CN114324618A

CN114324618A - 分离检测左亚叶酸钙中间体及相关物质的方法

Info

Publication number: CN114324618A
Application number: CN202011032471.2A
Authority: CN
Inventors: 陈雯; 余智奎; 周书荣; 兰昌云; 刘阔
Original assignee: Chongqing Huapont Pharm Co Ltd
Current assignee: Chongqing Huapont Pharm Co Ltd
Priority date: 2020-09-27
Filing date: 2020-09-27
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种高效液相色谱法分离检测左亚叶酸钙中间体及相关物质的方法，该方法采用的色谱柱是以辛烷基键合硅胶为填料，采用乙酸铵缓冲溶液和有机溶液进行梯度洗脱，将左亚叶酸钙中间体及相关物质进行分离，通入检测器进行检测；相关物质为杂质A、杂质C、杂质G、对甲苯磺酸、杂质Z1b、杂质Z1d‑1、杂质Z1d‑2、杂质SM1f、杂质SM1g、杂质SM1i、杂质SM1j；流动相流速为0.8～1.2ml/min；色谱柱柱温为35～45℃；检测器波长为280±10nm；该方法能同时对左亚叶酸钙中间体及11个物质进行检测，本品中对甲苯磺酸对杂质检测没有干扰，用面积归一化法即可进行计算，方法简单、快速、有效。

Description

分离检测左亚叶酸钙中间体及相关物质的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种HPLC法分离检测左亚叶酸钙中间体及相关物质的方法。

背景技术

左亚叶酸钙，分子式为C20H21CaN7O7，目前注射用左亚叶酸钙主要用于治疗胃癌和结直肠癌。在制备左亚叶酸钙时存在中间体：(2S)-2-[4-[[[(6S)-2-氨基-4-氧代-1,4,5,6,7,8-六氢蝶啶-6-基]甲基]氨基]苯甲酰胺基]戊二酸对甲苯磺酸盐，分子式为C26H31N7O9S，分子量为617.63，结构式为：

并且，在制备左亚叶酸钙中间体中还可能存在11种相关物质；而目前相关技术方案如中国专利CN201210294425.9中有公开一种左亚叶酸钙的高效液相色谱分析法，具体是以十八烷基硅烷键合硅胶(250×4.0mm，5μm)为填充剂，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以磷酸盐缓冲液-甲醇(40∶60)为流动相B，梯度洗脱；取左亚叶酸钙或左亚叶酸钙制剂，加水制成含左亚叶酸钙1mg/ml的溶液，作为供试品溶液，并用水稀释制成每1ml中约含0.01mg的溶液，作为对照溶液，可以分析检测左亚叶酸钙和其他相关的四种杂质；但按照该方法并不能全面检测本申请中左亚叶酸钙中间体及相关物质，不适用于左亚叶酸钙质量的控制。

发明内容

有鉴于此，本发明目的之一是提供一种分离左亚叶酸钙中间体及相关物质的方法，该方法可有效分离左亚叶酸钙中间体及11种相关物质。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

分离左亚叶酸钙中间体及相关物质的方法，其特征在于，所述方法采用的色谱柱是以辛烷基键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，将所述左亚叶酸钙中间体及相关物质进行分离；所述相关物质为杂质A、杂质C、杂质G、对甲苯磺酸、杂质Z1b、杂质Z1d-1、杂质Z1d-2、杂质SM1f、杂质SM1g、杂质SM1i、杂质SM1j中的一种或多种；所述杂质Z1d-1、杂质Z1d-2为一对异构体；所述流动相A为乙酸铵缓冲溶液；所述流动相B为有机溶液；所述左亚叶酸钙中间体及相关物质结构式如下：

进一步，所述乙酸铵缓冲溶液浓度为0.015～0.025mol/L；

具体的，所述乙酸铵缓冲溶液pH为3.3～4.0，使用醋酸进行pH调节；

进一步，所述有机溶液为甲醇、乙醇、乙腈中的一种或多种；

进一步，所述梯度洗脱程序为：

时间/分钟	流动相A/％	流动相B/％
			0	93～97	3～7
5	93～97	3～7
			20	80～90	10～20
30	70～80	20～30
			35	50～60	40～50
36	93～97	3～7
			45	93～97	3～7

