CN114375712B - 一种土壤微生物多样性与植物逆境互作的研究方法 - Google Patents

一种土壤微生物多样性与植物逆境互作的研究方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种土壤微生物多样性与植物逆境互作的可视化研究方法，属于微生物技术领域，本发明通过原生境土壤灭菌，原生境土壤梯度稀释液分别与无菌土壤混合，黑暗培养得到微生物多样性梯度土壤种植盘，直接播种后逆境处理等方式，实现了在相同的微生物数量条件下，明确土壤微生物多样性在植物逆境中的功能，并精确反映微生物多样性对逆境下植物生长的调控。本发明的研究方法耗时短，只需45～60天，且能够在原位可视化地观察根系在逆境下对微生物多样性的响应，不用破坏性取样观察，操作更加简便、快捷。

Description

一种土壤微生物多样性与植物逆境互作的研究方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种土壤微生物多样性与植物逆境互作的研究方法。
背景技术
土壤中的微生物数量巨大、种类繁多，土壤的微生物多样性影响着土壤的结构、土壤肥力、土壤养分利用率，进而影响着植物的生长发育，同时植物也是土壤微生物多样性的一个关键决定因素。近年来国内外对植物和土壤微生物之间互作关系的研究越来越多，但鲜见有关土壤微生物多样性与植物逆境互作的研究方法的相关报道。
目前，研究通常采取田间试验土壤采集和指标监测的方式，通过微生物多样性与植物指标间的相关性分析，体现微生物多样性与植物生长之间的关系，但通过该方法获得的结果，仅体现了微生物多样性与植物生长二者之间在数字上的相互关系，并无逻辑上的关系。上述方法也无法排除微生物数量对土壤微生物多样性与植物逆境互作的干扰，也就是说，无法在相同的微生物数量条件下，明确土壤微生物多样性协助植物抵御非生物逆境的功能。除田间调查外，有一些研究通过在植株上直接接种微生物菌株来研究微生物与植物互作，这种方法无法创造与原生境土壤相同的物理、化学条件。而且，基于田间试验土壤采集和指标监测的方法耗时长，达半年以上，无法快速地在原位可视化地观察到土壤微生物多样性与植物逆境互作的表观现象，只能通过破坏性取样进行观察，导致操作繁琐。
发明内容
本发明的目的在于提供一种土壤微生物多样性与植物逆境互作的研究方法，该方法可以实现在相同的微生物数量条件下，明确土壤微生物多样性在植物逆境中的功能，并精确反映微生物多样性对逆境下植物生长的调控，该方法耗时短，且能够在原位可视化地观察到土壤微生物多样性-植物逆境互作的表观现象。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种土壤微生物多样性与植物逆境互作的研究方法，包括以下步骤：
将原生境土壤灭菌，得到无菌土壤；
将原生境土壤与水混合进行梯度稀释，得到原生境土壤梯度稀释液；
将原生境土壤梯度稀释液分别与无菌土壤混合，获得前培养梯度土壤；
将前培养梯度土壤分别盛装入种植穴盘中，黑暗培养，即得微生物多样性梯度土壤种植盘；
观察逆境处理条件下微生物多样性梯度土壤种植盘中植物的生长状况。
优选地，所述灭菌的方式为伽马射线灭菌。
优选地，所述伽马射线的强度为40～60kGy。
优选地，将原生境土壤与水混合进行梯度稀释的步骤包括：
将原生境土壤用水稀释至浓度为0.2～0.6g/mL的接种原液，将所述接种原液用水梯度稀释，梯度稀释倍数分别为100、102、104、106和108倍。
优选地，将原生境土壤梯度稀释液分别与无菌土壤混合，所述原生境土壤梯度稀释液与无菌土壤的体积质量比为1:3～5。
优选地，所述黑暗培养的条件为23～27℃恒温黑暗培养18～22天。
优选地，采用伽马射线灭菌原生境土壤前，所述原生境土壤通过采集深度为0～30cm，过1.5～2.5mm筛得到。
优选地，所述种植穴盘为独立的两层，内层为透明种植穴盘，外层为黑色不透明种植穴盘，所述前培养梯度土壤分别盛装入透明种植穴盘中。
优选地，所述种植穴盘上铺有无纺布。
