CN114354909A - 一种dna折纸-适配体纳米阵列传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种DNA折纸‑适配体纳米阵列传感器及其制备方法和应用，涉及生物传感器技术领域。本发明提出了一种DNA折纸‑适配体纳米阵列，能够实现荧光光谱的高灵敏度、高特异性检测。ATP双链核酸适配体通过简单的碱基互补配对结合在三角形DNA折纸上，根据适配体和目标物的特异性结合，以及折纸和目标物‑适配体混合物的分子量差异，用100KD超滤管离心定量ATP的浓度。ATP的检测范围为0.1ng/mL～1000ng/mL，检测限为0.29ng/mL，传感器具有良好的特异性，并且可以重复使用。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种DNA折纸-适配体纳米阵列传感器及其制备方法和应用。
背景技术
生物传感器是一种分析工具，可以将识别相关分析物时检测到的生化反应或过程转换为其他可读取的输出信号，如光学、电学等。随着临床诊断、环境监测、重要生理功能监测和食品检测等领域对快速、现场、高灵敏度、高特异/选择性检测的要求越来越高，相比传统的检测方法，各种各样的生物传感器因为操作简便、用户友好、检测速度快、灵敏度高的优点越来越受到关注。DNA纳米技术的快速发展为开发新的用于检测的生物传感器提供了良好的基础。其精确操控纳米材料的能力以及DNA本身良好的生物相容性，促使科学家们不断探索更多的可能性。其中支架式DNA折纸(Scaffolded DNA origami)技术是非常具有代表性的DNA结构纳米技术，是一种自下而上制造复杂的、任意形状的、尺寸从几十纳米到亚微米的精确可编程自组装纳米结构的有效技术。
DNA折纸是由一条长的ssDNA脚手架链，通常是M13噬菌体病毒长DNA链，和许多条(通常约200个)短的订书钉链通过有序的折叠而形成的2D或3D结构。这些短链与支架链的线性末端系列互补，最大化与订书钉链的碱基配对使远端序列非常接近，这样就可以形成目标形状。DNA折纸技术在生物传感方面的应用已经有很多报道。在电化学，荧光和显微成像的分析中，有许多DNA折纸与适配体或单链核苷酸结合用于传感的报告。例如，AkinoriKuzuya等人创建了DNA折纸钳装置，该装置将DNA或RNA链以及适配体整合到DNA折纸结构上，并使用原子力显微镜以单分子的方式通过观察折纸形状的转换视觉检测从金属离子到蛋白质的多种无机或有机目标物。Denis Selnihhin等人利用DNA折纸形状的多样性和精确组装的能力，设计并组装了一个含有荧光供体和受体阵列的动态DNA折纸装置，允许使用主流的荧光显微镜进行单设备分析。然而，这些设备依赖于对DNA折纸结构的设计，繁琐先进的实验技术和耗时的读数，因此他们的应用受到了很大的限制。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种DNA折纸-适配体纳米阵列传感器及其制备方法和应用，所述纳米阵列传感器具有良好的特异性，可以重复使用，为DNA折纸技术在小分子检测中的应用开辟了新的策略。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种DNA折纸-适配体纳米阵列传感器，所述纳米阵列传感器以三角形DNA折纸为模板，在所述三角形DNA折纸的部分单链上连接结合位点，所述结合位点与荧光标记的目标物的双链核酸适配体特异性结合。
优选的，所述结合位点包括PolyA15。
优选的，所述目标物包括ATP；
当所述目标物为ATP时，所述双链核酸适配体包括P1和P2，其中P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述结合位点和双链核酸适配体分别标记不同的荧光。
本发明还提供了上述纳米阵列传感器的制备方法，包括以下步骤：将M13基因链、订书钉链和捕获链以1：10：10的摩尔比混合，以0.1℃/10s的速率从95℃冷却到25℃进行自组装，得三角形DNA折纸；
在所述三角形DNA折纸的可寻址表面上对部分单链进行简单延伸，得所述纳米阵列传感器。
优选的，得三角形DNA折纸后，还包括过滤除去过量的单链；
所述过滤包括利用100kDa MWCO除去过量的单链DNA。
本发明还提供了上述纳米阵列传感器在定量检测目标物含量中的应用。
本发明还提供了一种定量检测目标物的方法，包括以下步骤：将上述纳米阵列传感器与等体积不同浓度的目标物混合孵育1h，利用100kD超滤管进行离心，记录滤液在510nm～700nm之间的光谱，制作标准曲线，利用标准曲线测算目标物的浓度。
优选的，当所述目标物为ATP时，所述标准曲线为y＝372.28x+1130.8，R2＝0.9872，其中x为ATP浓度的对数，y为ATP为0ng/mL时的荧光值与不同浓度的ATP所对应的荧光值的差值。
优选的，所述光谱的激发波长为480nm，激发和发射的狭缝宽度均固定为10nm。
有益效果：本发明提供了一种DNA折纸-适配体纳米阵列传感器，使用三角形DNA折纸为模板，在折纸上伸出识别探针(结合位点)，用于结合荧光团标记的双链核酸适配体，根据适配体与目标物的特异性结合反应，以及折纸和适配体的分子量差异，巧妙的利用超滤管离心的方法将带有适配体的折纸阵列和目标物-适配体复合体分开，实现了用普通的荧光分光光度计高特异性和高灵敏度定量检测目标物。在本发明实施例中，将ATP双链核酸适配体通过简单的碱基互补配对结合在三角形DNA折纸上，根据适配体和目标物的特异性结合，以及折纸和目标物-适配体混合物的分子量差异，用100KD超滤管离心定量ATP的浓度。结果表明，ATP的检测范围为0.1ng/mL～1000ng/mL，标准曲线方程为y＝372.28x+1130.8(R2＝0.9872)，检测限为0.29ng/mL，传感器具有良好的特异性，并且可以重复使用，为DNA折纸技术在小分子检测中的应用开辟了新的策略。
本发明还提供了DNA折纸-适配体纳米阵列传感器的制备方法以及在定量检测目标物种的应用，识别探针通过缓慢冷却结合在DNA折纸上，无需生物偶联步骤，这大大节省时间，减少系统准备步骤；检测系统可充电，检测机制基于DNA链的杂交和置换，因此在每一轮检测后，可将额外的双链核酸适配体添加到阵列溶液中，并重新杂交到阵列上，以供检测系统重复使用；精确控制相邻适配体之间的空间距离和溶液中的结合过程，使得靶与适配体的结合更有效；基于DNA折纸的检测平台有望通过结合不同的信号适配体，可以实现多种目标物的同时检测。
附图说明
图1为基于DNA折纸-适配体纳米阵列检测ATP的原理图；其中a：用24条捕获链结合互补链和适配体后的DNA折纸的合成步骤；b：24个双配体的DNA折纸结合示意图；c：DNA折纸双核酸适配体纳米阵列的AFM图；d：Ultra-0.5ml 100kD离心过滤器(Millipore)检测ATP的过程；
图2为DNA折纸-双链适配体纳米阵列的表征；
图3为基于DNA折纸-双链适配体纳米阵列检测ATP的验证；
图4为基于DNA折纸-双链适配体的纳米阵列检测不同浓度的ATP的荧光光谱图；
图5为基于DNA折纸-双链适配体的纳米阵列的充电重复使用。
具体实施方式
本发明提供了一种DNA折纸-适配体纳米阵列传感器，所述纳米阵列传感器以三角形DNA折纸为模板，在所述三角形DNA折纸的部分单链上连接结合位点，所述结合位点与荧光标记的目标物的双链核酸适配体特异性结合。
本发明所述三角形DNA折纸优选根据Rothemund(Rothemund,P.W.,Folding DNAtocreate nanoscale shapes andpatterns.Nature,2006.440(7082):p.297-302.)的方法进行构建，具体的在本发明实施例中，分别在三角形DNA折纸A、B、C三条边的51、39、06、18、52、40、07、19订书钉链上延申出PolyA15，形成捕获链。本发明在构建所述三角形DNA折纸时，优选还对Rothemund提供的方法进行了改进，更优选地包括：将订书钉链和捕获链(修饰链)分别稀释为500nmol/L；M13基因链(M13mp18，100nmol/L)脚手架链与订书钉链和捕获链以摩尔浓度1:10:10的比例混合在1×TAE-Mg2+缓冲溶液中(Tris，40mM；Acetic acid，20mM；EDTA，2mM；andMagnesium acetate，12.5mM；pH 8.0)，经PCR仪以0.1℃/10s的速率从95℃缓慢冷却到25℃进行组装。本发明得三角形DNA折纸后，优选还包括过滤除去过量的单链，所述过滤优选为利用100kDaMWCO超滤膜进行过滤，以除去过量的短链，从而得到高纯度的DNA折纸。在本发明中，所选用的100kDaMWCO超滤膜优选为Ultra-0.5ml 100kD超滤管(Millipore)。
本发明所述M13基因链已公开，可通过http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/sequences/m13mp18.txt查询得到、订书钉链和捕获链的序列分别为表1所示。
表1本发明所用单链基因序列
