CN114369652B - 外泌体miR-17-5p在制备重症肺炎的检测产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了外泌体miR‑17‑5p在制备重症肺炎的检测产品中的应用，所述外泌体为支气管肺泡灌洗液中的外泌体。本发明利用分子生物学技术，基于外泌体中miR‑17‑5p的表达水平快速、准确地将重症肺炎患者从无呼吸道感染者中检测出来，具有很好的应用前景和推广价值：特异性强：直接提取支气管肺泡灌洗液中的外泌体，其内容物组成受肺组织病理生理改变的影响最直接；灵敏度高：RT‑qPCR检测方法灵敏度高，可高效识别重症肺炎患者；高效快速：现代分子生物学技术发展迅速，可以实现快速准确地检测miR‑17‑5p的水平；准确性高：引物与靶序列特异性结合，保证了RT‑qPCR扩增结果的高度准确性，从而提高了检测重症肺炎患者的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及重症肺炎分子检测技术领域，具体地，涉及外泌体miR-17-5p在制备重症肺炎的检测产品中的应用。
背景技术
重症肺炎是重症监护室(ICU)最常见的呼吸系统急危重症，因不同病因、不同病原菌、在不同场合所导致的肺组织(细支气管、肺泡、间质)炎症，有着相似或相同的病理生理过程，发展到一定疾病阶段，均可恶化加重成为重症肺炎引起器官功能障碍甚至危及生命。相关研究表明，重症肺炎的病死率高达30％～50％，并可导致严重的并发症如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脓毒症等加重医疗经济负担。根据世界卫生组织(WHO)统计，下呼吸道感染(LRTIs)是全球第四大死亡原因，导致2019年全球260万人死亡，是最致命的传染病且LRTIs是低收入国家最常见的死亡原因，而肺炎是高收入经济体中十大死亡原因中唯一的感染性疾病。随着当前新型冠状病毒肺炎的大流行，肺炎是一个主要的全球临床和公共卫生问题的事实再次引起了全世界的关注。
目前，重症肺炎的初步诊断是基于提示性临床特征，如发热、呼吸短促、痰多、咳嗽和白细胞增多，并辅以胸部X线或计算机断层扫描(CT)中发现的肺实变证据，以得出最终诊断。在某些情况下，还可以通过尿液抗原检测、分子检测、血清学或支气管镜检查来支持诊断。然而，针对肺部感染，异常临床表现和肺部影像学均具有滞后性，尤其是在高风险群体例如老年人或婴幼儿，他们通常表现出非典型症状，若早期诊断和治疗干预不及时极易并发败血症或急性呼吸衰竭。此外，已知的生物标志物如红细胞沉降率、降钙素原和C反应蛋白缺乏足够的特异性，重症肺炎的早期诊断形势依然严峻。
外泌体是源于内体系统的纳米级细胞外囊泡(30nm-150nm)，具有脂质双层膜结构。几乎所有类型的细胞均能产生，并广泛分布于唾液、血浆、乳液、脑脊液、尿液和支气管肺泡灌洗液等体液中。外泌体携带与细胞来源有关的多种蛋白质、脂质和核酸等，且其内容物组成因细胞起源和细胞的生理状态而不同。MicroRNAs(miRNAs)是外泌体的重要成分之一，越来越多的证据表明，miRNAs是选择性的整合到外泌体中，而不是随意包裹其中。亲代细胞具有一种引导特定细胞内miRNAs进入外泌体的分选机制。这些特性表明，外泌体miRNAs具有作为诊断生物标志物的巨大潜力。与传统生物标志物相比，外泌体具有广泛性、稳定性及可修饰性的优势；与蛋白质标志物相比，miRNAs具有独特的优点，例如，在不同途径中差异表达的多种miRNAs的组合将提供比蛋白质标记物更多的信息，且比开发针对特定蛋白质的特定抗体更省时省力。最重要的是，以核酸扩增技术为基础的分子生物学技术的迅速发展，可以快速准确地检测miRNAs水平，为基于外泌体miRNAs表达水平的诊断提供了快速、灵敏、特异及稳定的检测方法。
现有技术中公开了儿童腺病毒肺炎相关的外泌体miRNA及应用，该miRNA可以很好地区分儿童腺病毒肺炎和正常儿童。但目前还未有针对于重症肺炎的外泌体miRNA检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供外泌体miR-17-5p在制备重症肺炎的检测产品中的应用。本发明基于检测支气管肺泡灌洗液中外泌体miR-17-5p的表达水平，实现快速特异性识别重症肺炎患者的检测。
本发明的第一个目的是提供外泌体miR-17-5p在制备重症肺炎的检测产品中的应用。
本发明的第二个目的是提供外外泌体miR-17-5p的表达水平的检测产品在制备重症肺炎诊断的检测产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供外泌体miR-17-5p的检测引物在制备重症肺炎的检测产品中的应用。
本发明的第四个目的是提供述外泌体miR-17-5p的检测引物在制备所述外泌体miR-17-5p的表达水平检测试剂中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种重症肺炎的检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明通过超速离心法富集被检者支气管肺泡灌洗液中的外泌体，提取外泌体总RNA，按照Takara公司的miRNA FirstStrand Synthesis操作说明书进行逆转录并合成cDNA。设计hsa-miR-17-5p(所述外泌体miR-17-5p)的特异性引物，配制RT-qPCR反应体系，按照2-ΔΔCT计算各样本对应miR-17-5p表达水平，并据此判定所述样品是否来源于重症肺炎患者；本方法提供一种灵敏高效的快速检测方法。
因此，本发明要求保护以下内容：
