CN114324526A - 一种检测人血清中的前列腺特异性抗原的生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
一种检测人血清中的前列腺特异性抗原的生物传感器及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测人血清中的前列腺特异性抗原的生物传感器及其制备方法和应用，属于生物传感器领域。上述制备方法包括：步骤1：合成金纳米棒，并利用DNA对金纳米棒功能化；步骤2：在电极表面电沉积PEG/PEDOT纳米复合材料，再其上固定链霉亲和素以及生物素标记的多肽；步骤3：将DNA功能化的金纳米棒通过Au‑S键固定到电极上，并用亚甲基蓝分子吸附在DNA上形成信号放大器，得到生物传感器。该生物传感器最低检测限为0.035pg/mL，线性范围为0.10pg/mL至10.0ng/mL，并且由于防污多肽的存在，能够检测真实人血清中的前列腺特异性抗原，表明所构建的生物传感器具有很大的实际应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器领域，特别是涉及一种检测人血清中的前列腺特异性抗原的生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
前列腺癌是世界范围内的主要健康问题，在所有常见癌症类型中排名第四。到目前为止，还没有治疗这种疾病的特效药。因此，早期准确地检测体液中的肿瘤生物标志物，为前列腺癌的治疗带来很大的希望。前列腺特异性抗原(PSA)是人血清中的一种糖蛋白，并且已被证明其为筛查前列腺癌、预测治疗后复发及随访预后最有效、最特异的血清标志物。许多传统的基于免疫分析法的PSA检测方法已经建立起来，如电致化学发光、荧光、表面等离子体共振和电化学。这些方法主要涉及PSA抗体的固定以及抗原和抗体之间的特异性识别。因此，免疫检测常存在抗体变性、检测过程复杂、耗时等问题。
最近，丹米德等人报道，短肽(HSSKLQ)可被PSA特异性切割，由于其稳定性好、低成本、易于分子水平组装等优点，被选为传统抗体的优越替代品。肽基电化学方法因其高灵敏度和方便性而受到人们的广泛关注。例如，袁若等研发组开发了几种利用银和Au@SiO2检测PSA的电化学生物传感器增强或通过二茂铁(Fc)和β-环糊精之间的主客体相互作用。罗喜良等研发组基于GO-Fe3O4-Thi探针和内参比二茂铁(Fc)功能化的两种防污肽构建了双模防污电化学传感平台，用于PSA检测。由于响应电流信号小，生物传感器的灵敏度难以令人满意。因此，为了获得高灵敏度的电化学肽传感器，在肽传感器中引入信号放大技术是一项迫切的任务。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测人血清中的前列腺特异性抗原的生物传感器及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该生物传感器的最低检测限为0.035pg/mL，线性范围为0.10pg/mL至10.0ng/mL，并且由于防污肽的存在，它能够检测真实人血清中的前列腺特异性抗原，这表明所构建的生物传感器具有很大的实际应用潜力。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种检测人血清中的前列腺特异性抗原的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：合成金纳米棒，并利用DNA对所述金纳米棒功能化，得到DNA功能化的金纳米棒；
步骤2：在电极表面电沉积PEG/PEDOT纳米复合材料，然后再其上固定链霉亲和素以及生物素标记的多肽；
步骤3：将步骤1中DNA功能化的金纳米棒附着在步骤2制备的电极上，并用亚甲基蓝分子吸附在DNA上形成信号放大器，即得到检测人血清中的前列腺特异性抗原的生物传感器。
优选的是，步骤1中，所述多肽2包括前列腺特异性抗原特异性识别结构域HSSKLQK(SEQ ID NO:1)和防污结构域PPPPEKEKEKE(SEQ ID NO:2)。
优选的是，步骤1中，所述多肽的末端用巯基基团官能化。
优选的是，步骤1中，利用种子介导法制备金纳米棒，再用DNA与所述金纳米棒溶液在4℃孵育12h，得到DNA功能化的金纳米棒。
优选的是，步骤3中，电沉积条件设置为：最小电压为-0.2V；最大电压为1.2V；起始电压和结束电压均为-0.2V；沉积周期的数量为10-15。
优选的是，所述多肽1和所述多肽2生物素化后，即多肽1为：生物素-PPPPEKEKEKE、多肽2为生物素-PPPPEKEKEKEHSSKLQC(SEQ ID NO:3)，按照体积比1:1混合，所述多肽1和所述多肽2浓度均为2.0mg/mL。
本发明还提供一种所述的制备方法制备的检测人血清中的前列腺特异性抗原的生物传感器。