本发明所述结合位点优选包括PolyA15，在本发明中，当所述目标物为三磷酸腺苷(ATP)时，与ATP结合的适配体优选为采用“协同稳定”的概念设计的双链核酸探针P1-P2，其中P1的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示：5’-cactgACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’，P2的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示：5’-CCCAGGTcagtg-3’。其中，P1是在ATP适配体(P1中大写字母表示的碱基序列)的5’端添加一段非核酸适体短序列(包含5个碱基5'-cactg-3'，用小写字母表示的非核酸适体碱基序列)，P2是与5个碱基的非核酸适体短序列和其相邻的7个核酸适体短序列(5'-ACCTGGG-3')互补配对的12个碱基，这样设计的目的是在获得稳定双链核酸结构的同时，尽量减少参与形成双链核酸结构的核酸适体碱基的数量，从而最大程度地保持核酸适体的本体构象，促进双链核酸识别探针与目标分子ATP的链置换反应的快速进行。
本发明所述结合位点和双链核酸适配体优选分别标记不同的荧光，在本发明实施例中，所述三角形DNA折纸上的四条短链上标记绿色荧光Alexa488，ATP的适配体和互补链上分别标记Cy5和Cy3染料，形成折纸阵列。
本发明还提供了上述纳米阵列传感器的制备方法，包括以下步骤：将M13基因链、订书钉链和捕获链以1：10：10的摩尔比混合，以0.1℃/10s的速率从95℃冷却到25℃进行自组装，得三角形DNA折纸；
在所述三角形DNA折纸的可寻址表面上对部分单链进行简单延伸，得所述纳米阵列传感器。
本发明所述三角形DNA折纸的构建方法优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明对所述可寻址表面上部分单链进行简单延伸，优选分别在三角形DNA折纸A、B、C三条边的51、39、06、18、52、40、07、19订书钉链上延伸出PolyA15，形成识别探针，如表1中ATP适配体的识别探针与补充链(Capture strands forATP aptamer andComplementary strand loading)所示。
本发明还提供了上述纳米阵列传感器在定量检测目标物含量中的应用。
在本发明实施例中，以ATP为目标物时，ATP适配体探针不参与DNA折纸的合成，而是通过对折纸上部分订书钉单链延伸出一段PolyA15使折纸功能化，然后在ATP的互补链上伸出一段PolyT15使其能够通过碱基互补配对的方式结合在DNA折纸上，同时，ATP的适配体与互补链结合形成DNA双链结构。而且，利用本发明所述制备方法制备得到的三角形DNA折纸是由208条短链和一条长单链通过碱基互补配对形成的大分子量核酸，Ultra-0.5ml100kD超滤管(Millipore)能够将其截留在管内，而适配体的分子量要小的多，不能被Ultra-0.5ml 100kD超滤管截留，可以透过超滤管滤膜离心除去。当检测系统中存在ATP分子时，由于ATP与其适配体之间强的亲和力，双链探针打开，目标探针复合体从阵列表面释放，留下DNA折纸上空的互补链通。过超滤管(100kDaMWCO,Amicon,Millipore)离心去除释放的目标物-探针复合体，DNA折纸阵列荧光值降低。然而，检测系统中不存在ATP时，双链核酸适配体探针无法打开，DNA折纸阵列荧光值高。基于这一机制，提出了一种基于DNA折纸双链核酸适体的荧光传感平台用于评估检测系统中ATP的含量(图1)。
本发明还提供了一种定量检测目标物的方法，包括以下步骤：将上述纳米阵列传感器与等体积不同浓度的目标物混合孵育1h，利用100kD超滤管进行离心，记录滤液在510nm～700nm之间的光谱，制作标准曲线，利用标准曲线测算目标物的浓度。
在本发明中，当利用所述方法定量测定ATP时，随着ATP浓度(0ngmL至1000ng/mL)的增加，FAM荧光团在520nm处的发射峰值逐渐减弱。I0-Ic即ATP为0ng/mL时的荧光值与不同浓度的ATP所对应的荧光值的差值(y)，与ATP浓度的对数(x)之间的关系为：y＝372.28x+1130.8(R2＝0.9872)，检出限(LOD)为0.29ng/mL。本发明在机理所述光谱时，优选设定激发波长为480nm，激发和发射的狭缝宽度均固定为10nm。
下面结合实施例对本发明提供的一种DNA折纸-适配体纳米阵列传感器及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明所使用的试剂、材料和仪器，如非特殊说明，均为本领域的常规市售产品。
1、材料
所有的核苷酸链包括订书钉链和适配体都购买自生工生物工程(上海)股份有限公司(上海，中国)Sangon Biotech(Shanghai)。折纸订书钉链溶解为100μM后储存在管中。M13mp18病毒DNA购买自NEB公司(New England Biolabs)，货号#N4040S，浓度为100nM。三磷酸腺苷(ATP>99％)，三磷酸尿苷(UTP>99％)，三磷酸鸟苷(GTP>99％)，三磷酸胸苷(CTP>99％)购自阿拉丁试剂(上海，中国)Aladdin Reagents(Shanghai,China)。乙酸镁购自阿拉丁，EDTA二钠盐和Tris购自索莱宝(Solarbio)，乙酸购自九鼎化学。所有试剂无需进一步纯化即可使用。实验用超纯水由Millipore超纯净水净化系统(电阻率18MΩ·cm)制备。
2、仪器设备
用日本SHIMADZU-1901型光谱仪记录了UV-Vis的吸收光谱。所有荧光光谱用日本F-4500荧光分光光度计测量。用德国Bruker公司的原子力显微镜(AFM)记录折纸的形貌特征，采用激光共聚焦显微镜(尼康)记录折纸阵列的合成。所有折纸或折纸阵列的合成使用PCR仪(BIO RAD/伯乐T100型)退火的方法。
实施例1
1、DNA折纸模板的自组装和纯化
根据Rothemund的方法，稍加修改后组装形成三角形DNA折纸结构。折纸合成的具体步骤如下：将需要替代的订书钉链(捕获链)去除，其余未修改短链(非捕获链)等体积混合并稀释至500nmol/L备用。捕获链(修饰链)以同样方式混合并稀释至500nmoL/L备用。M13mp18(C＝100nmol/L)脚手架链与订书钉链和捕获链以摩尔浓度1:10:10的比例混合在1×TAE-Mg2+缓冲溶液中，经PCR仪以0.1℃/10s的速率从95℃缓慢冷却到25℃进行组装，具体体系为100μL：M13mp182.5μL、订书钉链5μL、捕获链5μL、10×TAE-Mg2+10μL、超纯水77.5μL。
合成的折纸混合物用Ultra-0.5ml 100kD超滤管(Millipore)离心除去过量的短链，从而得到高纯度的DNA折纸。纯化后的折纸溶液被收集并用1％的琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜进行表征。
2、DNA折纸阵列的合成Ori-cDNA-Apt(DNA Origami complementary DNA和Aptamer)与表征
将纯化后的折纸与ATP的互补链和适配体组装形成ATP检测组件。具体步骤如下：纯化后的折纸进行紫外-可见分光光度计(UV–VIS spectrophotometer)定量，计算折纸的相应浓度，c＝12.6A，A为260nm处的紫外吸光度值。然后Ori：cDNA：Apt以1：3：6的摩尔浓度比配制，以保证折纸上的捕获链和ATP的互补链充分结合，同时保证互补链和适配体的完全结合。将三种溶液等体积混合在1×TAE-Mg2+缓冲溶液中，置于PCR仪中以5min/℃的速率从45℃缓慢降至25℃，循环6个周期。
折纸阵列的纯化和浓缩是通过Ultra-0.5ml 100kD超滤管离心实现的。收集纯化后的折纸纳米阵列(nanoarray)并用紫外-可见分光光度计(UV–VIS spectrophotometer)进行定量，然后使用1％琼脂糖凝胶电泳，原子力显微镜和激光共聚焦显微镜对纳米阵列进行表征。
2.1原子力显微镜表征
对于DNA折纸结构，将折纸样品用1×TAE～Mg2+缓冲溶液稀释5～20倍，取5μL沉积在新鲜解离的云母片上，并在表面吸附3min，然后用100μL超纯水冲洗，用氮气吹干后进行成像。DNA折纸在适配体装载前后的原子力显微镜成像在气相ScanAsyst模式下进行。
2.2凝胶电泳
DNA折纸-适体组件在1％的琼脂糖凝胶上分离(Gene Green染色，电泳缓冲液为0.5×TBE～11mM Mg2+，冰水浴条件下，100V恒压电泳40min)并在紫外线照射下成像。
2.3激光共聚焦显微镜表征
利用激光共聚焦显微镜成像研究折纸阵列的合成。折纸上四条短链上标记绿色荧光Alexa488，ATP的适配体和互补链上分别标记Cy5和Cy3染料，形成折纸阵列，然后将样品滴在载玻片上，调节参数，在489nm，560nm，和640nm通道的激发下，以512x512像素分辨率(单位像素尺寸6.21×6.21μm2)拍摄一帧3×3mm2的图像。