；

进一步，所述方法流动相流速为0.8～1.2ml/min；

进一步，所述方法色谱柱柱温为35～45℃。

本发明目的之二是提供一种HPLC法鉴定检测物中是否存在左亚叶酸钙中间体及相关物质的方法，该方法可以有效监测检测物中是否存在左亚叶酸钙中间体及相关物质。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

鉴定左亚叶酸钙中间体及相关物质的方法，利用目的一中所述方法将检测物中所述左亚叶酸钙中间体及相关物质进行分离，通入检测器进行检测，将检测得到的色谱图与已知对照品色谱图进行对比，判定检测物中是否含有所述左亚叶酸钙中间体及相关物质；所述检测器波长设定为280±10nm。

本发明目的之三是提供一种HPLC法测定左亚叶酸钙中间体及相关物质含量的方法，该方法可以准确测定左亚叶酸钙中间体及相关物质的含量。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

测定左亚叶酸钙中间体及相关物质含量的方法，所述方法具体包含以下步骤：

1)配制检测品溶液、对照品溶液；

取供检测品溶于稀释剂中，得检测品溶液；取所述相关物质标准品，用稀释剂溶解制成对照品溶液；

2)分离；

利用目的一中所述的方法，将所述左亚叶酸钙中间体及相关物质进行分离；

3)鉴定；

利用目的二中所述的方法，鉴定所述左亚叶酸钙中间体及相关物质；

4)含量计算；

根据鉴定过程中得到的色谱图，根据峰面积，按峰面积归一化法计算检测品溶液中所述左亚叶酸钙中间体及相关物质的含量；

进一步，所述步骤1)中稀释剂为0.025mol/L磷酸钠和10g/L抗坏血酸的混合溶液；

具体的，所述稀释剂pH为7.0，使用磷酸或氢氧化钠进行调节。

本发明目的之四是提供一种评价左亚叶酸钙中间体质量的方法，该方法可以准确测定左亚叶酸钙中间体及相关物质的含量。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

评价左亚叶酸钙中间体质量的方法，利用目的三中所述方法测定所述左亚叶酸钙中所述相关物质的质量百分比或所述左亚叶酸钙中间体的质量百分比，与规定的合格标准进行对比，判定所述左亚叶酸钙中间体的质量。

本发明的有益效果在于：左亚叶酸钙中间体(二氢叶酸对甲苯磺酸盐)，二氢叶酸不稳定，在液相系统中会出现降解平台峰，采用辛烷基键合硅胶为分离色谱柱，乙酸铵-甲醇流动相洗脱系统，二氢叶酸与其杂质保留时间适中，峰型对称，各杂质间分离度均能满足要求，能同时对本品及11个物质进行检测，本品中对甲苯磺酸对杂质检测没有干扰，用面积归一化法即可进行计算，方法简单、快速、有效。

附图说明

图1：本方法的HPLC色谱图；

图2：左亚叶酸钙中间体Z1、杂质A、杂质Z1b、杂质C、杂质G检测限HPLC图；

图3：杂质SM1f、杂质SM1g、杂质SM1i、杂质SM1j检测限HPLC图；

图4：耐用性-正常条件-混合溶液HPLC图；

图5：耐用性-流动相A(pH＝3.4)-混合溶液HPLC图；

图6：耐用性-流动相A(pH＝3.6)-混合溶液HPLC图；

图7：耐用性-流速1.1ml/min-混合溶液HPLC图；

图8：耐用性-流速0.9ml/min-混合溶液HPLC图；

图9：耐用性-柱温42℃-混合溶液HPLC图；

图10：耐用性-柱温38℃-混合溶液HPLC图；

图11：耐用性-梯度初始比例(流动相B相为5.5％)-混合溶液HPLC图；

图12：耐用性-梯度初始比例(流动相B相为4.5％)-混合溶液HPLC图；

图13：耐用性-不同批次色谱柱-混合溶液HPLC图。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

主要仪器：岛津LC-20A高效液相色谱仪。

流动相：

流动相A：0.015mol/L～0.025mol/L乙酸铵缓冲溶液(取乙酸铵加水1000ml使溶解，用醋酸调节pH至3.3～4.0)；

流动相B：甲醇；

梯度洗脱程序(表1)：

表1梯度洗脱程序

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	93-97	3-7
5	93-97	3-7
			20	80-90	10-20
30	70-80	20-30
			35	50-60	40-50
36	93-97	3-7
			45	93-97	3-7

