CN114349723A - 多烯炔类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多烯炔类化合物及其制备方法和应用。该多烯炔类化合物具有如式(Ⅰ)～(Ⅴ)任一所示的结构：
该多烯炔类化合物在10μM下对于RANKL诱导的破骨细胞具有明显的抑制分化效果，且不显示细胞毒性。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及多烯炔类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
骨质疏松(Osteoporosis，OP)为一种常见的全身性骨代谢疾病，主要表现为骨密度与骨量下降，再导致继发性骨折，其病因与骨重建中破骨细胞与成骨细胞间的作用不平衡相关。目前很多骨质疏松治疗药物尚在临床试验和安全评估甚至基础研究阶段，上市药物大多靶点单一、治疗范围较窄、治疗周期较长且存在不良反应，比如，长期使用激素替代疗法会增加患者患乳腺癌、冠心病等疾病的几率，长期服用双膦酸盐的患者发生非典型性骨折的危险性增加，长期应用RANKL抗体地诺单抗后停药会导致骨转换的反弹激活并加速骨丢失。
随着年龄增长，大量钙质流失，骨质疏松在中老年人群中发病率高，尤其是绝经后女性。随着社会老龄化加剧，骨质疏松症已经成为威胁我国国民健康的重大疾病之一，临床上对高效低副作用的新型骨质疏松防治药物的需求日益迫切。
据2020版药典记载，中药苍术的植物来源为茅苍术和北苍术两种(中国药典编委会.中国药典[M].2020,1:107)，植物入药部位均为根茎。中药苍术为运脾药，味辛、苦，性温，归脾、胃、肝经。中医认为其有燥湿健脾，散寒祛风，明目的功效，临床主要用于治疗中焦湿困、腹胀泄泻、风湿痹痛等。茅苍术和北苍术临床用法相近，但化学成分有所差异。
名称为一种治疗骨质疏松症的药物的发明专利公开了以苍术等多种中药草为原料制成的药物具有较好的治疗骨质疏松的效果，但其未进一步研究苍术中起治疗骨质疏松的有效成分具体为哪种化合物。
因此，研发一种高效低副作用的用于预防和/或治疗骨质疏松的化合物尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中预防和/或治疗骨质疏松药物的治疗效果差且副作用大的不足，提供多烯炔类化合物。该多烯炔类化合物在10μM下对于RANKL诱导的破骨细胞具有明显的抑制分化效果，且不显示细胞毒性。
本发明的另一目的在于提供上述多烯炔类化合物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述多烯炔类化合物的在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种预防和/或治疗骨质疏松的药物。
为实现以上发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种多烯炔类化合物，具有如式(Ⅰ)～(Ⅴ)任一所示的结构：
式(Ⅱ)中，R1为β-OH，R2为α-OH、α-OAc或β-OAc；或R1为β-OAc，R2为α-OH；
式(Ⅲ)中，R3为OA，R4为β-OB、OH或OAc，R5为OH或H；或R3为OH，R4为β-OB、OH或OAc，R5为OH；或R3为OH，R4为β-OB或OH，R5为H；或R3为OAc，R4为β-OB，R5为OH或H；或R3为OAc，R4为OH，R5为OH；
式(Ⅳ)中，R6为OH或H，R7为OA；
其中，OA中的
中的
该多烯炔类化合物基本骨架的特点是至少一个碳碳双键与两个碳碳三键共轭，且碳碳双键为反式碳碳双键；此外，该多烯炔类化合物的结构中还含有羟基或酯基。该多烯炔类化合物具有抗氧化性，可以显著抑制破骨细胞的分化活性，其在10μM下对于RANKL诱导的破骨细胞具有明显的抑制分化效果，且不显示细胞毒性。
优选地，式(Ⅱ)中，R1为β-OH，R2为α-OH。
优选地，式(Ⅲ)中，R3为OA，R4为OAc，R5为H；或R3为OAc，R4为β-OB，R5为OH。
优选地，式(Ⅴ)中，R6为OH，R7为OA。
优选地，所述多烯炔类化合物的结构式如下：
上述多烯炔类化合物的制备方法，所述式(Ⅰ)、式(Ⅲ)和式(Ⅴ)多烯炔类化合物的制备方法包括如下步骤：
S11.将茅苍术的根茎干燥，粉碎，浸提并减压浓缩得粗浸膏；
S12.将粗浸膏混悬，萃取，减压浓缩，经色谱柱洗脱，再经层析、高效液相色谱分离后，即得所述式(Ⅰ)、式(Ⅲ)和式(Ⅴ)多烯炔类化合物。
优选地，步骤S11中采用乙醇溶液或丙酮溶液中的一种或两种进行浸提。
更为优选地，步骤S11中所述乙醇溶液的体积分数为80％～100％，所述丙酮溶液的体积分数为70％～100％。
优选地，步骤S11中所述浸提的次数为3～5次，单次浸提的时间为2～5天。
优选地，步骤S12中所述萃取为乙酸乙酯萃取。
优选地，步骤S12中所述洗脱的洗脱液为石油醚/乙酸乙酯混合溶液；洗脱的梯度为：石油醚/乙酸乙酯的体积比为0→40min：1:0→20:1，40→80min：20:1→5:1，80→120min：5:1→2:1，120→160min：2:1→1:1，160→200min：1:1→0:1。
具体地，将茅苍术的干燥根茎粉碎，用80％丙酮水溶液，在室温下浸提4次，每次3天；将提取液减压浓缩得粗提物浸膏；将浸膏混悬于水中，用乙酸乙酯萃取5次，减压浓缩得乙酸乙酯部位，经200～300目的硅胶柱色谱，用石油醚/乙酸乙酯混合溶液按照梯度洗脱；梯度洗脱中石油醚/乙酸乙酯的体积比为0→40min：1:0→20:1，40→80min：20:1→5:1，80→120min：5:1→2:1，120→160min：2:1→1:1，160→200min：1:1→0:1；再将上述步骤当中得到的馏分依次通过硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱和高效液相色谱纯化，即式(Ⅰ)、式(Ⅲ)和式(Ⅴ)多烯炔类化合物。
上述多烯炔类化合物的制备方法，所述式(Ⅱ)、式(Ⅲ)和式(Ⅳ)多烯炔类化合物的制备方法包括如下步骤：
S21.将北苍术的根茎干燥，粉碎，浸提并减压浓缩得粗浸膏；
S22.将粗浸膏混悬，萃取，减压浓缩，经色谱柱洗脱，再经层析、高效液相色谱分离后，即得所述式(Ⅱ)、式(Ⅲ)和式(Ⅳ)多烯炔类化合物。
优选地，步骤S21中采用乙醇溶液或丙酮溶液中的一种或两种进行浸提。
更为优选地，步骤S21所述乙醇溶液的体积分数为80％～100％，所述丙酮溶液的体积分数为70％～100％。
优选地，步骤S21中所述浸提的次数为3～5次，单次浸提的时间为2～5天。
优选地，步骤S22中所述萃取为乙酸乙酯萃取。
优选地，步骤S22中所述洗脱的洗脱液为石油醚/乙酸乙酯混合溶液；洗脱的梯度为：石油醚/乙酸乙酯的体积比为0→40min：1:0→20:1，40→80min：20:1→5:1，80→120min：5:1→2:1，120→160min：2:1→1:1，160→200min：1:1→0:1。
具体地，将北苍术的干燥根茎粉碎，用95％乙醇水溶液，在室温下浸提4次，每次3天；将提取液减压浓缩得粗提物浸膏；将浸膏混悬于水中，用乙酸乙酯萃取6次，减压浓缩得乙酸乙酯部位，经200～300目的硅胶柱色谱，用石油醚/乙酸乙酯混合溶液按照梯度洗脱；梯度洗脱中石油醚/乙酸乙酯的体积比为0→40min：1:0→20:1，40→80min：20:1→5:1，80→120min：5:1→2:1，120→160min：2:1→1:1，160→200min：1:1→0:1。再将上述步骤当中得到的馏分依次通过硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱和高效液相色谱纯化，即式(Ⅱ)、式(Ⅲ)和式(Ⅳ)多烯炔类化合物。
上述多烯炔类化合物在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种预防和/或治疗骨质疏松的药物，所述药物含有上述多烯炔类化合物。
