ID NO:1所示的FR1、如SEQ ID NO:3所示的FR2、如SEQ ID NO:5所示的FR3、如SEQ ID NO:7所示的FR4。
作为本发明的进一步改进,所述靶向钙网蛋白的纳米抗体(204纳米抗体)的氨基酸序列为如SEQ ID NO:15所示。
作为本发明的进一步改进,所述靶向钙网蛋白的纳米抗体的的氨基酸序列的框架区为SEQ ID NO:8所示的FR1、如SEQ ID NO:10所示的FR2、如SEQ ID NO:12所示的FR3、如SEQ ID NO:14所示的FR4。
作为本发明的进一步改进,所述靶向钙网蛋白的纳米抗体(215纳米抗体)的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
采用本发明技术方案的纳米抗体是特异性靶向钙网蛋白的抗体,能够结合钙网蛋白,并且所述纳米抗体具有高抗原结合性、高亲和性、低免疫原性以及较强的组织穿透力。
本发明还公开了一种核酸,所述核酸为:编码如上任意一项所述的靶向钙网蛋白的纳米抗体的核酸或其互补序列。上述核酸所编码的蛋白具有与钙网蛋白显著的高亲和活性,且该蛋白具有典型的纳米抗体的结构。
本发明还公开了一种表达载体,其包含如上所述的核酸。
本发明还公开了一种宿主细胞,其包含如上所述的表达载体。
本发明还公开了如上任意一项所述的靶向钙网蛋白的纳米抗体用作靶向钙网蛋白的检测试剂、活体成像探针、嵌和抗原受体修饰的细胞治疗产品或治疗性抗体的用途。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
与现有技术相比,本发明的204和215纳米抗体,通过与CRT结合情况的验证,显示了其与CRT蛋白具有很强的结合力,而且与CRT蛋白的亲和力均在纳摩尔水平,具有较高的亲和力;而且该纳米抗体具有较小的分子量,具有更好的组织穿透性,可以使用大肠杆菌系统进行表达纯化,制备成本低。
附图说明
图1是本发明实施例的使用OXP(奥沙利铂)处理两个细胞系HCT116、A549的流式细胞分析图;其中(a)为细胞系A549,(b)为细胞系HCT116。
图2是本发明实施例的使用OXP(奥沙利铂)处理两个细胞系HCT116、A549的免疫荧光结果图。
图3是本发明实施例的A549小鼠模型在OXP处理三次后的结果图。
图4是本发明实施例的CRT蛋白线性结构域示意图。
图5是本发明实施例的CRT N+P结构域表达纯化后电泳考马斯亮蓝染色结果图。
图6是本发明实施例的CRT N+P结构域表达纯化后anti-His标签的WB结果。
图7是本发明实施例的204纳米抗体、215纳米抗体以及对比例纳米抗体表达纯化后的电泳示意图以及使用HA标签的anti-HA WB检测结果;其中,(a)为电泳示意图 (b)为使用HA标签的anti-HA WB检测结果。
图8是本发明实施例的CRT N+P结构域表达纯化后anti-His标签的WB结果。
图9是本发明实施例的204克隆与CRT蛋白的亲和力检测结果。
图10是本发明实施例的215克隆与CRT蛋白的亲和力检测结果。
图11是本发明实施例的215-215纳米抗体二聚体蛋白的结构域示意图。
图12是本发明实施例的215二聚体与CRT蛋白的亲和力检测结果。
图13是本发明实施例的204-215二聚体与CRT蛋白的亲和力检测结果。
图14是本发明实施例的215纳米抗体对ICD转位CRT蛋白的识别分析图。
图15是本发明实施例的204、215纳米抗体修饰的荧光金纳米颗粒的体内靶向分析图。
具体实施方式
下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
1. 体内外验证ICD诱导后CRT蛋白的转位情况
(1)体外验证(免疫荧光)
复苏HCT116和A549细胞,传代3次后将细胞接种在24孔板中,用300 μM的OXP和1 μM的MTX进行ICD诱导,同时设无处理的MOCK对照组。诱导4小时后,进行和免疫荧光检测,具体步骤如下:
a),将细胞置于冰上,用PBS洗涤3次,0.25%多聚甲醛固定5分钟;
b),用PBS洗涤3次,2%驴血清封闭1小时;
c),用封闭液按1:200稀释CRT抗体,与细胞共孵育1小时;
d),预冷PBS洗涤3次,用封闭液按1:1000稀释Alexa 594偶联的二抗,与细胞共孵育1小时;
e),预冷PBS洗涤3次,用含DAPI的封片剂封片,荧光倒置显微镜检测CRT蛋白的转位情况。
(2)体外验证(流式细胞)
细胞处理与ICD诱导同上,药物处理后,a),细胞使用无酶消化液处理,收集细胞;b),将细胞置于冰上,用PBS洗涤3次,使用PI染色5分钟后用0.25%多聚甲醛固定5分钟;c),用PBS洗涤3次,2%驴血清封闭30分钟;d),用封闭液按1:200稀释CRT抗体,与细胞共孵育30分钟;e),预冷PBS洗涤3次,用封闭液按1:1000稀释Alexa 647偶联的二抗,与细胞共孵育30分钟;e),预冷PBS洗涤3次,流式细胞仪检测CRT转位情况。
(3)体内验证
构建HCT116和A549细胞的异种移植皮下瘤模型,当肿瘤体积到达100 mm3时进行体内ICD诱导。尾静脉注射OXP(2.5 mg/kg)24小时后,小鼠安乐死,浸泡75%酒精中,无菌条件下取出肿瘤组织和各种重要组织器官,OCT包埋制作冰冻组织块,冷冻切片机制备10μm组织切片,行常规免疫荧光染色检测CRT转位情况。
如图1所示,流式细胞证实OXP处理之后HCT116和A549的ICD关键蛋白CRT的转位明显增多。如图2所示,免疫荧光染色证实A549细胞在OXP处理之后CRT的发生转位。
