CN114350628A

CN114350628A - 多酚氧化酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN114350628A
Application number: CN202210022095.1A
Authority: CN
Inventors: 虞沂; 曹应龙; 刘亚婷
Original assignee: Hubei Carbon Yuan Materia Medica Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hubei Carbon Yuan Materia Medica Biotechnology Co ltd; Wuhan University WHU
Priority date: 2022-01-10
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2042-01-10
Also published as: CN114350628B

Abstract

本发明提供一种多酚氧化酶及其编码基因和应用。多酚氧化酶可作为合成元件应用在毛蕊花苷、羟基红景天苷或者以这两个化合物为骨架的苯乙醇苷类化合物的体外酶法催化或者体内重构合成，也为深入解析复杂苯乙醇苷类化合物完整的生物合成途径奠定了基础。

Description

多酚氧化酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及毛蕊花苷和羟基红景天苷合成技术领域，尤其涉及一种催化合成毛蕊花苷或羟基红景天苷的多酚氧化酶及其编码基因和应用。

背景技术

羟基红景天苷分子式为C₁₄H₂₀O₈，分子量为316.1，CAS号为76873-99-9，研究报道其具有良好的神经保护作用(Ying-Guo Liu et al.，2015)。毛蕊花苷分子式为C₂₉H₃₆O₁₅，分子量为624.6，CAS号为61276-17-3，分布在自然界列当科、唇形科和木犀科等多种植物中，具有抗氧化、抗炎、抗菌、神经保护、调节细胞凋亡等多种生理活性(Lipeng Wuet al.，2020)。

现有毛蕊花苷和羟基红景天苷的化学合成方法工艺流程复杂，亟待开发高效的体外合成方法。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够催化合成毛蕊花苷和羟基红景天苷的多酚氧化酶及其编码基因和应用。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种多酚氧化酶，其序列如a)和b)所示：

a)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残且具有催化生成羟基的酶活性的衍生蛋白质。

本发明提供一种上述所述的多酚氧化酶的编码基因，基因序列如下c)或者d)所示：c)如SEQ ID NO.2所示的DNA分子；d)在严格条件下与c)限定的DNA序列杂交且编码具有催化生成羟基的酶活性的DNA分子。

本发明提供一种包含上述所述的多酚氧化酶的编码基因的表达盒、重组载体或者重组菌。

本发明提供一种重组大肠杆菌，包含催化生成羟基的多酚氧化酶的编码基因。

本发明提供所述的多酚氧化酶在体外催化肉苁蓉新化合物生成毛蕊花苷或者体外催化红景天苷生成羟基红景天苷的工艺中的应用。

本发明提供一种毛蕊花苷和羟基红景天苷的体外合成方法，包括如下步骤：向缓冲液中分别加入底物和多酚氧化酶，所述底物为肉苁蓉新化合物或红景天苷，得混合液；将所述混合液置于25～35℃下反应，在加入冰甲醇淬灭反应。

在其中一些实施例中，所述缓冲液为pH 7～7.5的Tris-HCl缓冲液。

在其中一些实施例中，所述混合液中还含有抗坏血酸、硫酸铜和/或SDS。

在其中一些实施例中，所述混合液中，所述底物和所述多酚氧化酶的浓度比1mM：5μM。

本发明的有益效果是：

与现有技术相比，本发明首次提供一种体外促进生成羟基的多酚氧化酶及其编码基因和应用。该多酚氧化酶可作为合成元件应用在毛蕊花苷、羟基红景天苷或者以这两个化合物为骨架的苯乙醇苷类化合物的体外酶法催化或者体内重构合成，反应更高效。

附图说明

图1为OfPPO2蛋白表达纯化检测胶图。

图2为多酚氧化酶OfPPO2催化红景天苷生成羟基红景天苷的HPLC谱图和LC-MS/MS产物谱图。

图3为多酚氧化酶OfPPO2催化肉苁蓉新化合物生成毛蕊花苷的HPLC谱图。

图4为多酚氧化酶OfPPO2催化肉苁蓉新化合物生成毛蕊花苷的LC-MS/MS产物谱图。

图5为采用多酚氧化酶OfPPO2合成毛蕊花苷和羟基红景天苷的反应式。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