优选地，所述药物还含有药学上可接受的载体。
优选地，所述药物还含有药学上可接受的辅料。
优选地，所述药物可以制成现有的各种药物的剂型。
更为优选地，所述药物的剂型为注射液、片剂或胶囊。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
该多烯炔类化合物在10μM下对于RANKL诱导的破骨细胞具有明显的抑制分化效果，且不显示细胞毒性。
附图说明
图1是实施例1和实施例2分离所得化合物CZ-1～CZ-19的结构。
图2为化合物CZ-5,CZ-6,CZ-9,CZ-13,CZ-14,CZ-16,CZ-17,CZ-19的1H-1H
相关谱和
相关谱。
图3(A)为化合物对BMM细胞的毒性测定结果图；图3(B)为化合物CZ-1～CZ-19在10μM浓度下对破骨细胞分化的抑制结果图；图3(C)为化合物CZ-1～CZ-19在3μM浓度下对破骨细胞分化的抑制结果图；图3(D)为CZ-1,CZ-2，CZ-15的TRAcP染色实验结果图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1
本实施例提供化合物CZ-2，CZ-4，CZ-5，CZ-13，CZ-14，CZ-15，CZ-19，通过如下过程制备得到。
将茅苍术干燥根茎(5.0kg)粉碎，加入20升80％丙酮在室温下浸提4次，每次3天。将所得浸提液合并，减压浓缩后得到浸膏600g。将粗浸膏混悬于水中，乙酸乙酯萃取6次后浓缩得到乙酸乙酯层440g，使用石油醚/乙酸乙酯(体积比为0→40min：1:0→20:1，40→80min：20:1→5:1，80→120min：5:1→2:1，120→160min：2:1→1:1，160→200min：1:1→0:1)经硅胶柱色谱200-300目梯度洗脱得到5个流分A-E。其中C部分(18g)使用C18柱，甲醇/水(30％)洗脱得到12个亚流分C1-C12。C6部分在硅胶柱上经石油醚/丙酮梯度洗脱(50:1-2:1,v/v)得到CZ-2(2000mg)。C7部分经由高效液相色谱分离(45％乙腈，1.0mL/min)，得到CZ-14(4mg)、CZ-15(3mg)和CZ-4(15mg)。流分C9使用高效液相色谱(55％甲醇，1.0mL/min)分离得到化合物CZ-19(4mg)。D段(22g)在C18柱上经由甲醇/水(30％)洗脱得到15个亚流分D1-D15。馏分D12在硅胶柱色谱上选用石油醚/乙酸乙酯体系(20:1-1:1,v/v)划分为6段其中D12.3在高效液相色谱上60％甲醇1.0mL/min分离得到CZ-13(6mg)、CZ-15(8mg)和CZ-5(4mg)。
所得化合物结构见图1。
实施例2
本实施例提供化合物CZ-1，CZ-2，CZ-3，CZ-4，CZ-6，CZ-7，CZ-8，CZ-9，CZ-10，CZ-11，CZ-12，CZ-16，CZ-17，CZ-18，CZ-19，通过如下过程制备得到。
将北苍术干燥根茎(5.0kg)粉碎，加入20升95％乙醇在室温下浸提4次，每次3天。将所得浸提液合并，减压浓缩后得到浸膏770g。将粗浸膏混悬于水中，乙酸乙酯萃取6次后浓缩得到乙酸乙酯层330g，使用石油醚/乙酸乙酯(体积比为0→40min：1:0→20:1，40→80min：20:1→5:1，80→120min：5:1→2:1，120→160min：2:1→1:1，160→200min：1:1→0:1)经硅胶柱色谱(200-300目)梯度洗脱得到6个流分(A-F)，其中A部分使用硝酸银硅胶柱(300-400目)，纯石油醚等度洗脱得到化合物CZ-1(15g)。C部分(35g)使用C18柱，甲醇/水(30％-100％)洗脱，得到8个亚流分C1-C8。其中C3部分使用硝酸银硅胶柱(300-400目)，石油醚/二氯甲烷进行梯度洗脱得到流分C3.1-C3.5。C3.2通过半制备高效液相色谱(75％乙腈，1.5mL/min)分离得到化合物BCZ-3(20mg)。C3.5通过半制备高效液相色谱(60％乙腈，1.5mL/min)分离得到化合物CZ-6(6mg)和CZ-11(4mg)。C4部分使用硅胶柱(300-400目)，环己烷/丙酮进行梯度洗脱划段成C4.1-C4.5。C4.1部分使用高效液相色谱(73％乙腈，1.5mL/min)纯化得到CZ-3(30mg)。C4.4使用制备薄层色谱，二氯甲烷展开，分离得到CZ-18(6mg)。C4.5通过凝胶色谱划分为C4.5.1和C4.5.2两段之后，将C4.5.1通过高效液相色谱(75％乙腈，1.5mL/min)制备得到CZ-2(8mg)。C5部分使用硝酸银硅胶柱(300-400目)，石油醚/乙酸乙酯进行梯度洗脱得到流分C5.1-C5.8。C5.2使用高效液相色谱(75％乙腈，1.5mL/min)制备出CZ-9(15mg)。C5.7使用高效液相色谱(72％乙腈，1.5mL/min)制备得到CZ-16(5mg)。D部分(45g)使用C18柱，甲醇/水(30％-100％)洗脱，得到10个亚流分D1-D10。D3经由硅胶柱(300-400目)，石油醚/丙酮梯度洗脱，划分为D3.1-D3.6。D3.2同样使用硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，得到D3.2.1-D3.2.3三个部分，将D3.2.2通过半制备高效液相色谱(75％甲醇，1.5mL/min)分离得到化合物CZ-7(20mg)，CZ-10(7mg)和CZ-12(40mg)。
所得化合物结构见图1。
化合物CZ-1～CZ-19的理化性质数据如下：
CZ-1(atractylodin)，无色晶体，C13H10O，1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 7.41(d,J＝1.8Hz,H-13),6.82(d,J＝15.9Hz,H-9),6.44(dd,J＝3.4,1.8Hz,H-12),6.40(m,H-11),6.33(m,H-2),6.14(d,J＝15.9Hz,H-8),5.62(m,H-3),1.86(dd,J＝6.9,1.9Hz,H3-1)。13CNMR(125MHz,CDCl3)δC 152.1(s,C-10),143.8(d,C-2),143.7(d,C-13),130.9(d,C-9),112.2(d,C-11),111.2(d,C-12),110.1(d,C-3),105.0(d,C-8),82.1(s,C-4),80.4(s,C-7),77.3(s,C-6),72.7(s,C-5),19.1(q,C-1)。
CZ-2(atractylodinol)，棕色无定型粉末，C13H10O2，1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 7.37(s,H-13),6.80(d,J＝15.9Hz,H-9),6.43(overlapped,H-12),6.41(overlapped,H-11),6.39(overlapped,H-2),6.10(d,J＝15.9Hz,H-8),5.86(dq,J＝16.1,1.6Hz,H-3),4.26(m,H2-9)。13C NMR(100MHz,CDCl3)δC 151.8(s,C-10),145.4(d,C-2),143.7(d,C-13),131.2(d,C-9),112.2(d,C-11),111.4(d,C-12),109.0(d,C-3),104.6(d,C-8),81.2(s,C-4),81.0(s,C-7),77.0(s,C-5),74.9(s,C-6),62.7(t,C-1)。