图2中a至f显示了裸的DNA折纸，修饰了24条捕获链的DNA折纸以及结合了双链适配体的DNA折纸所对应的AFM表征图和相应的横截面分析。首先，修饰了24条捕获链的DNA折纸以及结合了双链适配体的DNA折纸的高度达到3nm左右，而裸的DNA折纸高度在2nm左右，其次，结合了双链适配体的DNA折纸的高度图显示出明显的波动，这可能是由于双链适配体的结合所引起的。图2中g表明24条分子探针的结合并不影响折纸的形貌和分散性。通过琼脂糖凝胶电泳分析纯化的折纸阵列(图2中i)，在紫外线(UV)照射下，M13支架链，三角形DNA折纸，折纸-互补链和折纸-双链阵列呈现出不同的条带。随着适配体结合数量的增加，组装体的条带迁移率减小，并且组装体的荧光值也逐渐升高。用激光扫描共聚焦成像，在489nm，560nm，和640nm通道激发下，观察到明显的绿色荧光和红色荧光，表明双链适配体成功结合到DNA折纸上(图2中h)，此外，荧光表征也说明了双链适配体的成功结合。通过对不加捕获链的折纸和折纸-适配体阵列的高度进行分析，发现后者(2.60±0.22nm)比前者(2.29±0.17nm)高0.31nm。因此，本发明设计和制备的带有24条捕获链的折纸结构，捕获链之间的距离为21nm和6nm，为核酸探针的结合提供了足够的空间，防止了荧光的自猝灭效应。
实施例2
1、ATP的检测
ATP的标准溶液(1mg/mL)溶解于1×TAE-Mg2+缓冲溶液中，首先，50μL 5μM的折纸阵列与等体积不同浓度的目标物混合，混合物在37℃孵育1h，随后，Ultra-0.5ml100kD超滤管(Millipore)被用于混合物的离心，离心条件为室温下，3000g，5min。最后，收集内管中折纸阵列溶液，其荧光发射光谱用日立F-4500荧光分光光度计(日本)收集。FAM荧光染料的激发波长为480nm，记录510nm-700nm之间的光谱，激发和发射的狭缝宽度都固定为10nm。所有测量均在1×TAE-Mg2+缓冲溶液中(pH 8.0)中进行。
2、特异性实验
选取ATP的结构类似物，如三磷酸尿苷(UTP)，三磷酸胞苷(CTP)和三磷酸鸟苷(GTP)对ATP检测的选择性进行评估。ATP和其他化合物的浓度分别为0.1ng/mL和100ng/mL，分析条件同上ATP的检测。
3、DNA折纸的重复利用
本发明的检测原理是基于DNA双链核酸适配体的链杂交和置换，因此检测系统是可充电的，在每一轮检测后，3倍过量的ATP的适配体浓度添加到阵列的溶液中，并重新以退火的方式杂交到阵列中，以供检测系统重复使用。
如图3中a所示，折纸阵列加入双链适配体后荧光值升高，说明双链适配体成功标记在DNA折纸上，在加入1mg/mL的ATP后，通过超滤管离心5min，收集的内管溶液荧光值发生明显的降低。这表明，ATP与其适配体(aptamer)之间有更强的亲和力，能够将双链探针上的FAM-aptamer竞争下来，从而使FAM-aptamer从折纸阵列上脱离，通过离心将其携带的荧光基团去除，进而使折纸阵列上的荧光值降低。图3中b显示出折纸阵列经4个不同批次超滤管离心所得的荧光值和浓度均无明显差异，表明超滤管可以用于定量分析ATP。图3中c显示了4个不同批次合成的折纸阵列的荧光值变化，表明折纸阵列的合成非常稳定。因此，这些实验表明基于DNA折纸的双链适配体平台结合超滤离心的方法可以用于目标物ATP的检测。
如图4中a所示，随着ATP浓度(0ngmL至1000ng/mL)的增加，FAM荧光团在520nm处的发射峰值逐渐减弱。I0-Ic，即ATP为0ng/mL时的荧光值与不同浓度的ATP所对应的荧光值的差值(y)，与ATP浓度的对数(x)之间的关系如图4中b和c所示，线性检测范围为0.1ng/mL至1000ng/mL，标准曲线方程为y＝372.28x+1130.8(R2＝0.9872)，检出限(LOD)为0.29ng/mL。
本发明还检测了实施例1得到的纳米阵列传感器对ATP类似物(GTP、UTP、CTP)的响应情况，评估了所述传感器检测ATP的选择性(图4中d)。分别利用0.1ng/mL的ATP和100ng/mL的GTP、UTP、CTP进行测试，观察到低浓度的ATP能够显著地降低荧光，从而得到较大的荧光差值(约400)，而比ATP浓度高出1000倍的三种干扰物质的荧光差值(I0-Ic)是ATP荧光差值的一半(约200)，表明ATP能够诱发该生物传感器中双链适配体的链置换反应，从而使FAM-aptamer从折纸阵列中移出，而其类似物不会引起链置换反应，进而不会影响折纸阵列的荧光强度。因此，与其他核苷酸类似物相比，ATP结合适配体赋予该生物传感器高的特异性，从而使其对ATP具有明显的选择性。
正因为本发明的检测方法基于DNA双链适配体的链杂交和置换，所以检测系统是可重复利用的，如图5中a所示，在每一轮检测后，将额外的核酸适配体与折纸阵列溶液混合，并重新通过退火的方式杂交到折纸上，以供检测系统的重复使用。如图5中b所示，在重新加入适配体的折纸阵列中加入1mg/mL的ATP后，荧光值明显下降。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
<120> 一种DNA折纸-适配体纳米阵列传感器及其制备方法和应用
<160> 218
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cactgacctg ggggagtatt gcggaggaag gt 32
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tttgatgatt aagaggctga gacttgctca gtaccaggcg 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gacgggagaa ttaactcgga ataagtttat ttccagcgcc 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gataagtgcc gtcgagctga aacatgaaag tatacaggag 40
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgtactggaa atcctcatta aagcagagcc ac 32
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caccggaaag cgcgttttca tcggaagggc ga 32
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cattcaacaa acgcaaagac accagaacac cctgaacaaa 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tttaacggtt cggaacctat tattagggtt gatataagta 40
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctcagagcat attcacaaac aaattaataa gt 32
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggagggaatt tagcgtcaga ctgtccgcct cc 32
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtcagagggt aattgatggc aacatataaa agcgattgag 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tagcccggaa taggtgaatg ccccctgcct atggtcagtg 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttgacggaaa tacatacata aagggcgcta atatcagaga 40
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cagagccagg aggttgaggc aggtaacagt gcccg 35
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<212> DNA
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attaaaggcc gtaatcagta gcgagccacc ct 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gataacccac aagaatgtta gcaaacgtag aaaattattc 40
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caccgtcacc ttattacgca gtattgagtt aagcccaata 40
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agccatttaa acgtcaccaa tgaacaccag aacca 35