关键材料来源说明：

质粒pET-28a(+)，购买自Novagen。质粒提取和胶回收试剂盒购自OMEGA公司。

大肠杆菌TOP10和BL21(DE3)感受态，购自北京擎科生物。

限制性内切酶采购自New England Biolabs公司。

常用培养基所用试剂购自Oxford,Amresco和国药集团化学试剂有限公司。

所用抗生素均购自Sigma-Aldrich公司。

LB培养基的配方如下:Tryptone:10g/L，Yeast extract:5g/L，NaCl:10g/L。

化学法制备大肠杆菌感受态所用溶液：

TFB I(100mL)溶液：KAC(5M)0.6mL，CaCl₂(1M)1mL，KCl(1M)10mL，MnCl₂(1M)5mL，甘油(100％)15mL，灭菌水68.4mL。

TFB II(100mL)溶液：MOPS(1M)1mL，CaCl₂(1M)7.5mL，KCl(1M)1mL，甘油(100％)15mL，灭菌水75.5mL。

本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得。

实施例1催化生成羟基的多酚氧化酶及编码基因

发明人团队通过大量研究发现：桂花中多酚氧化酶OfPPO2能够催化肉苁蓉新化合物(Osmanthuside B)生成毛蕊花苷(Acteoside)，或催化底物红景天苷(Salidroside)反应生成羟基红景天苷(Hydroxysalidroside)。

其中，多酚氧化酶OfPPO2的氨基酸序列如下：

MASIVPFLSTPVSATATPRSTSCYSPFKTTLSPSTRKISHKISCKTIDGDQESSTGKFDRRNLLIGLGGLYGASSLGANPFAFAAPVSSPDVTQCGPADLPQGASPTNCCPPPTGEILDFKFPPPPTTMRVRPAAHLADEAYIAKLNRAVELMRALPDDDPRSFRQQANVHCAYCDGAYDQVGFPNLELQIHNSWLFFPFHRYYVYFFERILGKLIDDPTFALPFWNYDAPDGMHLPAMYANPNSSLYDPLRDSAHQPPALIDLNYSGSDANTGEAQQTSRNLTIMYRQMVSNSKTPRLFFGSPYRQGDNPNPGAGSIENIPHAPVHVWTGDRTQPNFENMGNFYSAGRDPIFFAHHSNIDRMWTLWKTLGGRRQDITDPDFLDTSFVFYDENAKMVRVKVRDSLDHTKFGYVYQDVEVPWLKSRPKPRVSSVVRKLKKLVHANAADTPTPKDIFPAKLDQVIKVMVTRPKIKRSKKEKDELEEILIIQGIELERDLYAKFDVFINDEDDEESTPDNTEFAGSFVNVPHKHKHGKKIKTNLRLSITDILEDLDAEDDQHVLVTLIPKNSGDAITVHGIKIELDD(SEQ ID NO.1)。