CZ-3(acetylatractylodinol)，棕色无定型粉末，C15H12O3，1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 7.39(d,J＝1.7Hz,H-13),6.81(d,J＝15.9Hz,H-9),6.42(dd,J＝3.4,1.8Hz,H-12),6.39(d,J＝3.4Hz,H-11),6.30(dt,J＝15.9,5.8Hz,H-2),6.10(d,J＝15.9Hz,H-8),5.85(m,H-3),4.63(dd,J＝5.8,1.7Hz,H2-1),2.08(s,H3-2’)。13CNMR(125MHz,CDCl3)δC 170.5(s,C-1’),151.9(s,C-10),143.8(d,C-13),139.7(d,C-2),131.4(d,C-9),112.3(d,C-12),112.2(d,C-3),111.6(d,C-11),104.6(d,C-8),81.6(s,C-6),80.2(s,C-4),76.8(s,C-7),75.7(s,C-5),63.7(t,C-1),20.9(q,C-2’)。
CZ-4((1Z)-atractylodinol)，棕色无定型粉末，C13H10O2，1H NMR(400MHz,CDCl3)δH7.43(d,J＝1.8Hz,H-13),7.05(d,J＝3.5Hz,H-11),6.70(d,J＝11.9Hz,H-9),6.45(dt,J＝15.9,4.9Hz,H-12),5.92(ddd,J＝16.0,3.0,1.8Hz,H-3),5.58(d,J＝11.8Hz,H-8),4.28(dd,J＝4.8,2.0Hz,H2-11)。13C NMR(100MHz,CDCl3)δC 152.5(s,C-10),145.5(d,C-2),142.8(d,C-13),130.1(d,C-9),112.2(d,C-11),111.9(d,C-12),109.5(d,C-2),102.9(d,C-8),82.4(s,C-4),81.5(s,C-7),80.2(s,C-6),74.8(s,C-5),62.9(t,C-1)。
CZ-5((2E,8E)-1-hydroxynona-2,8-dien-4,6-diyne-1′-methoxyfuran 13-one)，棕色无定型粉末，
UV(MeOH)λmax(logε)204(0.84),279(0.74),297(0.83),317(0.77)nm；IR(KBr)νmax 3395,2923,2206,1777,1264,1081,821 cm-1；。1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 4.27(dd,J＝4.7,2.1Hz,H2-1),6.44(dt,J＝15.9,4.7Hz,H-2),5.87(dt,J＝15.9,2.0Hz,H-3),6.14(s,H-8),6.14(s,H-9),7.11(d,J＝5.6,H-11),6.19,(d,J＝5.6,H-12),3.34(s,H3-1’)。13C NMR(100MHz,CDCl3)δC 169.8(s,C-13),152.6(d,C-11),146.4(d,C-2),138.4(d,C-9),123.8(d,C-12),114.4(d,C-8),108.6(d,C-3),107.5(s,C-10),81.4(s,C-4),78.0(s,C-7),77.7(s,C-6),74.1(s,C-5),62.8(t,C-1),52.1(1,C-1’)。
CZ-6(erythro-(2E,8E)-2,8,12-trien-4,6-diyne-10,11-diol)，黄色油状，UV(c0.03,MeOH)λmax(logε)242(1.50),262(1.25),276(1.45),297(1.22),313(1.37)nm；
IR(KBr)νmax 3328,2204,1722,1625,1434,1045,946cm-1；1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 6.33(dd,J＝15.8,6.9,H-2),6.28(dd,J＝15.8,5.5,H-9),5.89(d,J＝15.8,H-8),5.84(d,J＝17.3,H-12),5.57(d,J＝15.8,H-3),5.36(dd,J＝17.3,1.3,H-13a),5.30(dd,J＝10.5,1.3,H-13b),4.28(d,J＝5.0,H-10),4.23(d,J＝5.0,H-11),1.82(d,J＝6.9,H3-1)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 144.0(d,C-2),143.5(d,C-9),135.6(d,C-12),118.2(t,C-13),111.4(d,C-8),109.9(d,C-3),81.1(s,C-4),78.6(s,C-7),77.2(s,C-6),75,4(d,C-11),74.5(d,C-10),72.2(s,C-5)。
CZ-7(erythro-(1,5E,11E)-tridecatriene-7,9-diyne-3,4-diacetate)，黄色油状，C17H18O4，1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 6.33(m,H-12),6.14(dd,J＝15.9,6.7Hz,H-5),5.80(dt,J＝15.9,1.1Hz,H-6),5.73(ddd,J＝17.1,10.5,6.5Hz,H-2),5.58(m,H-11),5.44(overlapped,H-4),5.44(overlapped,H-3),5.34(overlapped,H-1a),5.32(overlapped,H-1b),2.06(s,H3-2’),2.05(s,H3-4’),1.81(dd,J＝6.9,1.8Hz,H3-13)。13C NMR(100MHz,CDCl3)δC 169.9(s,C-1’),169.8(s,C-3’),144.3(d,C-12),138.6(d,C-5),131.4(d,C-2),120.1(t,C-1),113.7(d,C-6),109.8(d,C-11),81.5(s,C-8),77.8(s,C-9),76.2(s,C-10),74.5(s,C-3),73.7(d,C-4),72.0(s,C-7),21.0(q,C-2’),21.0(q,C-4’),19.1(q,C-13)。
CZ-8(thero-(1,5E,11E)-tridecatriene-7,9-diyne-3,4-diacetate)，黄色油状，C17H18O4，1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 6.34(m,H-12),6.12(dd,J＝15.9,6.4Hz,H-5),5.82(d,J＝16.0Hz,H-6),5.73(ddt,J＝17.0,10.6,5.4Hz,H-2),5.45(m,H-4),5.38(m,H-3),5.34(overlapped,H-1a),5.31(overlapped,H-1b),2.09(s,H3-2’),2.07(s,H3-4’),1.83(m,H3-13)。13C NMR(100MHz,CDCl3)δC 169.8(s,C-1’),169.7(s,C-3’),144.4(d,C-12),139.0(d,C-5),131.7(d,C-2),112.0(t,C-1),113.6(d,C-6),109.9(d,C-11),81.6(s,C-10),77.8(s,C-7),76.4(s,C-8),74.1(s,C-3),73.4(d,C-4),72.1(d,C-9),21.1(q,C-2’),21.0(q,C-4’),19.1(q,C-13)。
CZ-9((2E,8E,10E)-14-acetoxy-12-β-methylbutyryltetradeca-2,8,10-trien-4,6-diy ne)，黄色油状(MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)265(1.74),276(1.71),318(1.69),334(1.68)nm；
