CN114354551A - 应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法及试剂盒 - Google Patents

应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于胶质瘤技术，具体涉及一种应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法及试剂盒，克服因缺乏高特异性的抗体，使得现有方法无法准确检测LGR5在GSCs中的内源蛋白表达水平的难题。本发明巧妙的应用CRISPR/Cas9技术用较小的亚基GFP11标记LGR5蛋白，同时构建稳定表达较大亚基GFP1‑10蛋白的GSCs。当两个片段在同一细胞内，这两个部分能够稳定地相互作用，产生具有发光功能的GFP，从而可检测胶质瘤干细胞中的LGR5内源表达水平。其检测方法稳定性好，便于推广。

Description

应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质 瘤干细胞标志物LGR5的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于胶质瘤技术，具体涉及一种应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法及试剂盒。
背景技术
胶质母细胞瘤(Glioblastomamultiforme，GBM)是成人中枢神经系统最常见且恶性程度最高的脑肿瘤。由于恶性胶质母细胞瘤呈现高度侵袭生长，肿瘤与正常脑组织边界不清，致使外科手术很难做到完全切除。尽管以放疗及化疗为主的临床治疗技术有了提高和改善，但胶质母细胞瘤患者的复发仍不可避免，中位生存期仅为15个月，确诊后的五年生存率小于5％。因此，对于高度异质性的胶质母细胞瘤，发现有效的治疗靶点并开发出新的治疗方法具有十分重要的研究意义。
胶质瘤干细胞(Glioma Stem Cells,GSCs)是GBM组织中存在的一个细胞亚群，它占肿瘤细胞的比例较小，具有自我更新、多系分化潜能、促血管生成和促细胞迁移侵袭等作用，在诱发胶质瘤发生、发展及复发过程中起关键作用。GSCs对临床一线化疗药物替莫唑胺耐受，可通过调节DNA损伤修复，激活Notch、NF-κB、EZH2等信号通路抵抗放疗与化疗，被认为是胶质瘤治疗的趋势和焦点。
通过分析60个人源GSCs以及366个GBM患者组织样品的转录组发现，LGR5在IDH野生型的GSCs/GBMs中异常高表达。通过siRNA/shRNA介导的LGR5沉默可抑制GSCs的自我更新及迁移能力。研究表明LGR5是胶质瘤治疗的潜在靶点，明确参与调控GSCs自我更新的LGR5下游信号通路，并对其进行干扰阻断，从而达到治疗效果。然而由于缺乏高特异性的抗体，LGR5在GSCs中的内源蛋白表达水平仍不能准确检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法及其用途，融合最新的内源蛋白标记技术，即CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术，在胶质瘤干细胞中标记内源LGR5蛋白，克服因缺乏高特异性的抗体，使得现有方法无法准确检测LGR5在GSCs中的内源蛋白表达水平的难题。
本发明的技术方案是：
一种应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
步骤1、设计可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA；
步骤2、构建蛋白质核酸复合物；
将重组蛋白Cas9与可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA组装为蛋白质核酸复合物；
步骤3、构建含有GFP11序列的单链DNA序列；
在GFP11序列的左右两端分别添加一段碱基序列，该碱基序列与LGR5部分序列同源；
步骤4、构建稳定表达GFP1-10的胶质瘤干细胞GSCs；
步骤5、利用共转染技术将步骤2构建的蛋白质核酸复合物与步骤3构建的含有GFP11的单链DNA序列共同转入到步骤4构建的稳定表达GFP1-10的胶质瘤干细胞GSCs中，GFP1-10蛋白和GFP11蛋白整合成一个完整的，具有发光功能的绿色荧光蛋白，实现胶质瘤干细胞中内源LGR5蛋白标记。
进一步地，步骤1中可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA通过下述步骤获得：
步骤1.1、合成含有LGR5靶点的引物；
步骤1.2、通过sgRNA体外转录试剂盒(Inovogen)，采用T7 RNA聚合酶复合物在体外转录sgRNA。
进一步地，步骤1中可靶向LGR5基因的sgRNA序列为：
LGR5 C端(2000-2724bp)：TGAGAAAGCAAACCTACGTCTGG；
LGR5第一个环(500-1020bp)：ATGAATTCCCCACTGCAATTAGG；
LGR5两环之间(1081-1680bp)：GAAAGATGCTGGAATGTTTCAGG。