多酚氧化酶OfPPO2编码基因的核苷酸序列如下：

ATGGCTTCAATAGTACCCTTTCTAAGTACACCGGTTAGCGCTACTGCCACCCCGCGTAGCACCTCCTGCTATTCCCCGTTTAAAACTACACTGAGCCCGTCCACCCGTAAGATCAGCCATAAGATCAGCTGCAAAACGATTGATGGCGACCAAGAGTCTTCTACCGGTAAATTCGACAGACGCAACCTGCTGATCGGCCTGGGCGGTCTGTACGGCGCCAGCAGTCTCGGTGCGAACCCGTTCGCGTTTGCGGCTCCGGTCTCTAGCCCGGATGTGACCCAATGTGGTCCGGCTGACCTGCCGCAGGGCGCGTCCCCAACGAACTGCTGCCCGCCACCGACTGGCGAGATTCTGGATTTTAAATTCCCGCCGCCGCCTACCACCATGCGCGTACGTCCGGCGGCTCATCTGGCAGACGAGGCATACATCGCAAAACTGAACCGCGCAGTTGAACTTATGCGTGCGCTGCCGGACGACGATCCGCGTTCGTTCCGTCAGCAGGCAAATGTTCATTGTGCGTACTGCGATGGTGCCTACGATCAGGTTGGTTTTCCGAATTTAGAGCTCCAGATCCATAATTCATGGCTGTTCTTCCCGTTTCATCGTTACTATGTGTATTTCTTCGAACGCATTTTGGGCAAATTGATTGACGACCCAACGTTTGCGCTGCCATTTTGGAATTACGATGCTCCGGACGGCATGCATCTGCCGGCTATGTATGCAAACCCGAATAGTTCTCTGTACGACCCGCTGCGCGATAGCGCGCACCAGCCGCCTGCGCTGATCGATCTGAATTATAGCGGTTCCGATGCGAACACGGGTGAAGCACAGCAAACCTCTCGTAACTTGACCATTATGTACCGCCAAATGGTTTCCAATAGCAAGACCCCGCGCCTGTTTTTCGGTTCCCCGTATAGACAAGGCGACAATCCCAACCCGGGTGCGGGCTCGATCGAAAACATCCCGCACGCACCGGTTCACGTTTGGACCGGTGACCGTACCCAACCGAATTTTGAGAACATGGGTAATTTCTACAGCGCGGGCCGTGACCCAATTTTTTTTGCCCACCACAGCAACATCGACCGTATGTGGACGTTATGGAAAACCCTGGGTGGTAGGCGTCAGGATATCACCGATCCGGACTTCCTGGACACCAGCTTTGTGTTTTACGATGAAAACGCGAAGATGGTGCGCGTGAAAGTTCGTGACAGCCTGGACCACACCAAATTCGGCTATGTTTATCAGGATGTTGAGGTTCCGTGGCTGAAAAGCCGCCCAAAACCGCGCGTGAGCAGTGTCGTGCGTAAACTTAAGAAGTTGGTCCATGCCAACGCTGCCGATACCCCGACCCCGAAAGATATTTTCCCGGCGAAGCTGGATCAAGTCATTAAGGTGATGGTGACCCGTCCGAAAATCAAACGTAGCAAGAAGGAGAAAGACGAGTTAGAGGAAATCCTGATTATCCAGGGTATCGAGTTGGAACGTGATCTTTATGCCAAGTTCGACGTTTTCATTAACGATGAGGATGATGAAGAAAGCACCCCGGACAACACGGAATTTGCGGGTTCGTTCGTGAACGTGCCGCACAAGCACAAACACGGTAAAAAGATCAAGACCAACTTGCGTTTATCCATTACGGATATCTTGGAGGACCTGGACGCGGAAGACGATCAACATGTGCTGGTTACTCTGATTCCGAAGAACAGCGGTGACGCGATCACCGTCCACGGCATTAAGATCGAATTGGACGACTAA(SEQ ID NO.2)。

实施例2大肠杆菌表达载体的构建方法

本实施例提供一种大肠杆菌表达载体的构建方法，包括如下步骤：

S1，针对上述多酚氧化酶OfPPO2基因序列合成基因，并设计了大肠杆菌表达载体构建所需的扩增引物。引物序列如下表所示：

S2，以合成的基因所在质粒分别为模板，用引物按照下列PCR反应体系和反应程序扩增目的片段：

PCR反应体系

组分	用量(μL)
		10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo	5
2mMdNTPs	5
		25mM MgSO<sub>4</sub>	3
引物(F端)	1.5
		引物(R端)	1.5
模板	1
		distilled water	29
KOD-Plus-Neo	1
		Totol	50

PCR反应程序：94℃预变性2min，95℃变性10s，62℃退火30s，62℃延伸1min，扩增循环30次，68℃最后延伸10min。

PCR反应结束后，取2μL反应产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小是否正确。检测正确后，进行琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。