IR(KBr)νmax 2960,2196,1737,1371,1238,1045cm-1；1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 6.62(dd,J＝15.5,10.9,H-9),6.32(overlapped,H-2),6.28(overlapped,H-10),5.74(dd,J＝15.4,7.2,H-11),5.68(d,J＝15.5,H-8),5.57(d,J＝16.2,H-3),5.40(dd,J＝7.2,7.0,H-12),4.08(m,H2-14),1.96(overlapped,H2-13),2.16(m,H2-2’),2.08(m,H-3’),2.00(s,H3-7’),1.81(dd,J＝6.9,1.9,H-1),0.93(d,J＝6.5,H3-4’),0.93(d,J＝6.5,H3-5’)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δC 19.0(t,C-1),143.9(d,C-2),110.0(d,C-3),82.2(s,C-4),72.4(s,C-5),77.6(s,C-6),79.8(s,C-7),111.7(d,C-8),143.0(d,C-9),131.7(d,C-10),134.2(d,C-11),70.5(d,C-12),33.4(t,C-13),60.4(t,C-14),172.2(s,C-1’),43.6(t,C-2’),25.8(d,C-3’),22.5(q,C-4’),22.4(q,C-5’),171.0(s,C-6’),21.0(q,C-7’)。
CZ-10((2E,8E,10E)-14-acetoxy-2,8,10-trien-4,6-diyne-12-ol)，黄色油状，C16H18O3，1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 6.67(dd,J＝15.5,10.9Hz,H-2),6.32(overlapped,H-11),6.28(overlapped,H-9),5.84(dd,J＝15.3,6.1Hz,H-9),5.67(d,J＝15.5Hz,H-8),5.58(ddd,J＝15.9,2.0,1.1Hz,H-3),4.29(dd,J＝11.3,8.0Hz,H2-14),4.14(m,H-12),2.05(s,H-2’),1.82(m,H3-1)。13C NMR(100MHz,CDCl3)δC 171.5(s,C-1’),143.9(d,C-2),143.6(d,C-11),139.0(d,C-10),129.4(d,C-9),110.8(d,C-3),110.0(d,C-8),82.0(s,C-4),80.0(s,C-7),77.1(s,C-5),72.5(s,C-12),69.1(d,C-6),61.2(t,C-14),36.2(t,C-13),21.1(q,C-2’),19.1(q,C-1)。
CZ-11(3-acetoxy-tetradecatrien-(4.6.12)-diin-(8.10)-ol-(1))，黄色油状，C16H18O3，1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 6.65(dd,J＝15.5,10.9Hz,H-9),6.33(overlapped,H-2),6.32(overlapped,H-10),5.79(dd,J＝15.2,7.0Hz,H-3),5.71(dd,J＝15.5,7.0Hz,H-8),5.58(d,J＝15.6Hz,H-11),5.51(m,H-12),3.70(m,H2-14),2.17(s,H3-2’),2.09(overlapped,H2-13),1.81(m,H3-1)。13C NMR(100MHz,CDCl3)δC 171.0(s,C-1’),144.0(d,C-2),143.2(d,C-10),134.5(d,C-11),131.2(d,C-9),111.7(d,C-8),110.0(d,C-3),82.2(s,C-4),79.9(s,C-7),77.4(s,C-5),72.5(s,C-6),71.3(s,C-12),58.6(d,C-14),37.5(t,C-13),21.3(q,C-2’),19.1(q,C-1)。
CZ-12((4E,6E,12E)-tetradecatriene-8,10-diyne-1,3-diyl diacetate)，黄色油状，C18H20O4，1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 6.61(dd,J＝15.5,10.9Hz,H-11),6.32(overlapped,H-2),6.30(overlapped,H-9),5.72(overlapped,H-10),5.66(overlapped,H-3),5.56(m,H-8),5.37(dd,J＝6.7Hz,H-12),4.06(m,H2-14),2.03(s,H3-2’),2.01(s,H3-4’),1.80(m,H3-1)。13C NMR(100MHz,CDCl3)δC 170.9(s,C-1’),170.1(s,C-3’),143.9(d,C-2),142.9(d,C-10),134.0(d,C-11),131.6(d,C-9),111.8(d,C-8),109.9(d,C-3),82.2(s,C-4),79.8(s,C-7),77.4(s,C-5),72.4(s,C-6),70.8(d,C-12),60.3(t,C-14),33.3(t,C-13),21.2(q,C-2’),20.9(q,C-4’),19.0(q,C-1)。
CZ-13((2E,8E,10E)-12-acetoxy-14-feruloyltetradeca-2,8,10-trien-4,6-diyne-1-ol)，棕色无定型粉末，
UV(MeOH)λmax(logε)203(1.43),243(1.34),266(1.24),296(1.35),315(1.45),366(1.37)nm；IR(KBr)νmax 3415,2190,1704,1630,1513,1264,1031cm-1；1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 7.61(d,J＝16.0,H-5’),7.03(d,J＝2.0,H-7’),6.91(d,J＝8.1,H-10’),7.07(dd,J＝8.1,2.0,H-11’),6.65(dd,J＝15.5,10.9,H-9),6.41(dt,J＝16.0,4.8,H-2),6.32(dd,J＝15.5,10.9,H-10),6.26(d,J＝16.0,H-4’),5.87(brd,J＝16.0,H-3),5.78(dd,J＝15.5,7.0,H-11),5.70(d,J＝15.5,H-8),5.46(dd,J＝7.0,6.6,H-12),4.25(overlap,H2-1),4.24(overlap,H2-14),3.92(s,H3-12’),2.05(s,H3-13),2.07(s,H3-2’)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 170.4(s,C-1’),167.2(s,C-3’),148.2(s,C-9’),146.0(s,C-8’),145.7(d,C-2),145.4(d,C-5’),143.4(d,C-9),134.4(d,C-11),131.6(d,C-10),127.0(s,C-6’),123.4(d,C-11’),115.1(d,C-4’),114.9(d,C-10’),111.6(d,C-8),109.4(d,C-7’),109.0(d,C-3),81.8(s,C-4),80.7(s,C-7),77.4(s,C-6),74.7(s,C-5),71.1(d,C-12),62.8(t,C-1),60.3(t,C-14),56.1(q,C-12’),33.6(t,C-13),21.3(q,C-2’)。