色谱柱：辛烷基键合硅胶，Agilent SB-C8 4.6mm×250mm，5μm；

流速：0.8～1.2ml/min；

检测波长：280nm；

柱温：35～45℃；

稀释剂：0.025mol/L磷酸钠(含10g/L抗坏血酸)，用磷酸或氢氧化钠调pH为7.0(当日使用，避光保存)；

进样体积：20μl；

供试品溶液：0.2mg/ml；

定量方法：峰面积归一化法。

实施例2

溶液配制：

避光操作

供试品溶液：避光操作，临用新配。取本品适量，精密称定，加稀释剂(取磷酸钠十二水合物9.5g和抗坏血酸10g，加水1000ml使溶解，用磷酸或氢氧化钠试液调节pH至7.0)溶解并稀释制成每1ml中约含0.2mg的溶液，摇匀，即得。

系统适用性溶液：取左亚叶酸钙中间体、杂质A、杂质C、杂质G、杂质Z1d、杂质Z1b、杂质SM1f、杂质SM1g、杂质SM1i、杂质SM1j对照品适量，用稀释剂使溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质2μg及左亚叶酸钙中间体0.2mg的溶液。

实施例3

测试方法：

精密量取系统适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序为杂质A、对甲苯磺酸、本品主成分、杂质Z1d-1、杂质Z1d-2、杂质Z1b、杂质SM1f、杂质C、杂质G、杂质SM1g、杂质SM1i、杂质SM1j，杂质C和杂质G之间的分离度应符合要求。

精密量取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，除溶剂峰(保留时间5分钟以前不积分)与梯度洗脱峰外，按峰面积归一化法计算各杂质含量(见附图1)。

实施例4

专属性：

稀释剂：0.025mol/L磷酸钠，含10g/L维生素C，磷酸或氢氧化钠调pH为7.0。

杂质A定位溶液：精密称取杂质A 2.28mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质A储备溶液；再移取0.5ml至10ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质C定位溶液：精密称取杂质C 2.20mg，置25ml量瓶中，加28.6g/L碳酸钠水溶液2.0ml溶解，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质C储备溶液；再移取0.5ml至10ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质G定位溶液：精密称取杂质G 2.43mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质G储备溶液；再移取0.5ml至10ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质SM1f定位溶液：精密称取杂质SM1f 2.49mg，置25ml量瓶中，加28.6g/L碳酸钠水溶液2.0ml溶解，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质SM1f储备溶液；再移取0.5ml至10ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质SM1g定位溶液：精密称取杂质SM1g 2.26mg，置25ml量瓶中，加28.6g/L碳酸钠水溶液2.0ml溶解，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质SM1g储备溶液；再移取0.5ml至10ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质SM1i定位溶液：精密称取杂质SM1i 2.36mg，置25ml量瓶中，加28.6g/L碳酸钠水溶液2.0ml溶解，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质SM1i储备溶液；再移取0.5ml至10ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质SM1j定位溶液：精密称取杂质SM1j 2.55mg，置25ml量瓶中，加28.6g/L碳酸钠水溶液2.0ml溶解，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质SM1j储备溶液；再移取0.5ml至10ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质Z1b定位溶液：精密称取杂质Z1b 2.13mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质Z1b储备溶液；再移取0.5ml至10ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质Z1d定位溶液：精密称取杂质Z1d 3.25mg，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质Z1d储备溶液；再移取1.0ml至10ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

对甲苯磺酸定位溶液：精密称取对甲苯磺酸10.05mg，置100ml量瓶中加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质对甲苯磺酸储备溶液；再移取1.0ml至10ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：精密称取左亚叶酸钙中间体Z1约20mg，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

混合溶液：精密称取左亚叶酸钙中间体Z1 11.00mg，置50ml量瓶中，精密移取杂质Z1d及对甲苯磺酸储备溶液各1.0ml，精密移取杂质A、杂质C、杂质G、杂质SM1f、杂质SM1g、杂质SM1j、杂质SM1i、杂质Z1b储备溶液各0.5ml，置上述同一量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

分别取空白稀释剂、供试品溶液、混合溶液、各杂质定位溶液各20μl，依法进样，结构数据见表2。

表2专属性试验测定结果

检测限：

A-C-G杂质储备液：精密称取2.100mg杂质A、2.099mg杂质C、2.192mg杂质G置同一250ml量瓶中，加稀释剂溶解后稀释至刻度，摇匀，作为A-C-G杂质储备液。