进一步地，步骤3中含有GFP11序列的单链DNA序列具体为：
左臂序列(LGR5 C端)：
TCCTGCATGTCTCAATCCCCTTCTCTACATCTTGTTCAATCCTCACTTTAAGGAGGATCTGGTGAGCCTGA；
右臂序列(LGR5 C端)：
AGCAAACCTACGTCTGGACAAGATCAAAACACCCAAGCTTGATGTCAATTAACTCTGATGATGTCGAAAA；
供体序列(LGR5 C端)：
TCCTGCATGTCTCAATCCCCTTCTCTACATCTTGTTCAATCCTCACTTTAAGGAGGATCTGGTGAGCCTGAATGCGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTATGTAAATGCTGCTGGGATTACAGGTGGCGGCAGCAAACCTACGTCTGGACAAGATCAAAACACCCAAGCTTGATGTCAATTAACTCTGATGATGTCGAAAA；
左臂序列(LGR5第一个环)：
CCCTGGGAAAGAAATGCTTTGATGGGCTCCACAGCCTAGAGACTTTAGATTTAAATTACAATAACCTTG；
右臂序列(LGR5第一个环)：
AATTCCCCACTGCAATTAGGACACTCTCCAACCTTAAAGAACTAGGATTTCATAGCAACAATATCAGGTC；
供体序列(LGR5第一个环)：
CCCTGGGAAAGAAATGCTTTGATGGGCTCCACAGCCTAGAGACTTTAGATTTAAATTACAATAACCTTGATGCGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTATGTAAATGCTGCTGGGATTACAGGTGGCGGCAATTCCCCACTGCAATTAGGACACTCTCCAACCTTAAAGAACTAGGATTTCATAGCAACAATATCAGGTC；
左臂序列(LGR5两环之间)：
TGCCTATAAGATTTCTAATCAATGGAATAAAGGTGACAACAGCAGTATGGACGACCTTCATAAGAAAG
右臂序列(LGR5两环之间)：
CTGGAATGTTTCAGGCTCAAGATGAACGTGACCTTGAAGATTTCCTGCTTGACTTTGAGGAAGACCTGAA；
供体序列(LGR5两环之间)：
TGCCTATAAGATTTCTAATCAATGGAATAAAGGTGACAACAGCAGTATGGACGACCTTCATAAGAAAGATGCGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTATGTAAATGCTGCTGGGATTACAGGTGGCGGCCTGGAATGTTTCAGGCTCAAGATGAACGTGACCTTGAAGATTTCCTGCTTGACTTTGAGGAAGACCTGAA。
进一步地，步骤4具体为：
将含有GFP1-10 cDNA的质粒转GSCs(U3082MG、U3117MG)，随后筛选稳定表达GFP1-10蛋白的GSCs。
进一步地，步骤5具体为：通过电穿孔法将蛋白质核酸复合物和含有GFP11的单链DNA序列共同转入到稳定表达GFP1-10蛋白的GSCs中。
本发明还提供一种用于标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的试剂盒，其特殊之处在于：包括蛋白质核酸复合物、含有GFP11序列的单链DNA序列及稳定表达GFP1-10的胶质瘤干细胞GSCs；其中蛋白质核酸复合物为上所述应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法中步骤2所述的蛋白质核酸复合物；含有GFP11序列的单链DNA序列为上述应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法中步骤3所述的含有GFP11序列的单链DNA序列；稳定表达GFP1-10的胶质瘤干细胞GSCs为上述应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法中步骤4所述的稳定表达GFP1-10的胶质瘤干细胞GSCs。
本发明的有益效果是：
本发明利用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术,在胶质瘤干细胞中标记内源LGR5蛋白，随后应用免疫荧光及
Figure BDA0003401802420000051
PLA临位连接技术分析LGR5与LPAR4在GSCs中的内源蛋白表达水平和胞内定位。本发明巧妙的应用CRISPR/Cas9技术用较小的亚基GFP11标记LGR5蛋白，同时构建稳定表达较大亚基GFP1-10蛋白的GSCs。当两个片段在同一细胞内，这两个部分能够稳定地相互作用，产生具有发光功能的GFP，从而可检测胶质瘤干细胞中的LGR5内源表达水平。其检测方法稳定性好，便于推广。
附图说明