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
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ccattagcaa ggccggggga atta 24
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tatcttaccg aagcccaaac gcaataataa cgaaaatcac cag 43
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<211> 43
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagaaggaaa ccgaggtttt taagaaaagt aagcagatag ccg 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccttttttca tttaacaatt tcataggatt ag 32
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<212> DNA
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tttaacctat cataggtctg agagttccag ta 32
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<212> DNA
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<400> 37
agtataaaat atgcgttata caaagccatc tt 32
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<212> DNA
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caagtacctc attccaagaa cgggaaattc at 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agagaataac ataaaaacag ggaagcgcat ta 32
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<212> DNA
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aaaacaaaat taattaaatg gaaacagtac attagtgaat 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actagaaata tataactata tgtacgctga ga 32
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 52
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gtgtgataag gcagaggcat tttcagtcct ga 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgctaacga gcgtctggcg ttttagcgaa cccaacatgt 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
acgacaataa atcccgactt gcgggagatc ctgaatctta cca 43
<210> 63
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
tgctattttg cacccagcta caattttgtt ttgaagcctt aaa 43
<210> 64
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tcatatgtgt aatcgtaaaa ctagtcattt tc 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gtgagaaaat gtgtaggtaa agatacaact tt 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcatcaaat ttggggcgcg agctagttaa ag 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
ttcgagctaa gacttcaaat atcgggaacg ag 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
acagtcaaag agaatcgatg aacgaccccg gttgataatc 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
agaaaagccc caaaaagagt ctggagcaaa caatcaccat 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
caatatgacc ctcatatatt ttaaagcatt aa 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
catccaataa atggtcaata acctcggaag ca 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
aactccaaga ttgcatcaaa aagataatgc agatacataa 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
cgttctagtc aggtcattgc ctgacaggaa gattgtataa 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
caggcaagat aaaaattttt agaatattca ac 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gattagagat tagatacatt tcgcaaatca ta 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
gcaaatattt aaattgagat ctacaaaggc tactgataaa 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
taattgcttt accctgacta ttatgaggca tagtaagagc 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
ataaagcctt tgcgggagaa gcctggagag ggtag 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
taagaggtca attctgcgaa cgagattaag ca 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
aacactatca taacccatca aaaatcaggt ctccttttga 40
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
atgaccctgt aatacttcag agca 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
taaagctata taacagttga ttcccatttt tg 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
cggatggcac gagaatgacc ataatcgttt accagacgac 40
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
taattgcttg gaagtttcat tccaaatcgg ttgta 35
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gataaaaacc aaaatattaa acagttcaga aattagagct 40
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
actaaagtac ggtgtcgaat ataa 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