另外,还在A549小鼠肿瘤模型进行了验证,结果如图3所示,可见A549小鼠模型在OXP处理三次后诱导CRT蛋白的大量转位。
2、CRT蛋白胞外结构域纳米抗体的筛选及验证
1) CRT N+P结构域表达纯化
根据CRT的胞外结构,设计并合成CRT N+P结构域用于纳米抗体筛选。表达纯化步骤如下:
a),为防止形成包涵体和蛋白降解,拟通过不同浓度的IPTG在16℃低温进行诱导条件摸索;
b),根据预实验诱导条件进行大量诱导表达,高压破菌仪工作条件1000 W进行破菌;
c),17000 g,4℃离心30 min,取上清与Ni填料4℃共孵育1小时;
d),Ni柱纯化后进行分子筛分离,AKATA参数设置0.5 mL流速/分钟,每1 mL收集一次;
e),根据电泳结果确定目的蛋白纯度,BCA法测定蛋白浓度。
CRT蛋白含有3个结构域,本实施例中克隆了N端结构域(18-197aa)和P端结构域(198-308aa),命名为CALR N+P,CRT蛋白线性结构域示意图如图4所示,蛋白大小约42 kDa,适合作为纳米抗体的筛选靶标。密码子优化后合成N+P基因进行大肠杆菌诱导表达纯化,为了避免蛋白降解和包涵体的产生,采用0.2 mM的IPTG在16℃低温过夜进行诱导,最后通过Ni柱和分子筛纯化后我们得到了高纯度的目的蛋白用于后续纳米抗体筛选,结果如图5所示,CRT N+P结构域表达纯化后电泳考马斯亮蓝染色。CRT N+P结构域表达纯化后anti-His标签的WB结果如图6所示。
2) 纳米抗体筛选
采用免疫管法对天然的羊驼源噬菌体展示纳米抗体文库进行筛选,所选择的噬菌体展示库容量为2x109。筛选步骤如下:
a),将目的蛋白按10 μg/mL浓度包被在免疫管上,进行3轮富集筛选;
b),使用第三轮噬菌体洗脱液铺板,随机挑取96个单克隆进行ELISA验证,以ELISA读数大于对应BSA读数3倍且读数大于0.5为阳性标准;
c),经过2次噬菌体ELISA鉴定的阳性单克隆送公司测序确定序列信息;
d),根据测序信息设计并合成筛选到的纳米抗体,通过大肠杆菌进行表达纯化;
e),利用ELISA亲和性实验来初步鉴定纳米抗体的亲和力,选择亲和力较好的纳米抗体,通过(GGGGS)3 linker两两偶联表达纯化后进行表面等离子共振(surface plasmonresonance,SPR)测定亲和常数。
3) 纳米抗体的纯化表达
将纳米抗体基因序列克隆入PET-14B载体,同时融合表达血凝素标签(hemagglutinin HA tag)用于后续检测。表达纯化步骤如下:
a),为防止形成包涵体和蛋白降解,使用0.2mM浓度的IPTG在16℃低温进行诱导;
b),根据预实验诱导条件进行大量诱导表达,高压破菌仪工作条件1000 W进行破菌;
c),17000 g,4℃离心30 min,取上清与Ni填料4℃共孵育1小时;g),Ni柱纯化后进行分子筛分离,AKATA参数设置0.5 mL流速/分钟,每1 mL收集一次。
4) 纳米抗体的ELISA实验
将HA标签融合到纳米抗体基因编码序列里,表达具有HA标签的纳米抗体,ELISA板包被CRT蛋白,封闭,之后加入各种浓度的纳米抗体在室温孵育1小时,PBS漂洗3次,anti-HA抗体室温孵育1小时后,辣根过氧化物酶标记的抗HA抗体放大信号,TMB显色,同时做无关纳米抗体的对照和无关蛋白抗原的空白对照。
本实施例通过大量的选择,得到了204纳米抗体和215纳米抗体。其中,204纳米抗体的氨基酸序列的框架区为SEQ ID NO:1所示的FR1、如SEQ ID NO:3所示的FR2、如SEQ IDNO:5所示的FR3、如SEQ ID NO:7所示的FR4;互补决定区为如SEQ ID NO:2所示的CDR1、如SEQ ID NO:4所示的CDR2、如SEQ ID NO:6所示的CDR3;该抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。215纳米抗体的的氨基酸序列的框架区为SEQ ID NO:8所示的FR1、如SEQ ID NO:10所示的FR2、如SEQ ID NO:12所示的FR3、如SEQ ID NO:14所示的FR4;互补决定区为如SEQID NO:9所示的CDR1、如SEQ ID NO:11所示的CDR2、如SEQ ID NO:13所示的CDR3;该抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
经过表达纯化,并进行anti-HA WB检测,经过与其他纳米抗体相比,204纳米抗体和215纳米抗体与CRT具有更好好的结合活性。从图7中可见,表达纯化的204纳米抗体、215纳米抗体与其他纳米抗体(201、204、206、207、208、213)都融合了HA标签的纳米抗体蛋白,获得高纯度纳米抗体,大小为18kD上下;通过图8可见,ELISA检测的这8个纳米抗体与CRT蛋白的结合,发现204、215结合力最佳。
5) 表面等离子共振实验
此实验用来验证在体外表达纯化的纳米抗体与体外纯化的抗原蛋白直接相互作用,并计算二者的平衡常数。纯化抗原蛋白被固定在芯片上,不同浓度的纳米抗体被被顺序加入来分析与抗原蛋白的亲和力,记录360秒内的反应信号,制作动力学曲线,计算各相关参数。
本实施例使用biacore进一步检测了204抗体和215抗体克隆与CRT蛋白的亲和力常数,如图9和图10所示,204克隆与CRT蛋白的亲和力为0.53nM,215克隆与CRT蛋白的亲和力为0.96nM,二者与CRT蛋白的亲和力均在纳摩尔水平,具有较高的亲和力,可用于后续的细胞动物水平的实验。