优选地，所述逆境环境包括盐胁迫环境、重金属胁迫环境或根结线虫胁迫环境。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种土壤微生物多样性与植物逆境互作的研究方法，本发明可以实现在相同的微生物数量条件下，明确土壤微生物多样性在植物逆境中的功能，并精确反映微生物多样性对逆境下植物生长的调控。本发明将具有相同物理、化学性质的伽马射线灭菌土壤回接原生境土壤梯度稀释液中得到前培养梯度土壤，盛装入透明种植穴盘，通过暗培养获得微生物数量相同但多样性不同的土壤种植盘，观察逆境处理条件下微生物多样性梯度土壤种植盘中植物的生长状况，从而获得土壤微生物多样性调控逆境下植物生长的直接证据。本发明的研究方法耗时短，只需45～60天，且能够在原位可视化地观察根系在逆境下对微生物多样性的响应，不用破坏性取样观察，操作更加简便、快捷。
附图说明
图1为透明种植穴盘、黑色不透明种植穴盘与透明种植穴盘套在黑色不透明种植穴盘中的示意图；
图2为原生境土壤和微生物多样性梯度土壤的细菌和真菌群落组成对比图；
图3为原生境土壤和微生物多样性梯度土壤的生物多样性对比图；
图4为土壤中的微生物多样性-生菜-盐胁迫逆境互作图；
图5为土壤中的微生物多样性在盐胁迫逆境中对生菜生物量的影响结果图；
图6为壤中的微生物多样性-生菜-重金属胁迫逆境互作图；
图7为土壤中的微生物多样性在重金属胁迫逆境中对生菜生物量的影响结果图；
图8为土壤中的微生物多样性-黄瓜根系-根结线虫胁迫逆境互作图；
图9为土壤中的微生物多样性在根结线虫胁迫逆境中对根结数的影响结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种土壤微生物多样性与植物逆境互作的可视化研究方法，包括以下步骤：
将原生境土壤灭菌，得到无菌土壤；
将原生境土壤与水混合进行梯度稀释，得到原生境土壤梯度稀释液；
将原生境土壤梯度稀释液分别与无菌土壤混合，获得前培养梯度土壤；
将前培养梯度土壤分别盛装入种植穴盘中，黑暗培养，即得微生物多样性梯度土壤种植盘；
观察逆境处理条件下微生物多样性梯度土壤种植盘中植物的生长状况。在本发明中，将原生境土壤灭菌，得到无菌土壤。所述的原生境土壤通过采集和过筛得到，步骤优选地包括：采集深度为0～30cm，过1.5～2.5mm的筛子，即得。所述土壤优选为没有使用过化肥和农药的表层森林土壤，所述采集的方式优选为通过灭菌土钻采集，所述土钻可选为直径10cm、深度30cm。采集森林土壤深度为0～30cm，共随机选择20个点，以保证采集的森林土壤具有代表性。采集森林土壤后，将土样放置在自封袋中，然后将自封袋放装入带有冰袋的保温盒中，以保证土壤中微生物的活性。将采集的森林土壤过1.5～2.5mm的筛子，更优选为过2mm的筛子，从而去除植物残体和可能存在的小石块等非土壤物质。过筛后，将土壤充分混合，即得原生境土壤。所述混合可选为用无菌布袋或塑料袋混合。得到原生境土壤后，本发明优选地采用伽马射线灭菌原生境土壤。所述伽马射线的强度优选为40～60kGy；进一步优选地，所述伽马射线的强度为45～55kGy；更优选地，所述伽马射线的强度为50kGy。本发明通过上述伽马射线灭菌原生境土壤，得到无菌土壤，该无菌土壤的物理、化学性质与原生境土壤相同。
在本发明中，将原生境土壤与水混合进行梯度稀释，得到原生境土壤梯度稀释液。所述将原生境土壤与水混合进行梯度稀释的步骤优选地包括：将原生境土壤用水稀释至浓度为0.2～0.6g/mL的接种原液，将所述接种原液用水梯度稀释，梯度稀释倍数分别为100、102、104、106和108倍，得到原生境土壤梯度稀释液。所述接种原液的浓度优选为0.3～0.5g/mL，更优选为0.4g/mL。作为一可选的实施方式，取200g原生境土壤装入无菌烧杯中，加入500mL无菌去离子水，采用无菌玻璃棒充分搅拌均匀，作为接种原液，用无菌去离子水将接种原液梯度进行梯度稀释，稀释梯度包括100、102、104、106和108，得到原生境土壤梯度稀释液。