tgctgtagat ccccctcaaa tgctgcgaga ggcttttgca 40
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
aatactgcgg aatcgtaggg ggtaatagta aaatgtttag act 43
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agggatagct cagagccacc accccatgtc aa 32
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gccgctttgc tgaggcttgc aggggaaaag gt 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
cgacctgcgg tcaatcataa gggaacggaa caacattatt 40
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cacgcataag aaaggaacaa ctaagtcttt cc 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
attgtgtctc agcagcgaaa gacaccatcg cc 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
ttaataaaac gaactaaccg aactgaccaa ctcctgataa 40
<210> 103
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
aggtttagta ccgccatgag tttcgtcacc aggatctaaa 40
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
gttttgtcag gaattgcgaa taatccgaca at 32
<210> 105
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
gacaacaagc atcggaacga gggtgagatt tg 32
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
tatcatcgtt gaaagaggac agatggaaga aaaatctacg 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
agcgtaacta caaactacaa cgcctatcac cgtactcagg 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
accagtcagg acgttggaac ggtgtacaga ccgaaacaaa 40
<210> 109
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
acagacagcc caaatctcca aaaaaaaatt tctta 35
<210> 110
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
aacagcttgc tttgaggact aaagcgatta ta 32
<210> 111
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
ccaagcgcag gcgcataggc tggcagaact ggctcattat 40
<210> 112
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
cgaggtgagg ctccaaaagg agcc 24
<210> 113
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
acccccagac tttttcatga ggaacttgct tt 32
<210> 114
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
accttatgcg attttatgac cttcatcaag agcatctttg 40
<210> 115
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
cggtttatca ggtttccatt aaacgggaat acact 35
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaaacactta atcttgacaa gaacttaatc attgtgaatt 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcaaaagta aaatacgtaa tgcc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
tggtttaatt tcaactcgga tattcattac ccacgaaaga 40
<210> 119
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
accaacctaa aaaatcaacg taacaaataa attgggcttg aga 43
<210> 120
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
cctgacgaga aacaccagaa cgagtaggct gctcattcag tga 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
ttaattaatt ttttaccata tcaaa 25
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<211> 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
ttaatttcat cttagacttt acaa 24
<210> 123
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
ctgtccagac gtataccgaa cga 23
<210> 124
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
tcaagattag tgtagcaata ct 22
<210> 125
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
tgtagcattc cttttataaa cagtt 25
<210> 126
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
tttaattgta tttccaccag agcc 24
<210> 127
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
actacgaagg cttagcacca tta 23
<210> 128
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
ataaggcttg caacaaagtt ac 22
<210> 129
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
gtgggaacaa atttctattt ttgag 25
<210> 130
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
cggtgcgggc cttccaaaaa catt 24
<210> 131
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
atgagtgagc ttttaaatat gca 23
<210> 132
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
actattaaag aggatagcgt cc 22
<210> 133
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
gcgcttaatg cgccgctaca gggc 24
<210> 134
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
tcgggagata tacagtaaca gtacaaataa tt 32
<210> 135