本发明还提供一种所述的生物传感器在制备检测人血清中的前列腺特异性抗原水平的检测产品中的应用，将所述生物传感器前列腺特异性抗原孵育10-60min，测定所述生物传感器的抗污染性能。
本发明公开了以下技术效果：
本发明设计了一种基于特殊设计的防污肽和信号放大策略的超低污染高灵敏度生物传感器，用于检测人血清中的前列腺特异性抗原。具体地，在电极表面电沉积PEG/PEDOT纳米复合材料，然后在其上固定链霉亲和素以及生物素标记的多肽；该多肽被设计为包括PSA特异性识别结构域(HSSKLQK)和防污结构域(PPPPEKEKEKE)，并且该多肽的末端用–SH基团官能化；然后将DNA功能化的金纳米棒(DNA/AuNRs)附着在电极上，亚甲基蓝(MB)分子吸附在DNA上形成信号放大器。在前列腺特异性抗原存在的情况下，多肽被特异性切割，导致DNA/AuNRs和MB一起丢失，从而显著降低MB电流信号。本发明制备的上述生物传感器的最低检测限为0.035pg/mL，线性范围为0.10pg/mL至10.0ng/mL，并且由于防污多肽的存在，它能够检测真实人血清中的前列腺特异性抗原，这表明所构建的生物传感器具有很大的实际应用潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为电沉积PEG/PEDOT纳米复合材料的循环伏安曲线；
图2为AuNRs的合成和表征；A-E为所合成的不同纵横比的AuNRs的表征；F为所合成的不同纵横比的AuNRs的紫外吸收光谱；
图3为PEG/PEDOT/GCE的表征；A为LiClO4/PEDOT薄膜；B-D为PEG/PEDOT薄膜；
图4为由计时库伦曲线计算的各种电极的电化学活性表面积；A为电极在0.2mMK3Fe(CN)6和0.1M KCl混合溶液中以脉冲宽幅为0.25s条件下测定的计时库伦曲线；B为由A曲线中获得电流Q和时间开方t1/2之间的线性关系；
图5为采用CV法监测PSA生物传感器的组装过程；曲线a：裸电极；曲线b：PEG/PEDOT修饰电极；曲线c：多肽固定到PEG/PEDOT修饰电极上；曲线d：DNA/AuNRs信号放大器组装到修饰电极；
图6为XPS表征生物传感器的构造；A：羧化PEG衍生物掺杂的PEDOT纳米复合材料；B：多肽和DNA/AuNRs信号放大器相继固定在电极上；
图7为验证DNA/AuNRs/Pep/PEDOT/PEG中不同元素的来源；A：N元素来自多肽和DNA，B和C：Au和P元素来自DNA/AuNRs信号放大器；
图8为表征生物传感器表面抗污染能力和亲水性；A1-D1依次为裸电极、LiClO4/PEDOT/GCE、PEG/PEDOT/GCE和Pep/PEG/PEDOT/GCE亲水性测定结果；A2-D2依次为；裸电极、LiClO4/PEDOT/GCE、PEG/PEDOT/GCE和Pep/PEG/PEDOT/GCE的静态水接触角；
图9为不同电极材料的荧光图；裸电极、LiClO4/PEDOT/GCE、PEG/PEDOT/GCE和Pep/PEG/PEDOT/GCE在FITC-BSA溶液(0.1mg mL-1)孵化1小时后检测到的电极表面的荧光图；
图10为裸电极对不同浓度的单一蛋白质的DPV响应；A1-A4依次代表了人血清白蛋白(HSA)，溶菌酶(LYZ)，牛血清白蛋白(BSA)和人免疫球蛋白(Hg)，蛋白质的浓度依次为0.1mg mL-1，0.625mg mL-1，1.25mg mL-1，2.5mg mL-1，5.0mg mL-1，10mg mL-1，20mg mL-1；
图11为LiClO4/PEDOT/GCE对不同浓度的单一蛋白质的DPV响应；B1-B4依次代表了人血清白蛋白(HSA)，溶菌酶(LYZ)，牛血清白蛋白(BSA)和人免疫球蛋白(Hg)，蛋白质的浓度依次为0.1mg mL-1，0.625mg mL-1，1.25mg mL-1，2.5mg mL-1，5.0mg mL-1，10mg mL-1，20mgmL-1；
图12为PEG/PEDOT/GCE对不同浓度的单一蛋白质的DPV响应；C1-C4依次代表了人血清白蛋白(HSA)，溶菌酶(LYZ)，牛血清白蛋白(BSA)和人免疫球蛋白(Hg)，蛋白质的浓度依次为0.1mg mL-1，0.625mg mL-1，1.25mg mL-1，2.5mg mL-1，5.0mg mL-1，10mg mL-1，20mgmL-1；
图13为Pep/PEG/PEDOT/GCE对不同浓度的单一蛋白质的DPV响应；D1-D4依次代表了人血清白蛋白(HSA)，溶菌酶(LYZ)，牛血清白蛋白(BSA)和人免疫球蛋白(Hg)，蛋白质的浓度依次为0.1mg mL-1，0.625mg mL-1，1.25mg mL-1，2.5mg mL-1，5.0mg mL-1，10mg mL-1，20mg mL-1；
图14为评估不同电极材料的抗污染能力；A：裸电极；B：LiClO4/PEDOT/GCE；C：PEG/PEDOT/GCE；D：Pep/PEG/PEDOT/GCE；