CZ-14((2E,8E)-12-β-methylbutyryltetradeca-2,8-dien-4,6-diyne-1,14-diol)，棕色无定型粉末，
UV(MeOH)λmax(logε)202(0.84),215(0.92),254(0.51),269(0.53),285(0.48),312(0.30)nm；IR(KBr)νmax 3420,2958,2204,1716,1369,1259,800cm-1；1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 6.32(dq,15.8,6.9,H-2),6.16(dd,15.9,6.6,H-9),5.75(d,15.9,H-8),5.57(dq,15.8,1.0,H-3),5.30(tdd,7.1,6.1,1.3,H-10),3.63(t,6.5,H2-14),2.19(d,6.7,H2-2’),2.09(m,H-3’),1.82(dd,6.9,1.9,H3-1),1.64(overlap,H2-11),1.57(overlap,H2-13),1.38(overlap,H2-12),0.95(d,6.5,H3-4’),0.95(d,6.5,H3-5’)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δC 172.4(s,C-1’),144.0(d,C-9),144.1(d,C-2),111.2(d,C-8),109.9(d,C-3),81.1(s,C-4),78.4(s,C-7),75.5(s,C-6),73.1(s,C-5),73.1(d,C-10),62.7(t,C-14),43.7(t,C-2’),34.0(t,C-11),32.5(t,C-13),25.9(d,C-3’),22.5(q,C-4’),22.5(q,C-5’),21.4(t,C-12),19.1(q,C-1)。
CZ-15(12,14-diacetate-2E,8E,10E-trien-4,6-diyn-1-ol)，棕色无定型粉末，C18H20O5，1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 6.41(dt,J＝15.9,4.9Hz,H-2),6.30(dd,J＝15.3,10.8Hz,H-10),5.88(m,H-3),5.76(m,H-11),5.71(d,J＝15.3Hz,H-8),5.40(m,H-12),4.26(dd,J＝4.9,2.0Hz,H2-1),4.12(m,H2-14),2.07(s,H3-1’),2.04(s,H3-4’),1.97(m,H2-13)。13CNMR(100MHz,CDCl3)δC 171.1(s,C-1’),170.3(s,C-3’),145.6(d,C-2),143.4(d,C-9),134.3(d,C-10),131.7(d,C-11),111.7(d,C-8),109.0(d,C-3),81.2(s,C-5),80.7(s,C-4),76.8(s,C-7),74.7(s,C-6),70.9(d,C-12),62.8(t,C-1),60.4(t,C-14),33.4(t,C-13),21.3(q,C-2’),21.1(q,C-4’)。
CZ-16((2E,8E,10Z)-13-acetoxytrideca-2,8,10-trien-4,6-diyne-12-ol)，黄色油状(MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)217(1.57),249(1.61),266(1.57),316(1.67),337(1.49)nm；
IR(KBr)νmax 3440,2933,2198,1739,1373,1238,1041cm-1；1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 1.82(dd,J＝6.8,1.8,H3-1),6.33(dd,J＝15.8,6.8,H-2),5.58(d,J＝15.8,H-3),5.73(d,J＝15.5,H-8),6.99(dd,J＝15.5,11.6,H-9),6.18(t,J＝11.4,H-10),5.50(m,H-11),4.80(m,H-12),4.10(dd,J＝11.0,3.8,H-13a),4.03(dd,J＝11.0,7.3,H-13b),2.09(s,H3-2’)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δC 171.2(s,C-1’),144.2(d,C-2),138.6(d,C-9),131.8(d,C-11),131.0(d,C-10),113.2(d,C-8),109.9(d,C-3),82.6(s,C-4),79.8(s,C-7),78.2(s,C-6),72.4(s,C-5),67.7(t,C-13),66.8(d,C-12),21.0(q,C-2’),19.1(q,C-1)。
CZ-17((2E,8E,10Z)-13-β-methylbutyryltrideca-2,8,10-trien-4,6-diyne-12-ol)，黄色油状(MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)268(1.60),276(1.57),324(1.55)nm；
IR(KBr)νmax 3442,2960,2198,1733,1375,1189,1099cm-1；1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 7.01(dd,J＝15.5,7.4,H-9),6.34(dd,J＝15.8,6.9,H-2),6.19(t,J＝11.0,H-10),5.74(d,J＝15.5,H-8),5.59(dd,J＝15.8,1.9,H-3),5.51(dd,J＝11.0,8.3,H-11),4.81(m,H-12),4.13(dd,J＝11.5,4.0,H-13a),4.05(dd,J＝11.5,7.4,H-13b),2.24(d,J＝7.2,H2-2’),2.11(m,H-3’),1.83(dd,J＝6.9,1.9,H3-1),0.97(d,J＝6.9,H3-4’),0.97(d,J＝6.9,H3-5’)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δC 173.3(s,C-1’),144.2(d,C-2),138.6(d,C-9),131.8(d,C-11),131.1(d,C-10),113.3(d,C-8),110.0(d,C-3),82.6(s,C-4),79.8(s,C-7),78.2(s,C-6),72.4(s,C-5),67.0(d,C-12),67.5(t,C-13),43.4(t,C-2’),25.8(d,C-3’),22.6(q,C-4’),22.6(q,C-5’),19.1(q,C-1)。