外泌体miR-17-5p在制备重症肺炎的检测产品中的应用，所述外泌体为支气管肺泡灌洗液中的外泌体；所述外泌体miR-17-5p核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
外泌体miR-17-5p的表达水平的检测产品在制备重症肺炎诊断的检测产品中的应用。
优选地，所述外泌体为支气管肺泡灌洗液中的外泌体。
更优选地，所述外泌体miR-17-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
外泌体miR-17-5p的检测引物在制备重症肺炎的检测产品中的应用，所述外泌体为支气管肺泡灌洗液中的外泌体；所述外泌体miR-17-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述检测引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
更优选地，所述检测产品为检测试剂和/或检测试剂盒。
本发明还要求一种重症肺炎的检测试剂盒，所述检测试剂盒含所述外泌体miR-17-5p的表达水平检测试剂。
优选地，所述表达水平检测试剂为核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的检测引物。
优选地，所述检测试剂盒还包括RT-qPCR的试剂。
优选地，所示RT-qPCR的试剂为Takara公司的miRNA FirstStrand Synthesis试剂盒和 Premix Ex TaqTM
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用分子生物学技术，基于外泌体中miR-17-5p的表达水平快速、准确地将重症肺炎患者从无呼吸道感染者中检测出来，具有很好的应用前景和推广价值；
(1)特异性强：直接提取支气管肺泡灌洗液中的外泌体，其内容物组成受肺组织病理生理改变的影响最直接；(2)灵敏度高：RT-qPCR检测方法灵敏度高，可高效识别重症肺炎患者；(3)高效快速：现代分子生物学技术发展迅速，可以实现快速准确地检测miR-17-5p的水平；(4)准确性高：引物与靶序列特异性结合，保证了RT-qPCR扩增结果的高度准确性，从而提高了检测重症肺炎患者的准确性。
附图说明
图1为RT-qPCR方法检测支气管肺泡灌洗液中外泌体miR-17-5p表达水平的方法流程图。
图2支气管肺泡灌洗液中外泌体中miR-17-5p表达诊断重症肺炎的受试者工作特征(ROC)曲线。
图3BALF中外泌体miR-17-5p与临床常用血清生物标志物hsCRP、PCT水平诊断效果的比较。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1引物设计
1、实验方法
根据miRBase数据库hsa-miR-17-5p成熟体序列(miRBase:>hsa-miR-17-5pMIMAT0000070，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)设计适用于RT-qPCR的特异引物，并进行特异性、灵敏度和扩增效率的筛选。
Mature sequence hsa-miR-17-5p(SEQ ID NO:1)：
5’-CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3’；
2、实验结果
根据特异性、灵敏度和扩增效率的确定了一组检测外泌体中miR-17-5p的RT-qPCR的特异引物组合，其信物信息如下：
U6 Forward Primer：使用Takara公司的miRNA FirstStrand Synthesis试剂盒；
U6 Reverse Primer：使用Takara公司的miRNA FirstStrand Synthesis试剂盒；
上游引物hsa-miR-17-5p-specific Primer(SEQ ID NO:2)：
5’-CAAAGTGCTTACAGTGCAG-3’；
mRQ3’Prime：使用Takara公司的miRNA FirstStrand Synthesis试剂盒。
实施例2重症肺炎的检测试剂盒的建立
一、检测试剂盒的组成
核苷酸序列如SEQ ID NO:2引物；来自Takara公司的miRNA FirstStrandSynthesis试剂盒中(含有mRQ3’Prime、U6 Forward Primer和U6 Reverse Primer)；ddH2O、 Premix Ex TaqTM和Takara公司的miRNA FirstStrand Synthesis试剂盒。
二、检测试剂盒的使用(如图1所示)
1、超速离心法提取待检样本(支气管肺泡灌洗液)中的外泌体。
1)将收集的支气管肺泡灌洗液，用300×g，离心10mim，去除细胞，收集上清。
2)上一步上清转移到新的离心管，14,000×g，离心30min，去除残留的细胞、细菌及凋亡小体等，收集上清。
3)上一步上清转移至超速离心管中，100,000×g，离心90min，弃去上清，加入无菌PBS重悬沉淀即为外泌体，置于-80℃保存备用或立即使用。
2、外泌体RNA的提取
1)向提取到的外泌体样本中加入Trizol补足1ml，15～30℃静置5min；
2)将步骤1)的样品取出，加入200μL氯仿，涡旋振荡混匀15s，室温静置5min，4℃；12000g离心15min；离心后分3层，无色透明上层为RNA层，收取无色透明上清备用；
3)将步骤2)收集到的上清，转移到新的无RNA酶EP管中，加入与上清等体积的异丙醇来沉淀RNA分子；15～30℃，静置5min；4℃，12000g离心10min，离心管可见胶状沉淀；
4)弃步骤3)的样品上清，在沉淀中加入1ml 75％乙醇，涡旋震荡，4℃，12000g，离心5min，洗两遍，将EP管倒置在滤纸上至乙醇挥发干净；