在本发明中，得到原生境土壤梯度稀释液后，将原生境土壤梯度稀释液分别与无菌土壤混合，获得前培养梯度土壤。所述原生境土壤梯度稀释液与所述无菌土壤的体积质量比优选为1:3～5，更优选为1:4。
在本发明中，将前培养梯度土壤分别盛装入种植穴盘中，黑暗培养，即得微生物多样性梯度土壤种植盘。所述种植穴盘优选为独立的两层，内层为透明种植穴盘，外层为黑色不透明种植穴盘，所述前培养梯度土壤分别盛装入透明种植穴盘中。所述种植穴盘上优选地铺有无纺布，进一步优选地，在套有黑色不透明穴盘的透明种植穴盘上铺上无纺布。本发明通过将透明种植穴盘套在黑色不透明穴盘中的方式，观察根系时，无需破坏性取样，直接去掉透明种植穴盘下面的黑色不透明穴盘即可进行可视化观察根系，操作简便、快捷。所述透明种植穴盘优选为圆柱形，直径优选为6～10cm，高为4～8cm，种植穴盘下部有漏水孔，漏水孔径优选为1～2cm。所述黑色不透明穴盘优选为圆柱形，直径优选为7～11cm，高优选为8～12cm，种植穴盘下部无漏水孔。本发明的透明种植穴盘的每个种植穴套在黑色不透明穴盘的穴孔中，一方面盛接透明种植穴盘灌溉时可能带来的向下渗漏的水分，另一方面隔绝了各个种植穴相互之间的影响。本发明通过在种植穴盘上铺的无纺布透气但不透水，便于土壤微生物在恒定湿度下进行呼吸代谢。所述无纺布优选为聚乙烯无纺布，更优选为100％高密度聚乙烯无纺布。将前培养梯度土壤分别盛装入透明种植穴盘中，所述盛装量优选为透明种植穴盘体积的85～95％。
在本发明中，将前培养梯度土壤分别盛装入种植穴盘后进行黑暗培养。所述黑暗培养的条件优选为23～27℃恒温黑暗培养18～22天，进一步优选为24～26℃恒温黑暗培养19～21天。黑暗培养后即得微生物多样性梯度土壤种植盘，该种植盘为微生物数量相同但多样性不同的精准微生物多样性梯度土壤种植盘。
在本发明中，观察逆境处理条件下微生物多样性梯度土壤种植盘中植物的生长状况。本发明直接播种后对精准微生物多样性梯度土壤根据需求进行逆境处理，或对微生物多样性梯度土壤进行逆境处理后再直接播种，观察并监测植物生长状况，从而得到土壤微生物多样性协助植物抵御某种逆境的功能。所述逆境环境优选地包括盐胁迫环境、重金属胁迫环境或根结线虫胁迫环境。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的以下实施例中的无纺布购自杜邦
Figure BDA0003472753250000061
无纺布。
实施例1
一种土壤微生物多样性与植物逆境互作的可视化研究方法，步骤如下：
(1)选择没有使用过化肥和农药的森林土壤，用直径10cm、深度30cm灭菌土钻采集表层森林土壤，采集深度为0～30cm，共随机选择20个点，将土样放置在自封袋中，然后将自封袋放装入带有冰袋的保温盒中；
(2)将步骤(1)采集的土样用孔径为2mm的灭菌筛过筛，然后使用无菌布袋或塑料袋将所有土壤充分混合，即得原生境土壤；
(3)将原生境土壤在50kGy强度的伽马射线下灭菌，得到无菌土壤；
(4)取200g原生境土壤装入无菌烧杯中，加入500mL无菌去离子水，采用无菌玻璃棒充分搅拌均匀，作为接种原液，用无菌去离子水梯度稀释接种原液，稀释梯度为100、102、104、106和108，得到原生境土壤梯度稀释液；
(5)将25mL原生境土壤梯度稀释液分别与100g无菌土壤用无菌玻璃棒充分搅拌混匀，获得前培养梯度土壤；
(6)将前培养梯度土壤分别盛装入透明种植穴盘中，每个前培养梯度土壤浓度装入4个透明种植穴，盛装量为每个透明种植穴体积的90％，然后套在黑色不透明穴盘中，在套有黑色不透明穴盘的透明种植穴盘上铺上高密度聚乙烯无纺布，25℃恒温黑暗培养20天，即得微生物多样性梯度土壤种植盘；所述的透明种植穴盘为圆柱形，直径为8cm，高为6cm，种植穴盘下部有漏水孔，漏水孔径为1.5cm；所述的黑色不透明穴盘为圆柱形，直径为9cm，高为10cm，种植穴盘下部无漏水孔；
(7)观察逆境处理条件下微生物多样性梯度土壤种植盘中植物的生长状况。