图1为本发明应用CRISPR/Cas9技术和splitGFP双分子荧光互补技术相结合对内源LGR5进行标记的示意图。(A)为GFP11标记LGR5蛋白的简示图；(B)为标记方法流程图；(C)为GFP绿色荧光分布图，及通过流式细胞仪分选GFP阳性细胞。
图2为LGR5与LPAR4相关性分析。(A)Duolink
Figure BDA0003401802420000061
临位连接技术原理简示图，可在内源水平可视化研究蛋白的互作、定位和定量；(B)应用Duolink
Figure BDA0003401802420000062
临位连接技术在GSCs中检测LGR5与LPAR4的互作与共定位关系，图中每一个红点代表一个相互作用的复合物。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护的范围。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
本发明融合最新的内源蛋白标记技术，即CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术,在胶质瘤干细胞中标记内源LGR5蛋白，随后应用免疫荧光及
Figure BDA0003401802420000063
PLA临位连接技术分析LGR5与LPAR4在GSCs中的内源蛋白表达水平和胞内定位。从图1中A可以看出，在SplitGFP系统中，编码GFP的序列被分为两个片段并独立表达。其中一个大的亚基包含1-10条β链(GFP1-10)，另一个小的亚基只包含1条β链(GFP11)。仅当这两个部分相互结合时才能检测到绿色荧光，并且此结合无需任何其他蛋白-蛋白相互作用的辅助。本发明巧妙的应用CRISPR/Cas9技术，用较小的亚基GFP11标记LGR5蛋白，同时构建稳定表达较大亚基GFP1-10蛋白的GSCs。当两个片段在同一细胞内，这两个部分能够稳定地相互作用，产生具有发光功能的GFP，从而可检测胶质瘤干细胞中的LGR5内源表达水平。其检测方法稳定性好，便于推广。
结合图1中B图可以看出，本发明标记过程具体包括以下步骤：
首先，设计可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA序列，选择脱靶数量少，排序为前三名的sgRNA(图表1)。
本实施例设计方法可以采用麻省理工学院张峰实验室提供的网络工具GuideDesign Resources实现。首先，合成含有LGR5靶点的引物，之后通过sgRNA体外转录试剂盒(Inovogen)，采用T7 RNA聚合酶复合物可体外高效转录sgRNA。
具体为：应用PCR扩增转录模板，然后进行sgRNA转录。转录反应体系包括：5*转录试剂4ul，NTP混合物8ul，PCR产物2ul，T7转录酶2ul，无RNA酶水添加至20ul；转录条件为：37℃孵育4小时。最后用DNaseI去除DNA模板，用乙醇沉淀纯化所得sgRNA。纯化后的sgRNA可以采用紫外分光光度计定量，一般20ul体系可得到sgRNA100-200ug。
其次，将Cas9重组蛋白与可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA组装为蛋白质核酸复合物(ribonucleoprotein,RNP)。本实施例在进行电穿孔实验前，将100pmol Cas9蛋白和130pmolsgRNA充分混匀，形成蛋白质核酸复合物。
再次，构建含有GFP11序列的单链DNA序列；
GFP11序列约含60个碱基，为了能够准确标记内源LGR5蛋白，本实施例在它的左右两端分别添加一段约含70个碱基的序列，此序列应与LGR5部分序列同源，称为同源臂。设计好的GFP11单链DNA序列约含200个碱基，如图表2所示。
再次，构建稳定表达GFP1-10的胶质瘤干细胞GSCs；
本实施例将含有GFP1-10 cDNA的质粒转GSCs(U3082MG、U3117MG)，随后筛选稳定表达GFP1-10蛋白的GSCs，获得。具体通过下述过程实现：首先将细胞接种到六孔板中，在70％细胞汇合度时进行转染。在1.5ml无菌离心管A中加入125ul无血清培养基和7.5ul转染试剂Lipofectamine 2000，混匀后室温静置5min；同时在另一个1.5ml无菌离心管B中加入250ul无血清培养基和5ug质粒(pcDNA3.1-GFP1-10),混匀后室温静置5min。再将A管中混合物缓慢滴加至B管中，室温静置15-20分钟后，将混合物加到细胞上进行转染。转染48小时后用G418新霉素筛选稳定表达GFP1-10蛋白的GSCs。
最后，通过电穿孔法将蛋白质核酸复合物、含有GFP11的单链DNA序列共同转入到稳定表达GFP1-10蛋白的GSCs中。从而，GFP1-10蛋白和GFP11蛋白会整合成一个完整的，具有发光功能的绿色荧光蛋白，用来标记内源LGR5蛋白。
图表1.靶向LGR5基因的sgRNA序列设计
靶向部位 sgRNA序列
LGR5 C端(2000-2724bp) TGAGAAAGCAAACCTACGTCTGG
LGR5第一个环(500-1020bp) ATGAATTCCCCACTGCAATTAGG