5)加入15μL DEPC水(碧云天生物公司，中国)，溶解RNA沉淀，用移液器吹打沉淀，然后55～60℃下放置10min促进溶解；
6)使用NanoDprop2000超微量分光光度计测定RNA质量和浓度。
3、合成cDNA
按照Takara公司的miRNA FirstStrand Synthesis操作说明书，对提取到的外泌体RNA进行逆转录合成cDNA。
4、RT-qPCR反应
RT-qPCR试剂见表1：
表1RT-qPCR实验所用试剂
扩增程序为：
变性95℃10s；
qPCR反应95℃5s，60℃20s，×40循环；
溶解曲线95℃60s，55℃30s，95℃，30s。
5、扩增产物分析
每个样设置三个复孔，读取各个样本的CT值，按照2-ΔΔCT计算各样本对应miR-17-5p表达水平。
6、统计学分析，选定诊断界值
将步骤5计算所得的miR-17-5p相对表达量使用专业统计分析软件MedCalc19.6.0处理和分析，得到最佳诊断标准为1.45，即miR-17-5p相对表达量大于1.45则初步判断为重症肺炎患者，需密切监测或进行影像学检查。
实施例3通过外泌体miR-17-5p识别重症肺炎的诊断效果分析
一、实验方法
使用实施例2的检测试剂盒对7名非下呼吸道感染者和28名重症肺炎患者的支气管肺泡灌洗液样品进行检测。
二、实验结果
结果如图2所示，采用受试者工作特征(ROC)曲线评价外泌体miR-17-5p对重症肺炎的诊断效果。结果显示，支气管肺泡灌洗液中外泌体miR-17-5p的表达水平诊断重症肺炎的ROC曲线下面积(AUC)为0.829，95％置信区间(95％CI)为0.657～0.937，标准误为0.071，P＝0.001；当临界值取1.45时，灵敏度为71.43％，特异度为100％。
实施例4检测效果与临床常用生物标志物诊断效果的比较
一、实验方法
使用外周静脉穿刺采血方法获取患者外周血标本，采集ICU患者常用感染生物标志物：降钙素原(PCT)和超敏C反应蛋白(hsCRP)，血生化指标PCT、hsPCT选用日立(日本)600型全自动生化分析仪进行检测。同时，使用实施例2的检测试剂盒对患者支气管肺泡灌洗液中外泌体miR-17-5p表达量进行RT-qPCR检测。采用ROC曲线比较所述三种生物标志物的诊断效果。
二、实验结果
结果见表2和图3，ROC曲线显示，支气管肺泡灌洗液(BALF)中的外泌体miR-17-5p具有较高的诊断效果，其AUC值为0.829，高于临床常用的PCT和hsCPR。多指标联合诊断的曲线下面积为0.957，大于其他单项指标检测。
采用Medcalc软件对多个指标联合诊断的ROC分析，具体操作步骤如下：
1.定义变量：建立表格：如第一列(testa)为PCT的值；第二列(testb)为hsCRP,第三列(test)为miR值，为数值变量；disease为疾病状态，0为无病，1为有病(重症肺炎)。
2.数据导入MedCalc
3.logistic回归
点击Statistics——Regression——Logistic regression在Logisticregression对话框中，在Dependent Variable框选择Disease，在Independent Variable框中第一、二、三行分别选择testa、testb和testc。在Logistic Regression结果对话框中，Save predicted probabilities，就把概率保存到数据集中了
4.此时数据框中多了一LOGREGR_Pred1，即testa、testb和testc通过logistic产生的预测概率值，综合反应testa、testb和testc的诊断能力，用LOGREGR_Pred1绘制的ROC曲线即为三者的联合诊断结果。
表2血清PCT、hsCRP、外泌体miR-17-5p的诊断效果
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 中山大学
<120> 外泌体miR-17-5p在制备重症肺炎的检测产品中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
caaagugcuu acagugcagg uag 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caaagtgctt acagtgcag 19
Claims (4)
1.外泌体miR-17-5p的表达水平的检测产品在制备重症肺炎诊断的检测产品中的应用，其特征在于，所述重症肺炎诊断为区分非下呼吸道感染者与重症肺炎患者；所述外泌体miR-17-5p为支气管肺泡灌洗液中的外泌体；所述外泌体miR-17-5p的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.外泌体miR-17-5p表达水平的检测引物在制备重症肺炎诊断的检测产品中的应用，其特征在于，所述外泌体为支气管肺泡灌洗液中的外泌体；所述外泌体miR-17-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述重症肺炎诊断为区分非下呼吸道感染者与重症肺炎患者。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述检测引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求1到3任一所述应用，其特征在于，所述重症肺炎诊断检测产品为检测试剂或检测试剂盒。
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