S3，用限制性内切酶EcoRI和SacI对pS1300T-Flag载体进行线性化，并通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切线性化载体。

S4，In-fusion克隆重组和转化筛鉴定阳性克隆：遵照In-fusion的说明书在引物的末端加上15～20nt载体的同源序列，所扩增出来的DNA片段经纯化后与线性化处理的载体按摩尔比3:1的比例混合后加入5×的反应混合酶液，50℃反应30～50min。所得到的产物即可用于转化大肠杆菌TOP10感受态。

将要转化的DNA与感受态细胞混匀(DNA：感受态细胞<1/10)，冰浴25min；37℃热击2min(或者42℃，热击90s)，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却3～5min；加入600μL LB培养基，37℃预培养45～60min；将适当体积(200μL)在含相应抗生素的LA固体平板上均匀涂布；倒置平皿，37℃培养箱培养12～16h左右可出现菌落。

取培养平板上的单菌落接种至卡那霉素抗性的LB培养基中过夜培养后，提取质粒进行酶切鉴定，如图1所示，验证正确的进一步送测序公司进行测序。

实施例3蛋白表达及纯化

挑取含有蛋白表达重组载体的大肠杆菌BL21(DE3)单菌落于5mL LB(含卡那霉素)，37℃、200rpm培养12h；将其转接到0.5L LB培养基中，37℃、200rpm培养至OD600值到0.6；加0.1～0.5mL的1M IPTG(终浓度为0.5mM)在18℃诱导表达18～20h，于5000rpm、10min收集菌体，用结合Buffer洗两遍后将菌体置于-80℃保存或者直接破碎用于纯化蛋白。

将收集好的菌体用Binding buffer(50mM Tris-HCl，pH 7.4，200mM NaCl，1mMEDTA，25mM咪唑)重新溶解，高压匀浆机破碎法破碎细胞，15000rpm高速低温离心60min，取上清转至50mL离心管中，取洗脱管加1mL镍珠(Ni-resion)，先用10mL MiliQ洗脱镍珠，再用5mL Binding buffer洗脱，然后加入离心后的上清，采用自然流速洗脱让带有His亲和标签的蛋白结合在Ni柱，重复洗脱两次后，用含有50～300mM浓度咪唑的Washing buffer(20mMTris-HCl，pH 7.4，200mM NaCl)洗脱，每个浓度的咪唑洗脱液用量2倍柱体积，收集流出液。

洗脱后跑SDS-PAGE胶检测每个收集管中是否有目标蛋白，将含有目标蛋白的溶液进行用stroge buffer(20mM Tris-HCl,pH 7.4,100mM NaCl and5％甘油)透析，然后进行浓缩将浓缩后的蛋白液测定浓度后以20～50μL分装并于-80℃冻存。

从SDS-PAGE检测结果图1可以看出，纯化得到的OfPPO2蛋白纯度较高。

实施例4体外酶促反应

OfPPO2的反应体系(100μL)：50mM Tris-HCl(pH 7.4)，2mM SDS，2μM CuSO₄，1mM底物(肉苁蓉新化合物或红景天苷)，2mM抗坏血酸和5μM实施例3纯化的酶OfPPO2。

上述酶促反应在30℃水浴锅进行，反应1h后加入100μL冰甲醇淬灭反应。

淬灭后的反应产物在13000rpm转速下离心30min，取上清用0.22μL滤膜过滤后装在带有内衬管的样品瓶中进行后续的HPLC或LC-MS检测。

检测条件：色谱柱是反相C18柱(150×4.6mm,Agilent)，流动相A是水(0.1％甲酸)，流动相B是乙腈(0.1％甲酸)，流速0.8mL/min，进样10μL，检测波长设置是280nm。