CZ-18((2Z,4E,10E)-dodeca-2,4,10-trien-6,8-diynyl acetate)，黄色油状，C15H16O2，1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 6.99(ddd,J＝15.5,11.6,1.1Hz,H-9),6.35(dd,J＝15.7,6.9Hz,H-2),6.19(t,J＝11.1Hz,H-11),5.77(m,H-10),5.71(d,J＝15.5Hz,H-8),5.61(overlapped,H-11),4.13(t,J＝6.6Hz,H2-13),2.57(m,H2-12),2.06(s,H3-2’),1.85(dd,J＝6.9,1.9Hz,H3-1)。13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 171.2(s,C-1’),143.9(d,C-2),139.3(d,C-9),130.9(d,C-10),130.3(d,C-11),111.1(d,C-8),110.1(d,C-3),82.1(s,C-4),80.3(s,C-7),77.2(s,C-6),72.5(s,C-5),63.4(t,C-13),27.8(q,C-12),21.1(q,C-2’),19.1(q,C-1)。
CZ-19(erythro-(2E,10E)-1,8,9-triacetoxytrideca-2,8,10-trien-4,6-diyne-1,14-diol)，棕色无定型粉末，
UV(MeOH)λmax(logε)203(0.84),214(0.91),254(0.36),268(0.42),284(0.34)nm；IR(KBr)νmax 3447,2965,2234,1741,1369,1226,1025,800cm-1；1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 6.71(t,J＝16.9,10.6,H-12),6.34(dt,J＝16.0,5.6,H-2),6.26(t,J＝11.1,H-11),5.96(dd,J＝9.1,4.2,H-9),5.76(d,J＝16.0,H-3),5.62(d,J＝4.2,H-8),5.43(t,J＝11.1,H-10),5.32(overlapped,H2-13),4.63(dd,J＝5.6,1.8,H2-1),2.08(s,H3-2’),2.08(s,H3-4’),2.08(s,H3-6’)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 170.5(s,C-1’),170.0(s,C-5’),169.6(s,C-3’),141.1(d,C-2),135.4(d,C-11),131.4(d,C-12),123.3(d,C-10),121.8(t,C-13),111.3(d,C-3),77.4(s,C-4),74.3(s,C-5),71.5(s,C-6),76.0(s,C-7),69.5(d,C-9),65.5(d,C-8),63.6(t,C-1),20.9(q,C-2’),21.1(q,C-4’),20.9(q,C-6’)。
其中，化合物CZ-5,CZ-6,CZ-9,CZ-13,CZ-14,CZ-16,CZ-17,CZ-19为新化合物，其结构解析如下：
CZ-5，棕色无定型粉末，
高分辨质谱显示加钠离子峰m/z267.0629[M+Na]+，提示该化合物分子式为C14H12O4，不饱和度为9。多烯炔类的手掌状紫外特征吸收峰(λmax 204,279,297,317nm)提示了MCZ-28丁二炔和双键共轭的部分结构。对比CZ-5和CZ-2(atractylodinol)，CZ-2中的呋喃环在CZ-5中被氧化成α,β-不饱和-γ-内酯环。另外HMBC谱中甲氧基的氢(δH 3.34)和C-10(δC 107.5)的相关表明了甲氧基(δC 52.1)取代在10位。双键的构型通过耦合常数确定，氘代氯仿中δH 6.44(dt,J＝15.9,4.7),5.87(dt,J＝15.9,2.0),7.11(d,J＝5.6),6.19(d,J＝5.6)的信号确定了2E,11′Z的构型，但由于H-8和H-9信号重叠无法判断Δ8(9)双键的构型。使用氘代丙酮做谱，根据氢谱中δH 7.49(d,J＝5.6),6.53(dt,J＝16.6,3.5),6.36(d,J＝5.6),6.34(d,J＝16.6),6.17(d,J＝15.8),5.92(d,J＝15.8)的信号判断8E的双键构型。因此CZ-5的结构推定为(2E,8E)-1-hydroxynona-2,8-dien-4,6-diyne-1’-methoxyfuran 13-one。
CZ-6，黄色油状，[α]20 D+18(c 0.1,MeOH)。高分辨质谱显示加钠离子峰m/z225.0885[M+Na]+，提示该化合物分子式为C13H14O2，不饱和度为7。红外光谱(IR)显示出羟基(3328cm-1)，共轭炔烃(2204cm-1)和碳-碳双键(1625cm-1)的特征吸收峰。1H NMR谱给出信号δH 1.82(d,J＝6.9Hz,H3-1)提示该化合物结构中包含1个连接在不饱和双键上的甲基，同时δH 6.33(dd,J＝15.8,7.0,H-2)，δH 5.57(d,J＝15.8,H-3)，δH 5.89,(d,J＝15.8,H-8)，δH 6.28(dd,J＝15.8,5.5,H-9)，δH 5.84(d,J＝17.3,H-12)，δH 5.36(dd,J＝17.3,1.3,H-13a)，δH 5.30(dd,J＝10.5,1.3,H-13b)提示7个烯氢的存在，包括2个反式双键。13C NMR和DEPT谱数据显示化合物CZ-6中存在1个甲基(δC 19.0)，1个亚甲基(δC 118.2)，7个次甲基(δC 144.0,143.5,135.6,111.4,109.9),2个连氧碳原子(75.4,74.5)和4个炔基季碳(δC81.1,78.6,77.2,72.2)。CZ-6的特征掌状紫外吸收[λmax(logε)242(1.50),262(1.25),276(1.45),297(1.22),313(1.37)nm]提示其为一个丁二炔和双键共轭的多烯炔类化合物。根据CZ-6的HSQC和COSY谱进行归属和连接，H3-1(δH 1.82)/H-2(δH 6.33)/H-3(δH 5.57)和H-8(δH 5.89)/H-9(δH 6.28)/H-10(δH 4.28)/H-11(δH 4.23)/H-12(δH 5.84)/H2-14(δH5.36,5.30)的COSY相关提示了结构中两个自旋耦合系统。H-2和C-4(δC 81.1)，H-3和C-5(δC77.2)，H-8和C-6(δC 72.2)以及H-9和C-7(δC 78.6)的HMBC相关信号提示了丁二炔基的位置。双键的构型通过烯氢的耦合常数推断为2E,8E。而10-OH和11-OH的相对构型通过H-10和H-11的耦合常数(J10,11＝5.0)，根据链状邻二醇上邻二羟基构型判断的经验公式判断为赤式构型。因此CZ-6的结构确定为erythro-(2E,8E)-2,8,12-trien-4,6-diyne-10,11-diol。
CZ-9，黄色油状，[α]20 D-28(c 0.1,MeOH)。高分辨质谱显示离子峰365.1720[M+Na]+，提示其分子式为C21H26O4。红外光谱给出共轭炔基(2196cm-1)和羰基(1737cm-1)的特征吸收峰。对比化合物CZ-9和CZ-10的一维核磁图谱，发现二者的区别在于CZ-9多了一个取代基β-methylbutyryl的核磁信号(δC 172.2,43.6,25.8,22.5,22.4,δH 2.16,2.08,0.93×2)，该取代基的位置通过H-12(δC 5.40)和C-1’(δC 172.2)的HMBC信号推定。因此CZ-9的结构推定为(2E,8E,10E)-14-acetoxy-12-β-methylbutyryltetradeca-2,8,10-trien-4,6-diyne。
CZ-13，棕色无定型粉末，