同时将通过基因融合技术融合表达215-215、204-215纳米抗体二聚体,204-215和215-215纳米抗体二聚体蛋白如图11所示,分子量约为36Kd。并使用biacore检测了亲和力,215-215二聚体与CRT亲和力达到2.8pM,如图12所示,215二聚体与CRT亲和力进一步倍增,达到皮摩尔级别;如图13所示,204-215二聚体与CRT蛋白亲和力炜4.31nM ,204-215二聚体仍然维持在纳摩尔水平。
6) 纳米抗体靶向性验证
根据SPR结果,选择亲和力较好的单价或不同组合的偶联纳米抗体进行靶向性验证。体外诱导HCT116、A549细胞ICD 4小时后,实验所得纳米抗体与细胞进行孵育,通过免疫荧光检测anti-HA标签的反应纳米抗体对CRT的识别情况。
本实施例检测了215纳米抗体是否可以识别ICD中发生转位的CRT蛋白,结果如图14所示,可见OXP处理后,细胞膜上CRT转位到细胞膜上,细胞在未穿透的情况可见CRT定位于细胞膜上,而215纳米抗体可与CRT 抗体指示的CRT蛋白共定位,显示215纳米抗体对CRT蛋白的特异性。
同样,也对204纳米抗体进行了相同的实验,结果显示204纳米抗体可与CRT 抗体指示的CRT蛋白共定位,显示204纳米抗体对CRT蛋白的特异性。
3. CRT纳米抗体修饰纳米胶囊的应用
在金纳米棒材料上通过酰胺键反应修饰透明质酸(Hyaluronic acid,HA),再通过酰胺键反应在HA上修饰马来酰亚胺氨基,然后通过纳米抗体上的半胱氨酸的巯基和马来酰亚胺通过点击化学形成坚固的共价键。最后将IR-800通过NHS与纳米颗粒上的NH2基团形成酰胺键进行共价偶联。
1) 纳米抗体修饰金纳米棒用于体内检测CRT蛋白
复苏HCT116和A549细胞,传代3次后用于异种移植皮下瘤模型接种,接种细胞量为1x106每只,当肿瘤体积到达100 mm3时进行体内ICD诱导,诱导条件为尾静脉注射2.5mg/kg的OXP,诱导24小时后,尾静脉注射不同浓度的CRT靶向的纳米金棒,循环24小时后进行解剖小鼠,收集各脏器,进行组织器官IR-800荧光扫描。
采用上述方法将204和215纳米抗体修饰于金纳米棒上并标记荧光染料IR-800,注射已诱导ICD的A549肿瘤小鼠循环24小时后,处死小鼠,解剖并收集各器官在近红外成像仪上检测荧光信号,如图15(a)的对比ICD组与MOCK组肿瘤信号可发现,204纳米抗体修饰的IR800标记的金纳米颗粒在肿瘤部分产生高于MOCK组对应肿瘤的信号;如图15(b)的对比ICD组与MOCK组肿瘤信号可发现,215纳米抗体修饰的IR800标记的金纳米颗粒在肿瘤的信号明显高于MOCK组对应肿瘤的信号,可见204纳米抗体和215纳米抗体均增强了肿瘤的荧光信号。
本发明实施例还公开了一种核酸,所述核酸为:编码如上所述的204纳米抗体或215纳米抗体的核酸或其互补序列。
本发明实施例还公开了一种表达载体,其包含如上所述的核酸。
本发明实施例还公开了一种宿主细胞,其包含如上所述的表达载体。
本发明实施例还公开了如上任意一项所述的靶向钙网蛋白的纳米抗体用作靶向钙网蛋白的检测试剂、活体成像探针、嵌和抗原受体修饰的细胞治疗产品或治疗性抗体的用途。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市人民医院
<120> 靶向钙网蛋白的纳米抗体及其应用
<141> 2021-11-01
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser
20 25
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Gly Arg Pro Phe Ser Leu Tyr Ala Val
1 5
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Phe Val Ala Ala
1 5 10 15
Ile
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Ser Arg Ser Gly Ser Thr Thr Asp His
1 5
<210> 5
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Ala
1 5 10 15
Asn Thr Val Ser Leu Leu Met Ser Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
20 25 30
Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala
35
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Ala Arg Ser Thr Arg Gly Tyr Asp Tyr
1 5
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Gly Arg Thr Phe Ser Met Tyr Thr Met
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Leu
1 5 10 15
Ile