LGR5两环之间(1081-1680bp) GAAAGATGCTGGAATGTTTCAGG
图表2.GFP11 ssDNA供体相关序列设计
Figure BDA0003401802420000091
Figure BDA0003401802420000101
从图1中C中可以看出，通过应用流式细胞分析技术，证明LGR5内源性标记效率非常高(>35％)。
实施例2
本实施例应用免疫荧光及
Figure BDA0003401802420000104
PLA临位连接技术，在GSCs及其诱导的脑胶质瘤冰冻切片上原位分析LGR5(带有GFP标记)与LPAR4的细胞内定位。Duolink
Figure BDA0003401802420000102
临位连接技技术的特异性高，灵敏度强。它使用了一对DNA邻位探针，每个探针都由与高亲和力寡核苷酸偶联的特异性抗体(Ab-Oligo)组成。图2A中展示的是应用Duolink
Figure BDA0003401802420000103
临位连接技技术检测蛋白互作的原理，未修饰的一抗需要用二抗Ab-Oligo偶联物进行识别。当这两个探针之间的距离非常靠近，通过加入分别与探针上的寡核苷酸序列互补的DNA片段，探针上的寡聚核苷酸就会通过互补配对作用与该段DNA互补，然后在连接酶的作用下，探针上的寡聚核苷酸就会被连接在一起。最后通过滚环复制扩增该DNA片段，从而可对蛋白互作进行定量分析。
本实施例还通过应用PLA技术原位检测LGR5(带GFP标记)与LPAR4这两种蛋白在胶质瘤干细胞系(U3082MG、U3117MG)中的互作关系。
将带GFP标记的胶质瘤干细胞系接种到含有细胞爬片的24孔板中，待细胞汇合度为90％时，用4％多聚甲醛室温固定20分钟。之后加入封闭液，室温固定45分钟后孵育一抗(Abcam,anti-GFPrabbit,Cat.No.ab290；Sigma,anti-LPAR4mouse,Cat.No.MABS1284)。在4℃孵育16小时一抗后，加入含有二抗的PLA探针(Sigma-Aldrich,anti-rabbit PLUS:Cat.No.DUO92002；anti-mouse MINUS:Cat.No.DUO92004)并室温孵育1小时。随后加入连接试剂((Sigma-Aldrich,Cat.No.82009，DUO82029)及扩增试剂(Sigma-Aldrich,Cat.No.DUO82010；DUO82030)，最后加入含有DAPI的封片剂进行封片。封片后需要避光，4℃保存。从图2B中可以看出，在胶质瘤干细胞膜上LGR5蛋白与LPAR4蛋白位置临近而发生互作。
<110>陕西师范大学
<120>一种应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法及试剂盒
<160>15
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
TGAGAAAGCAAACCTACGTCTGG 23
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ATGAATTCCCCACTGCAATTAGG 23
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
GAAAGATGCTGGAATGTTTCAGG 23
<210>4
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
GGTGGCGGC 9
<210>5
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
CGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTATGTAAATGCTGCTGGGATTAC47
<210>6
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
TCCTGCATGTCTCAATCCCCTTCTCTACATCTTGTTCAATCCTCACTTTAAGGAGGATCTGGTGAGCCTGA71
<210>7
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
AGCAAACCTACGTCTGGACAAGATCAAAACACCCAAGCTTGATGTCAATTAACTCTGATGATGTCGAAAA70
<210>8
<211>201
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
TCCTGCATGTCTCAATCCCCTTCTCTACATCTTGTTCAATCCTCACTTTAAGGAGGATCTGGTGAGCCTGAATGCGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTATGTAAATGCTGCTGGGATTACAGGTGGCGGCAGCAAACCTACGTCTGGACAAGATCAAAACACCCAAGCTTGATGTCAATTAACTCTGATGATGTCGAAAA201