高分辨质谱显示加钠离子峰m/z 473.1566[M+Na]+，提示该化合物分子式为C26H26O7。由分子式推出该化合物不饱和度为14。紫外光谱显示λmax 203,243,266,296,315和336nm的最大吸收峰，红外光谱显示羟基(3415cm-1)，共轭炔烃(2190cm-1)，羰基(1704cm-1)和碳-碳双键(1630cm-1)的特征吸收峰。根据以上性状与波谱特征，尤其是该分子特征的手掌状紫外吸收[λmax(logε)203(1.43),243(1.34),266(1.24),296(1.35),315(1.45),366(1.37)nm]，结合文献调研可推断化合物CZ-13为多烯炔类化合物。对比CZ-13和CZ-13的核磁数据，C-14的取代基由乙酰基替换为阿魏酰基(δC 167.2,148.2,146.0,145.4,127.0,123.4,115.1,114.9,109.4,56.1,δH 7.61,7.07,6.91,6.26,7.03,3.92)。此外根据氢谱提供的耦合常数δH 6.41(dt,J＝16.0,4.8),5.87(brd,J＝16.0),δH 6.65(dd,J＝15.5,10.9),5.70(d,J＝15.5),6.32(dd,J＝15.5,10.9),5.78(dd,J＝15.5,7.0),7.61(d,J＝16.0),6.26(d,J＝16.0)可判断双键构型为2E,8E,10E,4’E。因此化合物CZ-13的结构确定为(2E,8E,10E)-12-acetoxy-14-feruloyltetradeca-2,8,10-trien-4,6-diyne-1-ol。
CZ-14，棕色无定型粉末，
高分辨质谱显示加钠离子峰m/z325.1773[M+Na]+，提示该化合物分子式为C19H26O3。结合紫外光谱和红外光谱的特征吸收峰可判断CZ-14为一多烯炔类化合物。CZ-14和已知化合物codonopilodiynoside E(Chen HP,Zheng L S,Yang K,et al.,Insecticidal and repellant activitiesofpolyacetylenes and lactones derived from Atractylodes lancea rhizomes[J].Chemical Biodiversity.2015,12:593-598.)拥有相似的波谱数据，但区别在于codonopilodiynoside E的葡萄糖基在CZ-14中被替换为β-methylbutyryl。双键的构型同样通过氢谱耦合常数δH 5.57(dq,J＝15.8,1.0),5.75(d,J＝15.9),6.16(dd,J＝15.9,6.6),6.32(dq,J＝15.8,6.9)判断为2E,8E。因此CZ-14的结构推定为(2E,8E)-12-β-methylbutyryltetradeca-2,8-dien-4,6-diyne-1,14-diol。
CZ-16，黄色油状，[α]20 D-30(c 0.1,MeOH)。高分辨质谱显示离子峰267.0988[M+Na]+，提示其分子式为C15H16O3。其特征的红外及紫外吸收峰提示化合物类型为多烯炔类。比较CZ-16和BCZ-18发现二者的区别仅在于12位有无羟基。CZ-16中羟基的位置通过H-8(δH5.73)/H-9(δH 6.99)/H-10(δH 6.18)/H-11(δH 5.50)/H-12(δH 4.80)/H2-13(δH 4.10,4.03)的COSY信号推断位于C-12。双键的构型通过耦合常数δH 6.99,(dd,J＝15.5,11.6,H-9)，6.33(dd,J＝15.8,6.8,H-2)，6.18(d,J＝11.4,H-10)，5.73(d,J＝15.5,H-8)，5.58(d,J＝15.8,H-3)推测为2E,8E,10Z。因此化合物CZ-16的结构推定为为(2E,8E,10Z)-13-acetoxytrideca-2,8,10-trien-4,6-diyne-12-ol。
CZ-17，黄色油状，[α]20 D+28(c 0.1,MeOH)。高分辨质谱显示离子峰309.1459[M+Na]+，提示其分子式为C18H22O3。对比CZ-17和CZ-16的核磁谱图，发现二者的区别在于C-13取代基的类型，一个β-methylbutyryl的核磁信号(δC 173.3,43.4,25.8,22.6×2)取代了CZ-16中乙酰基信号。该取代基的位置通过HMBC谱中H2-13(δH 4.13,4.05)与C-1’(δC 173.3)以及COSY谱中H-8(δH 5.74)/H-9(δH 7.01)/H-10(δH 6.19)/H-11(δH 5.51)/H-12(δH 4.81)/H2-13的相关加以佐证。双键的构型同样通过氢谱耦合常数推断，δH 7.01(d,J＝15.5,7.4,H-9)，6.34,(dd,J＝15.8,6.9,H-2)，6.19(t,J＝11.0,H-10)，5.74(d,J＝15.5,H-10)，5.59(dd,J＝15.8,1.9,H-3)，5.51(dd,J＝11.0,8.3,H-11)提示了2E,8E,10Z的构型。因此，化合物CZ-17的结构推定为(2E,8E,10Z)-13-β-methylbutyryltrideca-2,8,10-trien-4,6-diyne-12-ol。
CZ-19，棕色无定型粉末，
高分辨质谱显示加钠离子峰m/z 367.1154[M+Na]+，提示该化合物分子式为C19H20O6。CZ-19的特征紫外吸收λmax(logε)203,214,254,268,284nm结合红外吸收指示其为丁二炔和一个双键共轭的多烯炔类化合物。碳谱中δC 170.5,170.1,169.6,21.1,20.9,20.9的信号提示了三个乙酰基的存在，位置分别通过HMBC谱中H2-1(δH 4.63)和C-1′，H-8(δH 5.62)和C-2′，H-9(δH 5.96)和C-3′的相关信号确定。COSY中的相关信号提示存在两个自旋耦合系统H2-1/H-2(δH 6.34)/H-3(δH 5.76)和H-8/H-9/H-10(δH 5.43)/H-11(δH 6.26)/H-12(δH 6.71)/H2-13(δH 5.32)。双键构型通过氢谱中耦合常数信息δH 6.34(dt,J＝16.0,5.6),5.76(d,J＝16.0),5.43(t,J＝11.1),6.26(t,J＝11.1)推断为2E,10Z。8,9位乙酰基的相对构型同样通过3JHH耦合常数(J8,9＝4.2)判断。链状邻二醇片段在氘代氯仿中，其苏式构型的3JHH耦合常数(大于6.0Hz)略大于赤式构型的3JHH耦合常数(小于5.0Hz)，根据该经验公式可判断8,9位为赤式构型。综上所述，化合物CZ-19的结构确定为erythro-(2E,10E)-1,8,9-triacetoxytrideca-2,10,12-trien-4,6-diyne-1,14-diol。
新化合物CZ-5，CZ-6，CZ-9，CZ-13，CZ-14，CZ-16，CZ-17，CZ-19的1H-1H
相关谱和
相关谱详见图2。
实施例3
本实施例提供一种防治骨质疏松的注射液，其通过如下过程制备得到：按实施例1、2的方法先制得化合物CZ-1～CZ-19，按常规方法加注射用水和吐温80，精滤、灌封、灭菌制成注射液。
实施例4
本实施例提供一种防治骨质疏松的粉针剂，其通过如下过程制备得到：按实施例1、2的方法先制得式化合物CZ-1～CZ-19，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶解，用无菌抽滤漏斗过滤。再无菌精滤分装于安瓿中，低温冷冻干燥后，无菌熔封得粉针剂。
实施例5
本实施例提供一种防治骨质疏松的片剂，其通过如下过程制备得到：按实施例1、2的方法先制得式化合物CZ-1～CZ-19，按其与赋形剂(如淀粉浆)重量比为5:1的比例加入赋形剂制粒压片。
实施例6
本实施例提供一种防治骨质疏松的胶囊，其通过如下过程制备得到：按实施例1、2的方法先制得式化合物CZ-1～CZ-19，按其与赋形剂(如聚乙二醇400)重量比为5:1的比例加入赋形剂制成胶囊。
实施例7