其中透明种植穴盘、黑色不透明种植穴盘的示意图以及透明种植穴盘套在黑色不透明种植穴盘中的示意图见图1。
实施例2
一种土壤微生物多样性与植物逆境互作的可视化研究方法，步骤如下：
(1)选择没有使用过化肥和农药的森林土壤，用直径10cm、深度30cm灭菌土钻采集表层森林土壤，采集深度为0～30cm，共随机选择20个点，将土样放置在自封袋中，然后将自封袋放装入带有冰袋的保温盒中；
(2)将步骤(1)采集的土样用孔径为1.5mm的灭菌筛过筛，然后使用无菌布袋或塑料袋将所有土壤充分混合，即得原生境土壤；
(3)将原生境土壤在40kGy强度的伽马射线下灭菌，得到无菌土壤；
(4)取300g原生境土壤装入无菌烧杯中，加入500mL无菌去离子水，采用无菌玻璃棒充分搅拌均匀，作为接种原液，用无菌去离子水梯度稀释接种原液，稀释梯度为100、102、104、106和108，得到原生境土壤梯度稀释液；
(5)将25mL原生境土壤梯度稀释液分别与75g无菌土壤用无菌玻璃棒充分搅拌混匀，获得前培养梯度土壤；
(6)将前培养梯度土壤分别盛装入透明种植穴盘中，每个前培养梯度土壤浓度装入4个透明种植穴，盛装量为每个透明种植穴体积的85％，然后套在黑色不透明穴盘中，在套有黑色不透明穴盘的透明种植穴盘上铺上高密度聚乙烯无纺布，23℃恒温黑暗培养22天，即得微生物多样性梯度土壤种植盘；所述的透明种植穴盘为圆柱形，直径为6cm，高为8cm，种植穴盘下部有漏水孔，漏水孔径为1cm；所述的黑色不透明穴盘为圆柱形，直径为7cm，高为12cm，种植穴盘下部无漏水孔；
(7)观察逆境处理条件下微生物多样性梯度土壤种植盘中植物的生长状况。
实施例3
一种土壤微生物多样性与植物逆境互作的可视化研究方法，步骤如下：
(1)选择没有使用过化肥和农药的森林土壤，用直径10cm、深度30cm灭菌土钻采集表层森林土壤，采集深度为0～30cm，共随机选择20个点，将土样放置在自封袋中，然后将自封袋放装入带有冰袋的保温盒中；
(2)将步骤(1)采集的土样用孔径为2.5mm的灭菌筛过筛，然后使用无菌布袋或塑料袋将所有土壤充分混合，即得原生境土壤；
(3)将原生境土壤在60kGy强度的伽马射线下灭菌，得到无菌土壤；
(4)取100g原生境土壤装入无菌烧杯中，加入500mL无菌去离子水，采用无菌玻璃棒充分搅拌均匀，作为接种原液，用无菌去离子水梯度稀释接种原液，稀释梯度为100、102、104、106和108，得到原生境土壤梯度稀释液；
(5)将25mL原生境土壤梯度稀释液分别与125g无菌土壤用无菌玻璃棒充分搅拌混匀，获得前培养梯度土壤；
(6)将前培养梯度土壤分别盛装入透明种植穴盘中，每个前培养梯度土壤浓度装入4个透明种植穴，盛装量为每个透明种植穴体积的85～95％，然后套在黑色不透明穴盘中，在套有黑色不透明穴盘的透明种植穴盘上铺上高密度聚乙烯无纺布，27℃恒温黑暗培养18天，即得微生物多样性梯度土壤种植盘；所述的透明种植穴盘为圆柱形，直径为10cm，高为4cm，种植穴盘下部有漏水孔，漏水孔径为1～2cm；所述的黑色不透明穴盘为圆柱形，直径为11cm，高为8cm，种植穴盘下部无漏水孔；
(7)观察逆境处理条件下微生物多样性梯度土壤种植盘中植物的生长状况。
实施例4
本实施例检测实施例1中的原生境土壤在60kGy强度的伽马射线下灭菌得到的灭菌土壤、原生境土壤的理化性质。
其中土壤的理化性质测定参照《土壤农化分析》(鲍士旦主编，北京：中国农业出版社，2000)中的方法，其中土壤容重采用环刀法；pH(土/水1:2.5)采用电位测定法；EC(土/水1:5)采用电导率仪法；有机质采用重铬酸盐氧化和滴定法；有效氮采用氯化钾浸提-流动分析仪法；有效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗分光光度法；有效钾采用火焰原子吸收分光光度法；全氮采用凯氏定氮法；全磷、全钾、全钙、全镁、全硫、全硼、全铜、全铁、全锰、全锌和全钼采用电感耦合等离子体原子发射光谱法测定，测定结果见表1。
表1伽马射线灭菌土与原生境土壤理化性质测定结果
