CN114344322B

CN114344322B - Elfn1-as1反义寡核苷酸在制备治疗奥沙利铂耐药结肠癌药物中的应用

Info

Publication number: CN114344322B
Application number: CN202210020084.XA
Authority: CN
Inventors: 殷刚; 刘佳鑫; 曙光; 李医民; 甘亚琦
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2022-01-10
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2042-01-10
Also published as: CN114344322A

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及LncRNA ELFN1‑AS1反义寡核苷酸在制备治疗奥沙利铂耐药结肠癌药物中的应用。本发明通过构建结直肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT116/L‑OHP，采用LncRNA ELFN1‑AS1反义寡核苷酸ASO与奥沙利铂联合干预结直肠癌耐奥沙利铂细胞，能够使得耐药细胞对奥沙利铂敏感，促进细胞凋亡，动物实验进一步证明LncRNA ELFN1‑AS1反义寡核苷酸ASO与奥沙利铂联用能够有效抑制肿瘤生长，并恢复奥沙利铂耐药的CRC肿瘤对奥沙利铂的敏感。

Description

ELFN1-AS1反义寡核苷酸在制备治疗奥沙利铂耐药结肠癌药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及ELFN1-AS1反义寡核苷酸在制备治疗奥沙利铂耐药结肠癌药物中的应用。

背景技术

结直肠癌是从结肠或者直肠上皮组织演变而来的一种恶性肿瘤，它是全球最常见的恶性肿瘤之一。预估到2030年，全球结直肠癌的负担将增加60％，新发病例达到220多万，癌症死亡病例达到110万。近些年，随着新的有效的抗癌药物的不断研发，结直肠癌患者的死亡率有所降低，但其五年生存率依旧很低。

目前，结直肠癌患者常用的治疗包括了手术、放射、化学、免疫以及生物分子靶向等手段。手术切除结合标准辅助化疗策略，例如5-氟尿嘧啶，亚叶酸钙和奥沙利铂(FOLFOX)联合化疗方案，仍然是CRC患者的最受欢迎的治疗方法，并且这种治疗手段能够显著改善患者的无病生存期以及总体生存期。奥沙利铂作为第三代铂类药物，已经被广泛用于治疗结直肠癌患者治疗的一线化疗药物。奥沙利铂的主要作用机制是其构成的链内交联可以阻断DNA的复制以及转录过程，从而导致细胞毒性损害，并且能够直接参与癌细胞的死亡。它还能够诱导免疫原性细胞死亡，进而来发挥其抗肿瘤作用。但不幸的是，化疗药物的耐受性是造成治疗失败以及肿瘤复发的主要原因，大约50％的结直肠癌患者对以奥沙利铂为基础的化疗会产生耐药性，这就使得治疗结直肠癌潜在着巨大的挑战。

目前，社会科学技术研究的不断进步与发展，人们已经发现了lncRNAs 在癌症中的失调以及其各种生物学功能，如调节上皮向间充质转化(EMT)、血管生成、肿瘤的侵袭和转移。另外，大量的研究发现，LncRNA广泛地参与了化疗药物耐药性的形成。并且，LncRNA也能够作为抗肿瘤潜在的治疗靶标，通过使用小干扰RNA(siRNA)和反义寡核苷酸(ASO)，干扰LncRNA的表达与功能，从而改善抗肿瘤的治疗效果，目前，美国食品药品监督管理局(FDA) 仅批准了五种ASO药物(其中包括fomivirsen，mipomersen，eteplirsen，nusinersen，inotsersen)。ASO LY2275796靶向包括结直肠癌在内的实体瘤中的癌基因eIF-4E，但是在LY2275796的1期剂量递增，药代动力学和药效学研究中，elF-4E表达降低，却未观察到肿瘤反应。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明通过体内外实验探究了奥沙利铂、LncRNA ELFN1-AS1的反义寡核苷酸ASO以及两者联合应用对结肠癌耐药细胞的生物行为影响，发现ASO与奥沙利铂联合治疗，能够明显的促进耐药细胞对奥沙利铂的敏感，促进细胞凋亡，并且抑制小鼠肿瘤生长。

基于上述发现，本发明的目的在于提供了ELFN1-AS1反义寡核苷酸在制备治疗奥沙利铂耐药结肠癌药物中的应用，所述ELFN1-AS1反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示，所述SEQ ID NO：1序列为： CATTCACTCCGAGACGCAGC。

ELFN1-AS1反义寡核苷酸在逆转奥沙利铂耐药细胞耐受性中的应用，所述ELFN1-AS1反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示。

一种治疗奥沙利铂耐药结肠癌的药物组合物，所述药物组合物包含 ELFN1-AS1反义寡核苷酸和奥沙利铂，所述ELFN1-AS1反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、辅剂和媒介物中的至少一种。

有益效果：

本发明构建结直肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT116/L-OHP，采用ELFN1-AS1 反义寡核苷酸ASO与奥沙利铂联合干预结直肠癌耐奥沙利铂细胞，能够使得耐药细胞对奥沙利铂敏感，促进细胞凋亡，动物实验进一步证明ASO与奥沙利铂联用能够有效抑制肿瘤生长，并恢复奥沙利铂耐药的CRC肿瘤对奥沙利铂的敏感，这为在制备结直肠癌奥沙利铂耐药患者药物时，研发新的且有效的靶向药物治疗提供相关理论基础以及实验依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的不同组别的CCK8检测的细胞活力结果和各组的IC50值；

图2为本发明实施例提供的不同组别的细胞凋亡数据分析图；

图3为本发明实施例提供的不同组别体内实验数据，(a)不同组肿瘤体积大小实物图，(b)不同组小鼠体重的变化数据图，(c)不同组最终肿瘤体重数据图；(d)不同组肿瘤体积随时间变化图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