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
cctgattaaa ggagcggaat tatctcggcc tc 32
<210> 136
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
gcaaatcacc tcaatcaata tctgcaggtc ga 32
<210> 137
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
cgaccagtac attggcagat tcacctgatt gc 32
<210> 138
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
tggcaatttt taacgtcaga tgaaaacaat aacggattcg 40
<210> 139
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
ttgacgagca cgtatactga aatggattat ttaataaaag 40
<210> 140
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
cctgattgct ttgaattgcg tagattttca ggcatcaata 40
<210> 141
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
taatcctgat tatcattttg cggagaggaa gg 32
<210> 142
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
ttatctaaag catcaccttg ctgatggcca ac 32
<210> 143
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
agagatagtt tgacgctcaa tcgtacgtgc tttcctcgtt 40
<210> 144
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
gattatacac agaaataaag aaataccaag ttacaaaatc 40
<210> 145
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
taggagcata aaagtttgag taacattgtt tg 32
<210> 146
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
tgacctgaca aatgaaaaat ctaaaatatc tt 32
<210> 147
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
agaatcagag cgggagatgg aaatacctac ataacccttc 40
<210> 148
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
gcgcagaggc gaattaatta tttgcacgta aattctgaat 40
<210> 149
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
gaatacgtaa caggaaaaac gctcctaaac aggaggccga 40
<210> 150
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
tcaatagata ttaaatcctt tgccggttag aacct 35
<210> 151
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
caatatttgc ctgcaacagt gccatagagc cg 32
<210> 152
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
ttaaagggat tttagatacc gccagccatt gcggcacaga 40
<210> 153
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
acaattcgac aactcgtaat acat 24
<210> 154
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
ttgaggatgg tcagtattaa caccttgaat gg 32
<210> 155
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
ctattagtat atccagaaca atatcaggaa cggtacgcca 40
<210> 156
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
cgcgaactaa aacagaggtg aggcttagaa gtatt 35
<210> 157
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
gaatcctgag aagtgtatcg gccttgctgg tactttaatg 40
<210> 158
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
accaccagca gaagatgata gccc 24
<210> 159
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
taaaacatta gaagaactca aactttttat aatcagtgag 40
<210> 160
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
gccaccgagt aaaagaacat cacttgcctg agcgccatta aaa 43
<210> 161
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
tctttgatta gtaatagtct gtccatcacg caaattaacc gtt 43
<210> 162
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
cgcgtctgat aggaacgcca tcaactttta ca 32
<210> 163
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
aggaagatgg ggacgacgac agtaatcata tt 32
<210> 164
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
ctctagagca agcttgcatg cctggtcagt tg 32
<210> 165
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
ccttcaccgt gagacgggca acagcagtca ca 32
<210> 166
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 166
cgagaaagga agggaagcgt actatggttg ct 32
<210> 167
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 167
gctcattttt taaccagcct tcctgtagcc aggcatctgc 40
<210> 168
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 168
tttcaccagc ctggccctga gagaaagccg gcgaacgtgg 40
<210> 169
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 169
gtaaccgtct ttcatcaaca ttaaaatttt tgttaaatca 40
<210> 170
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 170
acgttgtatt ccggcaccgc ttctggcgca tc 32
<210> 171
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 171
ccagggtggc tcgaattcgt aatccagtca cg 32