Figure BDA0003472753250000081
Figure BDA0003472753250000091
由表1可知，伽马射线灭菌获得的灭菌土壤与原生境土壤的物理、化学性质相同。
实施例5
将实施例1步骤(6)获得的微生物多样性梯度土壤(梯度稀释100土壤、梯度稀释102土壤、梯度稀释102土壤、梯度稀释104土壤、梯度稀释106土壤和梯度稀释108土壤)与原生境土壤的微生物总量、细菌数量和真菌数量进行测定、采用高通量测序方法的测定细菌和真菌群落组成，并计算微生物多样性。
采用Power Soil DNA Kit(MoBio Laboratories Inc.,California,USA)土壤DNA提取试剂盒，参照说明书，提取了土壤DNA，通过荧光定量PCR测定了细菌和真菌的数量。其中，细菌引物为Eub338(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG如SEQ ID NO.1所示)和Eub518(ATTACCGCGGCTGCTGG如SEQ ID NO.2所示)，其PCR反应参数为1个循环95℃ 5min和40个循环95℃ 60s，53℃ 30s，72℃ 60s；真菌引物为5.8s(CGCTGCGTTCTTCATCG如SEQ ID NO.3所示)和ITS1f(TCCGTAGGTGAACCTGCGG如SEQ ID NO.4所示)，其PCR反应参数为1个循环95℃5min和40个循环95℃ 60s，53℃ 30s，72℃60s。荧光定量PCR流程参照Chen,X.P.,Zhu,Y.G.,Xia,Y.,Shen,J.P.,He,J.Z.,2008.Ammonia-oxidizing archaea:importantplayers in paddy rhizosphere soil？Environ.Microbiol.10,1978–1987。
表2恒温恒湿透气暗培养土壤与原生境土壤具有相同的微生物数量
Figure BDA0003472753250000101
由表2可知，恒温黑暗培养获得的微生物多样性梯度土壤的微生物总量、细菌数量和真菌数量与原生境土壤相同。
高通过测序方法：高通量测序细菌引物515F(GTGCCAGCMGCCGCGG如SEQ ID NO.5所示)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT如SEQ ID NO.6所示)，真菌引物为ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA如SEQ ID NO.7所示)和ITS2(GCTGCGTTCTTCATCGATGC如SEQ IDNO.8所示)，使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行Miseq文库构建，利用Illu mina公司的Miseq PE300平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，采用高通量测序方法的测定细菌和真菌群落组成结果见图2，生物多样性见图3。
由图2可知，与原生境土壤相比，恒温黑暗培养获得的微生物多样性梯度土壤的细菌和真菌群落组成发生了明显的变化。
由图3可知，与原生境土壤相比，恒温黑暗培养获得的微生物多样性梯度土壤的细菌和真菌的多样性均呈显著下降趋势。
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于步骤(7)：本实施例采用150mg/kg盐(NaCl)处理土壤，以原生境土壤为对照，然后直播生菜种子(每个种植穴直播10粒种子)后，观察植物生长状况，其余步骤与实施例1相同。
土壤中的微生物多样性-生菜-盐胁迫逆境互作见图4，土壤中的微生物多样性在盐胁迫逆境中对生菜生物量的影响结果见图5。
由图4和图5可知，随土壤微生物多样性的降低，生菜生物量呈现下降趋势，二者为极显著相关，说明土壤微生物多样性有维持植物抵御盐胁迫的功能。