以红景天苷为底物的洗脱条件是：

0-5min:B 5％-10％；

5-15min:B 10-20％；

15-17min:B 20-80％；

17-25min:B 5％。

从HPLC检测结果可以看出，以红景天苷为底物的OfPPO2反应体系产生了一个与底物不同保留时间的新的产物峰(图2)。

以肉苁蓉新化合物为底物的洗脱条件是：

0-5min:B 5％-25％；

5-15min:B 25-80％；

15-17min:B 80-80％；

17-25min:B 5％

从HPLC检测结果可以看出，以肉苁蓉新化合物为底物的OfPPO2反应体系产生了两个与底物不同保留时间的新的产物峰(图3)，其中一个峰与毛蕊花苷标准品的保留时间相同。

结构鉴定：用LC-HR-MS对HPLC检测后显示的反应产物进行分析，LC-HR-MS平台为Thermo Scientific LTQ XL Orbitrap，ESI离子源，使用色谱柱及流动相条件同HPLC检测条件。

使用MS检测条件为Heated ESI Temperature 40℃,Sneath Gas FlowRate30arb,Aux Gas Flow Rate5 arb,I Spray Valtage 3.5kV,CapillaryTemperature270℃,Capillary Valtage 35V,Tube Lens 110V。

从LC-HR-MS检测结果可以看出，以红景天苷为底物的OfPPO2反应体系的反应产物产生了特征离子317.12292(理论分子离子：317.12309)，且该分子离子的二级质谱碎片与羟基红景天苷的一致(图2)。

从LC-HR-MS检测结果可以看出，以肉苁蓉新化合物为底物的OfPPO2反应体系的其中一个反应产物产生了特征离子609.21753(理论分子离子：609.21778)，该产物应该是完成一步羟化的中间体Kankanoside G或Ligupurpuroside C。另一个与毛蕊花苷标准品的保留时间相同的产物峰产生了特征离子625.21246(理论分子离子：625.21270)，且其二级质谱碎片与毛蕊花苷的一致(图4)。

因此，如图5所示，采用多酚氧化酶OfPPO2能够合成毛蕊花苷和羟基红景天苷，实现了高效体外合成转化。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北碳元本草生物科技有限公司

<120> 多酚氧化酶及其编码基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 584

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Ser Ile Val Pro Phe Leu Ser Thr Pro Val Ser Ala Thr Ala

1 5 10 15

Thr Pro Arg Ser Thr Ser Cys Tyr Ser Pro Phe Lys Thr Thr Leu Ser

20 25 30

Pro Ser Thr Arg Lys Ile Ser His Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ile Asp

35 40 45

Gly Asp Gln Glu Ser Ser Thr Gly Lys Phe Asp Arg Arg Asn Leu Leu

50 55 60

Ile Gly Leu Gly Gly Leu Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asn Pro