<210> 172
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 172
tagagcttga cggggagttg cagcaagcgg tcattgggcg 40
<210> 173
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 173
gttaaaattc gcattaatgt gagcgagtaa cacacgttgg 40
<210> 174
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 174
tgtagatggg tgccggaaac caggaacgcc ag 32
<210> 175
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 175
ggttttccat ggtcatagct gtttgagagg cg 32
<210> 176
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 176
gtttgcgtca cgctggtttg ccccaaggga gcccccgatt 40
<210> 177
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 177
ggataggtac ccgtcggatt ctcctaaacg ttaatatttt 40
<210> 178
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 178
ctaaatcgga accctaagca ggcgaaaatc cttcggccaa 40
<210> 179
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 179
cggcggattg aattcaggct gcgcaacggg ggatg 35
<210> 180
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 180
tgctgcaaat ccgctcacaa ttcccagctg ca 32
<210> 181
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 181
ttaatgaagt ttgatggtgg ttccgaggtg ccgtaaagca 40
<210> 182
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 182
tggcgaaatg ttgggaaggg cgat 24
<210> 183
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 183
tgtcgtgcac acaacatacg agccacgcca gc 32
<210> 184
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 184
caagtttttt ggggtcgaaa tcggcaaaat ccgggaaacc 40
<210> 185
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 185
tcttcgctat tggaagcata aagtgtatgc ccgct 35
<210> 186
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 186
ttccagtcct tataaatcaa aagagaacca tcacccaaat 40
<210> 187
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 187
gcgctcacaa gcctggggtg ccta 24
<210> 188
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 188
cgatggccca ctacgtatag cccgagatag ggattgcgtt 40
<210> 189
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 189
aactcacatt attgagtgtt gttccagaaa ccgtctatca ggg 43
<210> 190
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 190
acgtggactc caacgtcaaa gggcgaattt ggaacaagag tcc 43
<210> 191
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 191
aaaaaaaaaa aaaaagttaa atacaatcgc aagacaaagc cttgaaa 47
<210> 192
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 192
aaaaaaaaaa aaaaattatc aaaccggctt aggttgggta agcctgt 47
<210> 193
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 193
aaaaaaaaaa aaaaaccgga acccagaatg gaaagcgcaa catggct 47
<210> 194
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 194
aaaaaaaaaa aaaaaccttg agtcagacga ttggccttgc gccaccc 47
<210> 195
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 195
aaaaaaaaaa aaaaacccat cctcgccaac atgtaattta ataaggc 47
<210> 196
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 196
aaaaaaaaaa aaaaattagt atcgccaacg ctcaacagtc ggctgtc 47
<210> 197
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 197
aaaaaaaaaa aaaaaaaaga caacattttc ggtcatagcc aaaatca 47
<210> 198
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 198
aaaaaaaaaa aaaaatcaga acccagaatc aagtttgccg gtaaata 47
<210> 199
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 199
aaaaaaaaaa aaaaatagtt gcgaattttt tcacgttgat catagtt 47
<210> 200
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 200
aaaaaaaaaa aaaaaatttt ctgtcagcgg agtgagaata ccgatat 47
<210> 201
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 201
aaaaaaaaaa aaaaaatagt agtatgcaat gcctgagtag gccggag 47
<210> 202
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 202
aaaaaaaaaa aaaaattaat gccttatttc aacgcaaggg caaagaa 47
<210> 203
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 203
aaaaaaaaaa aaaaagtaca acgagcaacg gctacagagg ataccga 47
<210> 204
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 204
aaaaaaaaaa aaaaaattcg gtctgcggga tcgtcacccg aaatccg 47
<210> 205
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 205
aaaaaaaaaa aaaaaaacca gacgtttagc tatattttct tctacta 47