<210>9
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
CCCTGGGAAAGAAATGCTTTGATGGGCTCCACAGCCTAGAGACTTTAGATTTAAATTACAATAACCTTG 69
<210>10
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
AATTCCCCACTGCAATTAGGACACTCTCCAACCTTAAAGAACTAGGATTTCATAGCAACAATATCAGGTC70
<210>11
<211>199
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
CCCTGGGAAAGAAATGCTTTGATGGGCTCCACAGCCTAGAGACTTTAGATTTAAATTACAATAACCTTGATGCGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTATGTAAATGCTGCTGGGATTACAGGTGGCGGCAATTCCCCACTGCAATTAGGACACTCTCCAACCTTAAAGAACTAGGATTTCATAGCAACAATATCAGGTC70
<210>12
<211>68
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
TGCCTATAAGATTTCTAATCAATGGAATAAAGGTGACAACAGCAGTATGGACGACCTTCATAAGAAAG68
<210>13
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
CTGGAATGTTTCAGGCTCAAGATGAACGTGACCTTGAAGAT41
<210>14
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
TTCCTGCTTGACTTTGAGGAAGACCTGAA29
<210>15
<211>198
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
TGCCTATAAGATTTCTAATCAATGGAATAAAGGTGACAACAGCAGTATGGACGACCTTCATAAGAAAGATGCGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTATGTAAATGCTGCTGGGATTACAGGTGGCGGCCTGGAATGTTTCAGGCTCAAGATGAACGTGACCTTGAAGATTTCCTGCTTGACTTTGAGGAAGACCTGAA198

Claims (7)

1.一种应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、设计可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA；
步骤2、构建蛋白质核酸复合物；
将重组蛋白Cas9与可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA组装为蛋白质核酸复合物；
步骤3、构建含有GFP11序列的单链DNA序列；
在GFP11序列的左右两端分别添加一段碱基序列，该段碱基序列与LGR5部分序列同源；
步骤4、构建稳定表达GFP1-10的胶质瘤干细胞GSCs；
步骤5、利用共转染技术将步骤2构建的蛋白质核酸复合物与步骤3构建的含有GFP11的单链DNA序列共同转入到步骤4构建的稳定表达GFP1-10的胶质瘤干细胞GSCs中，GFP1-10蛋白和GFP11蛋白整合成一个完整的，具有发光功能的绿色荧光蛋白，实现胶质瘤干细胞中内源LGR5蛋白标记。
2.根据权利要求1所述的应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法，其特征在于：
步骤1中可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA通过下述步骤获得：
步骤1.1、合成含有LGR5靶点的引物；
步骤1.2、通过sgRNA体外转录试剂盒(Inovogen)，采用T7 RNA聚合酶复合物在体外转录sgRNA。
3.根据权利要求2所述的应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法，其特征在于，步骤1中可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA序列为：
LGR5 C端(2000-2724bp)：TGAGAAAGCAAACCTACGTCTGG；
LGR5第一个环(500-1020bp)：ATGAATTCCCCACTGCAATTAGG；
LGR5两环之间(1081-1680bp)：GAAAGATGCTGGAATGTTTCAGG。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法，其特征在于，步骤3中含有GFP11序列的单链DNA序列具体为：