实施例7
本实施例与实施例1的区别在于步骤(7)：采用800mg/kg重金属铜(Cu)处理土壤，以原生境土壤为对照，然后直播生菜种子(每个种植穴直播10粒种子)后观察植物生长状况，其余步骤与实施例1相同。
土壤中的微生物多样性-生菜-重金属胁迫逆境互作见图6，土壤中的微生物多样性在重金属胁迫逆境中对生菜生物量的影响结果见图7。
由图6和图7结果表明，随土壤微生物多样性的降低，生菜生物量呈现下降趋势，二者为极显著相关，说明土壤微生物多样性有维持植物抵御重金属胁迫的功能。
实施例8
本实施例与实施例1的区别在于步骤(7)：种植黄瓜苗(每个种植穴种植1棵苗)，然后接种根结线虫(150头/株)，以原生境土壤为对照，然后观察植物根系生长状况，其余步骤与实施例1相同。
土壤中的微生物多样性-黄瓜-根结线虫胁迫逆境互作见图8，土壤中的微生物多样性在根结线虫胁迫逆境中对根结数的影响结果见图9。
由图8和图9结果表明，随土壤微生物多样性的降低，根结指数呈现上升趋势，二者为极显著相关，说明土壤微生物多样性有维持植物抵御根结线虫胁迫的功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种土壤微生物多样性与植物逆境互作的研究方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actcctacgg gaggcagcag 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attaccgcgg ctgctgg 17
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgctgcgttc ttcatcg 17
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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Claims (5)

1.一种土壤微生物多样性与植物逆境互作的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：
将原生境土壤灭菌，得到无菌土壤；
将原生境土壤与水混合进行梯度稀释，得到原生境土壤梯度稀释液；
将原生境土壤梯度稀释液分别与无菌土壤混合，获得前培养梯度土壤；
将前培养梯度土壤分别盛装入种植穴盘中，黑暗培养，即得微生物多样性梯度土壤种植盘；
观察逆境处理条件下微生物多样性梯度土壤种植盘中植物的生长状况；
所述黑暗培养的条件为23～27℃恒温黑暗培养18～22天；
所述种植穴盘为独立的两层，内层为透明种植穴盘，外层为黑色不透明种植穴盘，所述前培养梯度土壤分别盛装入透明种植穴盘中；
所述种植穴盘上铺有无纺布；
所述的植物为生菜或黄瓜；
所述透明种植穴盘下部有漏水孔；
所述黑色不透明种植穴盘下部无漏水孔；
所述透明种植穴盘为圆柱形，直径为6～10cm，高为4～8cm，漏水孔径为1～2cm；
所述黑色不透明穴盘为圆柱形，直径为7～11cm，高为8～12cm；
所述逆境环境包括盐胁迫环境、重金属胁迫环境或根结线虫胁迫环境；
将原生境土壤与水混合进行梯度稀释的步骤包括：
将原生境土壤用水稀释至浓度为0.2～0.6g/mL的接种原液，将所述接种原液用水梯度稀释，梯度稀释倍数分别为100、102、104、106和108倍。
2.根据权利要求1所述的研究方法，其特征在于，所述灭菌的方式为伽马射线灭菌。
3.根据权利要求2所述的研究方法，其特征在于，所述伽马射线的强度为40～60kGy。
4.根据权利要求1所述的研究方法，其特征在于，所述原生境土壤梯度稀释液与所述无菌土壤混合的体积质量比为1:3～5。
5.根据权利要求1所述的研究方法，其特征在于，所述原生境土壤通过采集深度为0～30cm，过1.5～2.5mm筛得到。
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