<210> 206
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 206
aaaaaaaaaa aaaaattagc aaatagattt agtttgacca gtacctt 47
<210> 207
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 207
aaaaaaaaaa aaaaaagttg ggtcaaagcg ccattcgccc cgtaatg 47
<210> 208
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 208
aaaaaaaaaa aaaaacagtt tgacgcactc cagccagcta aacgacg 47
<210> 209
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 209
aaaaaaaaaa aaaaaaagga attacaaaga aaccaccagt cagatga 47
<210> 210
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 210
aaaaaaaaaa aaaaaaatgg aagcgaacgt tattaatttc taacaac 47
<210> 211
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 211
aaaaaaaaaa aaaaacgcgc gggcctgtgt gaaattgttg gcgatta 47
<210> 212
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 212
aaaaaaaaaa aaaaagccag tgcgatcccc gggtaccgag tttttct 47
<210> 213
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 213
aaaaaaaaaa aaaaaggaca ttcacctcaa atatcaaaca cagttga 47
<210> 214
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 214
aaaaaaaaaa aaaaataata gatcgctgag agccagcaga agcgtaa 47
<210> 215
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 215
cattcaacaa acgcaaagac accagaacac cctgaacaaa 40
<210> 216
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 216
ttgacggaaa tacatacata aagggcgcta atatcagaga 40
<210> 217
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 217
caccgtcacc ttattacgca gtattgagtt aagcccaata 40
<210> 218
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 218
gagccagcga atacccaaaa gaacatgaaa tagcaatagc 40
Claims (10)
1.一种DNA折纸-适配体纳米阵列传感器，其特征在于，所述纳米阵列传感器以三角形DNA折纸为模板，在所述三角形DNA折纸的部分单链上连接结合位点，所述结合位点与荧光标记的目标物的双链核酸适配体特异性结合。
2.根据权利要求1所述纳米阵列传感器，其特征在于，所述结合位点包括PolyA15。
3.根据权利要求1所述纳米阵列传感器，其特征在于，所述目标物包括ATP；
当所述目标物为ATP时，所述双链核酸适配体包括P1和P2，其中P1的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述纳米阵列传感器，其特征在于，所述结合位点和双链核酸适配体分别标记不同的荧光。
5.权利要求1～4任一项所述纳米阵列传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将M13基因链、订书钉链和捕获链以1：10：10的摩尔比混合，以0.1℃/10s的速率从95℃冷却到25℃进行自组装，得三角形DNA折纸；
在所述三角形DNA折纸的可寻址表面上对部分单链进行简单延伸，得所述纳米阵列传感器。
6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，得三角形DNA折纸后，还包括过滤除去过量的单链；
所述过滤包括利用100kDa MWCO除去过量的单链DNA。
7.权利要求1～4任一项所述纳米阵列传感器在定量检测目标物含量中的应用。
8.一种定量检测目标物的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1～4任一项所述纳米阵列传感器与等体积不同浓度的目标物混合孵育1h，利用100kD超滤管进行离心，记录滤液在510nm～700nm之间的光谱，制作标准曲线，利用标准曲线测算目标物的浓度。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，当所述目标物为ATP时，所述标准曲线为y＝372.28x+1130.8，R2＝0.9872，其中x为ATP浓度的对数，y为ATP为0ng/mL时的荧光值与不同浓度的ATP所对应的荧光值的差值。
10.根据权利要求8或9所述方法，其特征在于，所述光谱的激发波长为480nm，激发和发射的狭缝宽度均固定为10nm。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111491160.7A CN114354909A (zh) | 2021-12-08 | 2021-12-08 | 一种dna折纸-适配体纳米阵列传感器及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111491160.7A CN114354909A (zh) | 2021-12-08 | 2021-12-08 | 一种dna折纸-适配体纳米阵列传感器及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114354909A true CN114354909A (zh) | 2022-04-15 |
Family
ID=81097331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111491160.7A Pending CN114354909A (zh) | 2021-12-08 | 2021-12-08 | 一种dna折纸-适配体纳米阵列传感器及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114354909A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114875034A (zh) * | 2022-05-09 | 2022-08-09 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 一种同时检测赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮的三维dna纳米镊子及其制备方法和应用 |
| CN116139290A (zh) * | 2022-08-31 | 2023-05-23 | 苏州大学附属第二医院 | 一种dna纳米组合物及其制备方法和应用 |
-
2021
- 2021-12-08 CN CN202111491160.7A patent/CN114354909A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114875034A (zh) * | 2022-05-09 | 2022-08-09 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 一种同时检测赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮的三维dna纳米镊子及其制备方法和应用 |
| CN116139290A (zh) * | 2022-08-31 | 2023-05-23 | 苏州大学附属第二医院 | 一种dna纳米组合物及其制备方法和应用 |
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