左臂序列(LGR5 C端)：
TCCTGCATGTCTCAATCCCCTTCTCTACATCTTGTTCAATCCTCACTTTAAGGAGGATCTGGTGAGCCTGA；
右臂序列(LGR5 C端)：
AGCAAACCTACGTCTGGACAAGATCAAAACACCCAAGCTTGATGTCAATTAACTCTGATGATGTCGAAAA；
供体序列(LGR5 C端)：
TCCTGCATGTCTCAATCCCCTTCTCTACATCTTGTTCAATCCTCACTTTAAGGAGGATCTGGTGAGCCTGAATGCGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTATGTAAATGCTGCTGGGATTACAGGTGGCGGCAGCAAACCTACGTCTGGACAAGATCAAAACACCCAAGCTTGATGTCAATTAACTCTGATGATGTCGAAAA；
左臂序列(LGR5第一个环)：
CCCTGGGAAAGAAATGCTTTGATGGGCTCCACAGCCTAGAGACTTTAGATTTAAATTACAATAACCTTG；
右臂序列(LGR5第一个环)：
AATTCCCCACTGCAATTAGGACACTCTCCAACCTTAAAGAACTAGGATTTCATAGCAACAATATCAGGTC；
供体序列(LGR5第一个环)：
CCCTGGGAAAGAAATGCTTTGATGGGCTCCACAGCCTAGAGACTTTAGATTTAAATTACAATAACCTTGATGCGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTATGTAAATGCTGCTGGGATTACAGGTGGCGGCAATTCCCCACTGCAATTAGGACACTCTCCAACCTTAAAGAACTAGGATTTCATAGCAACAATATCAGGTC；
左臂序列(LGR5两环之间)：
TGCCTATAAGATTTCTAATCAATGGAATAAAGGTGACAACAGCAGTATGGACGACCTTCATAAGAAAG
右臂序列(LGR5两环之间)：
CTGGAATGTTTCAGGCTCAAGATGAACGTGACCTTGAAGATTTCCTGCTTGACTTTGAGGAAGACCTGAA；
供体序列(LGR5两环之间)：
TGCCTATAAGATTTCTAATCAATGGAATAAAGGTGACAACAGCAGTATGGACGACCTTCATAAGAAAGATGCGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTATGTAAATGCTGCTGGGATTACAGGTGGCGGCCTGGAATGTTTCAGGCTCAAGATGAACGTGACCTTGAAGATTTCCTGCTTGACTTTGAGGAAGACCTGAA。
5.根据权利要求4所述的应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法，其特征在于，步骤4具体为：
将含有GFP1-10 cDNA的质粒转GSCs(U3082MG、U3117MG)，之后筛选稳定表达GFP1-10蛋白的GSCs。
6.根据权利要求5所述的应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法，其特征在于，步骤5具体为：通过电穿孔法将蛋白质核酸复合物和含有GFP11的单链DNA序列共同转入到稳定表达GFP1-10蛋白的GSCs中。
7.一种用于标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的试剂盒，其特征在于：包括蛋白质核酸复合物、含有GFP11序列的单链DNA序列及稳定表达GFP1-10的胶质瘤干细胞GSCs；其中蛋白质核酸复合物为权利要求1-6任一所述应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法中步骤2所述的蛋白质核酸复合物；含有GFP11序列的单链DNA序列为权利要求1-6任一所述应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法中步骤3所述的含有GFP11序列的单链DNA序列；稳定表达GFP1-10的胶质瘤干细胞GSCs为权利要求1-6任一所述应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法中步骤4所述的稳定表达GFP1-10的胶质瘤干细胞GSCs。
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赵晓蓉;曹利民;彭吉林;王敏;赵晓平;吴砂;李文涵;叶庆;沈关心;: "稳定表达EGFR-GFP融合蛋白细胞系的建立", 郧阳医学院学报, no. 03 *

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