在本发明实施例中，ELFN1-AS1反义寡核苷酸ASO购买于广州市锐博生物科技有限公司，配置为：先将5nmolASO(冻干粉)瞬时离心，然后溶解于 250μl无酶水配置成20μM储存液，分装并贮存于-20℃冰箱，避免反复冻融。

实验细胞来源：人结直肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT116/L-OHP从上海美轩生物科技有限公司购买，在含有25μM奥沙利铂的RPMI-1640培养基中维持稳态。

实验动物来源：BALB/C裸鼠购买于中南大学实验动物学部，SPF级。

CCK8检测细胞活力

贴壁细胞消化后以5000个/孔的密度接种在96孔板中。待24小时细胞贴壁后移除培养基，我们采用CCK8实验来检测奥沙利铂(0μM、0.8μM、1.6 μM、3.2μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM)作用下每组细胞的活性变化，分四组进行对比，分别为DMSO组(100μl, 0.1％DMSO的完全培养基)，10μM奥沙利铂组(100μl,含10μM的完全培养基)，10μMASO组(100μl,含10μM的完全培养基)以及10μM奥沙利铂联合10μMASO组(100μl,奥沙利铂与ASO各含10μM的完全培养基)，并置于培养箱中。连续培养48小时后每孔添加10μl CCK8溶液，培养箱中孵育2小时后用酶标仪检测450nm处的吸光度值，并通过吸光度计算不同处理下细胞相对于对照组的细胞活力。如图1所示，与对照组相比，单独使用奥沙利铂组的细胞活性变化差异并不明显，而在单独使用ASO后，HCT116/L-OHP 对奥沙利铂的耐药性呈一定程度的下降趋势。当奥沙利铂与ASO联合使用时，细胞活力相比于单独使用ASO进一步降低，表明ASO能够有效逆转耐药细胞对奥沙利铂的耐受性；各组施用奥沙利铂的IC50值分别为：53.32μM，49.67 μM，22.24μM，6.67μM。

细胞凋亡实验

通过流式细胞术检测了在奥沙利铂作用下各组细胞(DMSO组(2ml, 0.1％DMSO的完全培养基)，10μM奥沙利铂组(2ml,含10μM的完全培养基)， 10μMASO组(2ml,含10μM的完全培养基)以及10μM奥沙利铂联合10 μMASO组(2ml,奥沙利铂与ASO各含10μM的完全培养基))的细胞凋亡水平。结果如图2所示，单独使用ASO处理后的细胞，其凋亡细胞百分比为27.42％，单独使用奥沙利铂处理细胞后，其凋亡细胞百分比为10.92％，而联合使用ASO和奥沙利铂处理细胞后，其凋亡细胞百分比为61.7％，较对照处理组的细胞其凋亡细胞百分比为7.7％。ASO以及奥沙利铂对于耐药细胞能够产生一定的凋亡作用，但单独使用奥沙利铂组对耐药细胞的凋亡作用差异并不显著，而联合ASO和奥沙利铂用药组能够有效地使细胞凋亡水平显著增高。

体内实验

实验动物为4周的雄性裸鼠。将培养在培养瓶中的HCT116/L-OHP细胞用胰蛋白酶消化为分散细胞后，计数3×106个细胞并离心收集于100μL RPMI 1640中。收集的细胞于小鼠腋下皮下注射种瘤。当肿瘤体积达到 100-150mm³时分为四组：对照组(0.1％DMSO(PBS)，100μl，一周两次)，奥沙利铂(10mg/kg腹腔注射，100μl，一周一次)，ASO(瘤内注射，10nM，100 μl，一周两次)，奥沙利铂(10mg/kg腹腔注射，100μl，一周一次)+ASO(瘤内注射，10nM，100μl，一周两次)，测量肿瘤大小(肿瘤体积＝0.5×长×宽²)，从给药第一天算起第28天后将肿瘤剥离，如图所示，与体外实验结果一致，与对照治疗相比，单独使用奥沙利铂对肿瘤生长没有影响。相反，与对照组相比，ASO治疗显着减少了肿瘤体积，并且ASO与奥沙利铂的联用进一步阻止了肿瘤生长，表明ASO与奥沙利铂联用能够有效抑制肿瘤生长，并恢复奥沙利铂耐药的CRC肿瘤对奥沙利铂的敏感。而且，我们从小鼠体重观察发现联合用药并不会对机体产生毒副作用，体重略微还有所上升。

由上述实验和结果可知，使用ASO与奥沙利铂联合干预结直肠癌耐奥沙利铂细胞，能够使得耐药细胞对奥沙利铂敏感，促进细胞凋亡，动物实验进一步证明ASO与奥沙利铂联用能够有效抑制肿瘤生长，并恢复奥沙利铂耐药的 CRC肿瘤对奥沙利铂的敏感。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中南大学

<120> ELFN1-AS1反义寡核苷酸在制备治疗奥沙利铂耐药结肠癌药物中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

cattcactcc gagacgcagc 20

Claims

1.ELFN1-AS1反义寡核苷酸在制备治疗奥沙利铂耐药结肠癌药物中的应用，所述ELFN1-AS1反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种治疗奥沙利铂耐药结肠癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含ELFN1-AS1反义寡核苷酸和奥沙利铂，所述奥沙利铂与ELFN1-AS1反义寡核苷酸的摩尔比为1:1；所述ELFN1-AS1反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求2所述治疗奥沙利铂耐药结肠癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、辅剂和媒介物中的至少一种。