65 70 75 80

Phe Ala Phe Ala Ala Pro Val Ser Ser Pro Asp Val Thr Gln Cys Gly

85 90 95

Pro Ala Asp Leu Pro Gln Gly Ala Ser Pro Thr Asn Cys Cys Pro Pro

100 105 110

Pro Thr Gly Glu Ile Leu Asp Phe Lys Phe Pro Pro Pro Pro Thr Thr

115 120 125

Met Arg Val Arg Pro Ala Ala His Leu Ala Asp Glu Ala Tyr Ile Ala

130 135 140

Lys Leu Asn Arg Ala Val Glu Leu Met Arg Ala Leu Pro Asp Asp Asp

145 150 155 160

Pro Arg Ser Phe Arg Gln Gln Ala Asn Val His Cys Ala Tyr Cys Asp

165 170 175

Gly Ala Tyr Asp Gln Val Gly Phe Pro Asn Leu Glu Leu Gln Ile His

180 185 190

Asn Ser Trp Leu Phe Phe Pro Phe His Arg Tyr Tyr Val Tyr Phe Phe

195 200 205

Glu Arg Ile Leu Gly Lys Leu Ile Asp Asp Pro Thr Phe Ala Leu Pro

210 215 220

Phe Trp Asn Tyr Asp Ala Pro Asp Gly Met His Leu Pro Ala Met Tyr

225 230 235 240

Ala Asn Pro Asn Ser Ser Leu Tyr Asp Pro Leu Arg Asp Ser Ala His

245 250 255

Gln Pro Pro Ala Leu Ile Asp Leu Asn Tyr Ser Gly Ser Asp Ala Asn

260 265 270

Thr Gly Glu Ala Gln Gln Thr Ser Arg Asn Leu Thr Ile Met Tyr Arg

275 280 285

Gln Met Val Ser Asn Ser Lys Thr Pro Arg Leu Phe Phe Gly Ser Pro

290 295 300

Tyr Arg Gln Gly Asp Asn Pro Asn Pro Gly Ala Gly Ser Ile Glu Asn

305 310 315 320

Ile Pro His Ala Pro Val His Val Trp Thr Gly Asp Arg Thr Gln Pro

325 330 335

Asn Phe Glu Asn Met Gly Asn Phe Tyr Ser Ala Gly Arg Asp Pro Ile

340 345 350

Phe Phe Ala His His Ser Asn Ile Asp Arg Met Trp Thr Leu Trp Lys

355 360 365

Thr Leu Gly Gly Arg Arg Gln Asp Ile Thr Asp Pro Asp Phe Leu Asp

370 375 380

Thr Ser Phe Val Phe Tyr Asp Glu Asn Ala Lys Met Val Arg Val Lys

385 390 395 400

Val Arg Asp Ser Leu Asp His Thr Lys Phe Gly Tyr Val Tyr Gln Asp

405 410 415

Val Glu Val Pro Trp Leu Lys Ser Arg Pro Lys Pro Arg Val Ser Ser

420 425 430

Val Val Arg Lys Leu Lys Lys Leu Val His Ala Asn Ala Ala Asp Thr

435 440 445

Pro Thr Pro Lys Asp Ile Phe Pro Ala Lys Leu Asp Gln Val Ile Lys

450 455 460

Val Met Val Thr Arg Pro Lys Ile Lys Arg Ser Lys Lys Glu Lys Asp

465 470 475 480

Glu Leu Glu Glu Ile Leu Ile Ile Gln Gly Ile Glu Leu Glu Arg Asp

485 490 495

Leu Tyr Ala Lys Phe Asp Val Phe Ile Asn Asp Glu Asp Asp Glu Glu

500 505 510

Ser Thr Pro Asp Asn Thr Glu Phe Ala Gly Ser Phe Val Asn Val Pro

515 520 525

His Lys His Lys His Gly Lys Lys Ile Lys Thr Asn Leu Arg Leu Ser

530 535 540

Ile Thr Asp Ile Leu Glu Asp Leu Asp Ala Glu Asp Asp Gln His Val

545 550 555 560

Leu Val Thr Leu Ile Pro Lys Asn Ser Gly Asp Ala Ile Thr Val His

565 570 575

Gly Ile Lys Ile Glu Leu Asp Asp

580

<210> 2

<211> 1755

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcttcaa tagtaccctt tctaagtaca ccggttagcg ctactgccac cccgcgtagc 60