本实施例提供一种防治骨质疏松的胶囊，其通过如下过程制备得到：按实施例1、2的方法先制得式化合物CZ-1～CZ-19，按其与赋形剂(如吐温80)重量比为3:1的比例加入赋形剂制成胶囊。
实施例8
本实施例为化合物CZ-1～CZ-19的抗骨质疏松活性评价。
一、细胞培养
本实验所用到的两种细胞为：小鼠原代骨髓巨噬细胞(Bone MarrowMacrophages,BMM)和RAW 264.7单核巨噬细胞。
(1)BMM细胞的分离培养：取8周龄的雌性C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，浸泡于75％乙醇消毒10min。消毒后转移至超净台中解剖，分离双后肢胫骨和股骨，剪去多余的肌肉组织，使用含1％双抗的α-MEM培养基浸泡5min。剪开骨骼两端关节，置于含10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和1％双抗的α-MEM完全培养基中。用注射器吹出骨髓细胞，用直径40μM的细胞过滤器过滤骨髓细胞。将细胞悬液转移至离心管，1000rpm转速离心10min，去除上清。用含有10％PBS和25ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)的α-MEM培养液中重悬细胞并接种至培养皿。待细胞贴壁24小时后，弃去上清中未贴壁细胞，使用新的α-MEM培养基将培养皿底部细胞吹打脱落，转移至离心管，1000rpm速率离心10min，收集离心管底部的BMM细胞进行铺板。
(2)RAW 264.7细胞的培养与传代：RAW 264.7细胞为本实验室前期保存。复苏细胞后，培养于含1％双抗和10％FBS的α-MEM培养基中。当细胞生长至融合度为90％左右时进行传代，吸除原有培养基，将细胞吹下，以1:4比例进行传代。所有细胞均置于5％CO2的37℃恒温培养箱放置。
二、CCK8法评价细胞毒性
(1)将BMM细胞悬液调整为大约50000个/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，细胞密度为5000个/孔；待细胞贴壁后继续培养12h。
(2)将旧培养基更换成化合物终浓度为10μM的含药培养基；设置3个复孔，设置对照组和调零孔继续培养48h。
(3)弃去旧培养基并更换成100μL无血清培养基；避光操作，每孔加入10μL CCK-8溶液，置于培养箱中孵育2小时。
(4)取出培养板于450nm波长下测量吸光度值，根据各孔的吸光度计算细胞活力，计算方法如下：
化合物CZ-1～CZ-19的对BMM细胞的毒性测定结果如图3(A)所示。
三、破骨细胞分化及TRAcP染色实验
(1)将BMM细胞悬液调整为50000个/mL，接种于96孔细胞板中，每孔100μL，细胞密度为5000个/孔；待细胞贴壁后，继续培养12h。
(2)用完全培养基配置待测化合物，将旧培养基更换成化合物终浓度为0.03、0.1、0.3、1、3、10μM的含药培养基；设置3个复孔，设置对照组和调零孔。模型组和给药组用50ng/mL的RANKL刺激破骨细胞的分化，每隔一天更换一次培养基，直至4～5天后在显微镜下观察到形成明显的破骨细胞。
(3)TRAcP染色。
固定：弃去96孔板中培养基，每孔中加入35μL4％多聚甲醛，室温固定细胞2小时。
洗板：弃去多聚甲醛，用100μL ddH2O洗涤三次。
染色：每孔加入35μLTRAcP染液，于37℃孵育1小时。
观察：显微镜下随机选择5个视野/每孔，计数成熟破骨细胞。光学显微镜下被染为紫红色且细胞核数大于3的可视作破骨细胞。
化合物CZ-1～CZ-19在10μM浓度下对破骨细胞分化的抑制结果如图3(B)所示。
化合物CZ-1～CZ-19在3μM浓度下对破骨细胞分化的抑制结果如图3(C)所示。
CZ-1,CZ-2，CZ-15的TRAcP染色实验结果如图3(D)所示。
四、统计学方法
采用GraphPad Prism 7.0进行数据分析，统计结果用均值(mean)±标准差(SD)表示。采用单因素方差分析比较组间差异(Bonferroni检验)。p<0.05或<0.01被认为具有统计学意义。图3的(A)(B)和(C)中，＊表示p<0.05，＊＊表示p<0.01。
图3(A)结果表明，19个化合物在10μM下均未显示细胞毒性。
图3(B)的结果表明，在10μM下，化合物CZ-1、CZ-2、CZ-3、CZ-5、CZ-6、CZ-9、CZ-11、CZ-13、CZ-15、CZ-17、CZ-18、CZ-19对BMM细胞都有较为显著的抑制分化作用。
图3(C)的结果表明，在3μM下，CZ-1、CZ-2、CZ-3、CZ-9、CZ-11、CZ-15、CZ-18对BMM细胞都有较为显著的抑制分化作用。
图3(D)的结果表明，CZ-1,CZ-2和CZ-15可以剂量依赖地抑制破骨细胞分化。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种多烯炔类化合物，其特征在于，具有如式(Ⅰ)～(Ⅴ)任一所示的结构：
式(Ⅱ)中，R1为β-OH，R2为α-OH、α-OAc或β-OAc；或R1为β-OAc，R2为α-OH；
式(Ⅲ)中，R3为OA，R4为β-OB、OH或OAc，R5为OH或H；或R3为OH，R4为β-OB、OH或OAc，R5为OH；或R3为OH，R4为β-OB或OH，R5为H；或R3为OAc，R4为β-OB，R5为OH或H；或R3为OAc，R4为OH，R5为OH；
式(Ⅳ)中，R6为OH或H，R7为OA；
其中，OA中的
OB中的
2.根据权利要求1所述的多烯炔类化合物，其特征在于，式(Ⅱ)中，R1为β-OH，R2为α-OH。
3.根据权利要求1所述的多烯炔类化合物，其特征在于，式(Ⅲ)中，R3为OA，R4为OAc，R5为H；或R3为OAc，R4为β-OB，R5为OH。
4.根据权利要求1所述的多烯炔类化合物，其特征在于，式(Ⅴ)中，R6为OH，R7为OA。
5.根据权利要求1～4任一所述的多烯炔类化合物，其特征在于，所述的多烯炔类化合物的结构式如下：
6.权利要求1所述多烯炔类化合物的制备方法，其特征在于，所述式(Ⅰ)、式(Ⅲ)和式(Ⅴ)多烯炔类化合物的制备方法包括如下步骤：
S11.将茅苍术的根茎干燥，粉碎，浸提并减压浓缩得粗浸膏；
S12.将粗浸膏混悬，萃取，减压浓缩，经色谱柱洗脱，再经层析、高效液相色谱分离后，即得所述式(Ⅰ)、式(Ⅲ)和式(Ⅳ)多烯炔类化合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S12中所述洗脱的洗脱液为石油醚/乙酸乙酯混合溶液；洗脱的梯度为：石油醚/乙酸乙酯的体积比为0→40min：1:0→20:1，40→80min：20:1→5:1，80→120min：5:1→2:1，120→160min：2:1→1:1，160→200min：1:1→0:1。
8.权利要求1所述多烯炔类化合物的制备方法，其特征在于，所述式(Ⅱ)、式(Ⅲ)和式(Ⅳ)多烯炔类化合物的制备方法包括如下步骤：
S21.将北苍术的根茎干燥，粉碎，浸提并减压浓缩得粗浸膏；
S22.将粗浸膏混悬，萃取，减压浓缩，经色谱柱洗脱，再经层析、高效液相色谱分离后，即得所述式(Ⅱ)、式(Ⅲ)和式(Ⅳ)多烯炔类化合物。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤S22中所述洗脱的洗脱液为石油醚/乙酸乙酯混合溶液；洗脱的梯度为：石油醚/乙酸乙酯的体积比为0→40min：1:0→20:1，40→80min：20:1→5:1，80→120min：5:1→2:1，120→160min：2:1→1:1，160→200min：1:1→0:1。
10.权利要求1～5任一所述多烯炔类化合物在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的应用。
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