Z1b-Z1杂质储备液：精密称取2.254mg杂质Z1b、2.294mg中间体Z1置同一100ml量瓶中，加稀释剂溶解后稀释至刻度，摇匀，作为Z1b-Z1杂质储备液。

检测限溶液(A-C-G-Z1b-Z1)：精密称取A-C-G杂质储备液及Z1b-Z1杂质储备液各0.5ml置同一100ml量瓶中，加稀释剂超声溶解后稀释至刻度，摇匀，即得。

检测限溶液(SM1f-SM1g-SM1i-SM1j)：精密称取2.114mg杂质SM1g、1.948mg杂质SM1f、1.306mg杂质SM1j、2.499mg杂质SM1i置同一250ml量瓶中，加稀释剂溶解后稀释至刻度，摇匀，再移取0.5ml上述溶液至100ml量瓶中，加稀释剂超声溶解后稀释至刻度，摇匀，即得。

测定方法：分别取上述检测限溶液连续进样，记录色谱图(附图2-3、表3)，计算目标峰峰高与基线噪声的比值(信噪比)。

表3检测限测定结果

耐用性

取混合溶液(配制方法同专属性项下混合溶液)，分别使用正常流动相，预定测试的不同流动相初始比例、不同流动相pH、不同柱温、不同柱流速以及同型号不同批次色谱柱进行测试，记录各峰间的分离度、相对保留时间(见附图4-13，表4、5)。

表4色谱条件变化耐用性试验测定结果(相对保留时间)

表5色谱条件变化耐用性试验测定结果(分离度)

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.分离左亚叶酸钙中间体及相关物质的方法，其特征在于，所述方法采用的色谱柱是以辛烷基键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，将所述左亚叶酸钙中间体及相关物质进行分离；所述流动相A为乙酸铵缓冲溶液；所述流动相B为有机溶液；所述相关物质为杂质A、杂质C、杂质G、对甲苯磺酸、杂质Z1b、杂质Z1d-1、杂质Z1d-2、杂质SM1f、杂质SM1g、杂质SM1i、杂质SM1j中的一种或多种；杂质Z1d-1、杂质Z1d-2为一对异构体，所述左亚叶酸钙中间体及相关物质结构式如下：

2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述乙酸铵缓冲溶液浓度为0.015～0.025mol/L。

3.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于，所述乙酸铵缓冲溶液pH为3.3～4.0，使用醋酸进行pH调节。

4.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述有机溶液为甲醇、乙醇、乙腈中的一种或多种。

5.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：

时间/分钟流动相A/％流动相B/％ 0 93～97 3～7 5 93～97 3～7 20 80～90 10～20 30 70～80 20～30 35 50～60 40～50 36 93～97 3～7 45 93～97 3～7

。

6.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述方法流动相流速为0.8～1.2ml/min；色谱柱柱温为35～45℃。

7.鉴定左亚叶酸钙中间体及相关物质的方法，其特征在于，利用权利要求1中所述方法将检测物中所述左亚叶酸钙中间体及相关物质进行分离，通入检测器进行检测，将检测得到的色谱图与已知对照品色谱图进行对比，判定检测物中是否含有所述左亚叶酸钙中间体及相关物质；所述检测器波长设定为280±10nm。

8.测定左亚叶酸钙中间体及相关物质含量的方法，其特征在于，所述方法具体包含以下步骤：

1)配制检测品溶液、对照品溶液；

2)分离；

利用权利要求1中所述的方法，将所述左亚叶酸钙中间体及相关物质进行分离；

3)鉴定；

利用权利要求7中所述的方法，鉴定所述左亚叶酸钙中间体及相关物质；

4)含量计算；

根据鉴定过程中得到的色谱图，按峰面积归一化法计算检测品溶液中所述左亚叶酸钙中间体及相关物质的含量。

9.根据权利要求8中所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中稀释剂为0.025mol/L磷酸钠和10g/L抗坏血酸的混合溶液。

10.评价左亚叶酸钙中间体质量的方法，其特征在于，利用权利要求8所述方法测定所述左亚叶酸钙中所述相关物质的质量百分比或所述左亚叶酸钙中间体的质量百分比，与规定的合格标准进行对比，判定所述左亚叶酸钙中间体的质量。