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Ser Arg Ser Gly Ala Gly Thr Asn Tyr
1 5
<210> 12
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 12
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Thr Asn
1 5 10 15
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
35
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 13
Asn Gln Gly Ser Trp Ala Asn Ala Arg Ser Gly Arg Gly Phe Gly Ser
1 5 10 15
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 14
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 15
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 15
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Leu
20 25 30
Tyr Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Phe
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Ser Thr Thr Asp His Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Ala Asn Thr Val
65 70 75 80
Ser Leu Leu Met Ser Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Ala Arg Ser Thr Arg Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 16
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Met
20 25 30
Tyr Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Val Ala Leu Ile Ser Arg Ser Gly Ala Gly Thr Asn Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Thr Asn Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Asn Gln Gly Ser Trp Ala Asn Ala Arg Ser Gly Arg Gly
100 105 110
Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

Claims (9)

1.靶向钙网蛋白的纳米抗体,其特征在于:所述靶向钙网蛋白的纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区为如SEQ ID NO:2所示的CDR1、如SEQ ID NO:4所示的CDR2、如SEQ ID NO:6所示的CDR3;
或如SEQ ID NO:9所示的CDR1、如SEQ ID NO:11所示的CDR2、如SEQ ID NO:13所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的靶向钙网蛋白的纳米抗体,其特征在于:所述靶向钙网蛋白的纳米抗体的氨基酸序列的框架区为SEQ ID NO:1所示的FR1、如SEQ ID NO:3所示的FR2、如SEQ ID NO:5所示的FR3、如SEQ ID NO:7所示的FR4。
3.根据权利要求2所述的靶向钙网蛋白的纳米抗体,其特征在于:所述靶向钙网蛋白的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
4.根据权利要求1所述的靶向钙网蛋白的纳米抗体,其特征在于:所述靶向钙网蛋白的纳米抗体的氨基酸序列的框架区为SEQ ID NO:8所示的FR1、如SEQ ID NO:10所示的FR2、如SEQ ID NO:12所示的FR3、如SEQ ID NO:14所示的FR4。
5.根据权利要求4所述的靶向钙网蛋白的纳米抗体,其特征在于:所述靶向钙网蛋白的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
6.一种核酸,其特征在于,所述核酸为:编码权利要求1~5任意一项所述的靶向钙网蛋白的纳米抗体的核酸或其互补序列。
7.一种表达载体,其包含权利要求6所述的核酸。
8.一种宿主细胞,其包含权利要求7所述的表达载体。
9.权利要求1~5任意一项所述的靶向钙网蛋白的纳米抗体的应用,其特征在于,其用作靶向钙网蛋白的检测试剂、活体成像探针、嵌和抗原受体修饰的细胞治疗产品或治疗性抗体。
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