acctcctgct attccccgtt taaaactaca ctgagcccgt ccacccgtaa gatcagccat 120

aagatcagct gcaaaacgat tgatggcgac caagagtctt ctaccggtaa attcgacaga 180

cgcaacctgc tgatcggcct gggcggtctg tacggcgcca gcagtctcgg tgcgaacccg 240

ttcgcgtttg cggctccggt ctctagcccg gatgtgaccc aatgtggtcc ggctgacctg 300

ccgcagggcg cgtccccaac gaactgctgc ccgccaccga ctggcgagat tctggatttt 360

aaattcccgc cgccgcctac caccatgcgc gtacgtccgg cggctcatct ggcagacgag 420

gcatacatcg caaaactgaa ccgcgcagtt gaacttatgc gtgcgctgcc ggacgacgat 480

ccgcgttcgt tccgtcagca ggcaaatgtt cattgtgcgt actgcgatgg tgcctacgat 540

caggttggtt ttccgaattt agagctccag atccataatt catggctgtt cttcccgttt 600

catcgttact atgtgtattt cttcgaacgc attttgggca aattgattga cgacccaacg 660

tttgcgctgc cattttggaa ttacgatgct ccggacggca tgcatctgcc ggctatgtat 720

gcaaacccga atagttctct gtacgacccg ctgcgcgata gcgcgcacca gccgcctgcg 780

ctgatcgatc tgaattatag cggttccgat gcgaacacgg gtgaagcaca gcaaacctct 840

cgtaacttga ccattatgta ccgccaaatg gtttccaata gcaagacccc gcgcctgttt 900

ttcggttccc cgtatagaca aggcgacaat cccaacccgg gtgcgggctc gatcgaaaac 960

atcccgcacg caccggttca cgtttggacc ggtgaccgta cccaaccgaa ttttgagaac 1020

atgggtaatt tctacagcgc gggccgtgac ccaatttttt ttgcccacca cagcaacatc 1080

gaccgtatgt ggacgttatg gaaaaccctg ggtggtaggc gtcaggatat caccgatccg 1140

gacttcctgg acaccagctt tgtgttttac gatgaaaacg cgaagatggt gcgcgtgaaa 1200

gttcgtgaca gcctggacca caccaaattc ggctatgttt atcaggatgt tgaggttccg 1260

tggctgaaaa gccgcccaaa accgcgcgtg agcagtgtcg tgcgtaaact taagaagttg 1320

gtccatgcca acgctgccga taccccgacc ccgaaagata ttttcccggc gaagctggat 1380

caagtcatta aggtgatggt gacccgtccg aaaatcaaac gtagcaagaa ggagaaagac 1440

gagttagagg aaatcctgat tatccagggt atcgagttgg aacgtgatct ttatgccaag 1500

ttcgacgttt tcattaacga tgaggatgat gaagaaagca ccccggacaa cacggaattt 1560

gcgggttcgt tcgtgaacgt gccgcacaag cacaaacacg gtaaaaagat caagaccaac 1620

ttgcgtttat ccattacgga tatcttggag gacctggacg cggaagacga tcaacatgtg 1680

ctggttactc tgattccgaa gaacagcggt gacgcgatca ccgtccacgg cattaagatc 1740

gaattggacg actaa 1755

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctttaagaag gagatatacc atggcttcaa tagtaccctt 40

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggtgctcga gtgcggccgc ttagtcgtcc aattcgatc 39

Claims

1.一种多酚氧化酶，其序列如a)和b)所示：

a)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.一种权利要求1或2所述的多酚氧化酶的编码基因，其特征在于，基因序列如下c)或者d)所示：

c)如SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

d)在严格条件下与c)限定的DNA序列杂交且编码具有催化生成羟基的酶活性的DNA分子。

3.一种包含权利要求2所述的多酚氧化酶的编码基因的表达盒、重组载体或者重组菌。

4.一种重组大肠杆菌，其特征在于，包含权利要求2所述的多酚氧化酶的编码基因。

5.权利要求1所述的多酚氧化酶在体外催化红景天苷生成羟基红景天苷或者体外催化肉苁蓉新化合物生成毛蕊花苷的工艺中的应用。

6.一种毛蕊花苷或羟基红景天苷的体外合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

向缓冲液中分别加入底物和权利要求1所述的多酚氧化酶，所述底物为肉苁蓉新化合物或红景天苷，得混合液；

将所述混合液置于25～35℃下反应，在加入冰甲醇淬灭反应。

7.根据权利要求6所述的体外合成方法，其特征在于，所述缓冲液为pH 7～7.5的Tris-HCl缓冲液。

8.根据权利要求6所述的体外合成方法，其特征在于，所述混合液中还含有抗坏血酸、硫酸铜和/或SDS。

9.根据权利要求6～8任一项所述的体外合成方法，其特征在于，所述混合液中，所述底物和所述多酚氧化酶的浓度比1mM：5μM。