图15为用胎牛血清(FBS)评估改性电极表面的抗污染性能；A：裸电极；B：LiClO4/PEDOT/GCE；C：PEG/PEDOT/GCE；D：Pep/PEG/PEDOT/GCE；
图16为生物传感器对PSA的电化学检测；曲线a显示生物传感器在-0.25V处表现出明确的DPV信号；曲线b为在PSA中孵育后，生物传感器的电化学电流信号显着降低；
图17为优化PSA检测的条件；A：PEG/PEDOT沉积圈数；B：AuNR的纵横比；C：PSA孵育时间；
图18为DPV方法研究了抗污染生物传感器对不同浓度PSA的电流响应；A：PSA生物传感器在优化条件下与不同量的PSA表现出极好的关联；B为在PBS 7.4中电流变化率(ΔIp/Ip0)与不同浓度的PSA之间的对应关系；C在5％FBS中电流变化率(ΔIp/Ip0)与不同浓度的PSA之间的对应关系；D该生物传感器对PSA，BSA，has，Hg，癌胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(AFP)，IgG和LYZ的电流响应；PSA的浓度为1.0ng mL-1，其他物质的浓度为10.0ng mL-1；
图19为评估PSA生物传感器的稳定性；A：一周内生物传感器的Ip/Ip0的变化情况；B：不同生物传感器相同浓度的PSA下测定的Ip/Ip0的变化情况；C：同一电极在一定浓度的PSA重复测定5次Ip/Ip0的变化情况。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例所用到的主要试剂和材料：
十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、氯金酸(HAuClO4)、硼氢化钠(NaBH4)、硝酸银(AgNO3)、抗坏血酸(AA)、十二烷基硫酸钠(SDS)、3，4-乙二氧噻吩(EDOT)、LiClO4、MB由Aladdin试剂(中国上海)购买。链霉亲和素、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二酰亚胺(EDC)、DNA(AGTGCGAGCGAG)取自生工生物技术(上海)有限公司。自设计肽(多肽1，biotin-PPPPEKEKEKE，多肽2，biotin-PPPPEKEKEKEHSSKLQC)购自Bank-peptide生物科技有限公司(中国合肥)。羧酸化4-臂聚乙二醇购自苏州诺德衍生医药科技有限公司。链霉亲和素、胎牛血清(FBS)、人血清白蛋白(HSA)、人血红蛋白(Hg)、溶菌酶(LYZ)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、人免疫球蛋白G(IgG)、牛血清白蛋白(BSA)、前列腺特异性抗原(PSA)均购自北京博阳宏达科技有限公司。人血清样本由青岛农业大学附属医院提供。
主要仪器：所有电化学实验均使用CHI660E电化学站(中国上海华晨仪器有限公司)进行。三电极系统采用改性玻碳电极(GCE，直径3.0mm)，Ag/AgCl电极和铂丝。在JC2000-CG400型测角仪上，采用固滴法(上海中辰仪器有限公司)进行静水接触角测量。利用场发射扫描电子显微镜(JEOL JSM-7500F，Hitachi High-Technology Co.，Ltd.，Japan)对LiClO4/PEDOT和PEG/PEDOT纳米复合材料的形貌进行表征。通过透射电子显微镜(TEM)(JEM-2100，Hitachi，Japan)对AuNRs图像进行表征。X射线光电子能谱(XPS)分析使用ESCALAB 250Xi光谱仪(Thermo Fisher Scientific，UK)，使用高性能铝单色源，工作在15千伏。紫外-可见吸收光谱采用Cary60紫外分光光度计(Cary60，美国)。采用TCS SP5共聚焦激光显微镜(德国徕卡)记录改性表面的荧光。
实施例1
1、金纳米棒的合成
根据之前的报告，AuNRs是使用种子介导的表面活性剂定向方法制备的(参考Gorelikov I，Matsuura N(2008)“十六烷基三甲基溴化铵封端的纳米粒子上介孔二氧化硅的单步包覆”)。具体地，金纳米棒种子溶液的制备方法如下：将CTAB溶液(9.75mL，0.1M)加入到HAuCl4·3H2O溶液(0.25mL，0.01M)中，搅拌10min后，将NaBH4冷溶液(0.6mL，0.01M)快速加入到上述制备的CTAB与HAuCl4·3H2O的混合物中，形成金纳米棒种子。金纳米棒种子溶液搅拌10min，放置1h后使用。
制备了5批500mlCTAB包覆的AuNRs。CTAB(475ml，0.1M)，HAuCl4·3H2O溶液(25ml、0.01M)和不同量的0.01M硝酸银(0.10、1.25、2.50、3.75和5.50ml)混合形成5种生长溶液。然后分别将5份抗坏血酸(2.75ml，0.1M)加入上述生长溶液中。当加入抗坏血酸溶液后，溶液的颜色变为无色。继续搅拌，将0.6ml种子溶液加入搅拌中的生长溶液，15min后溶液颜色改变，减弱搅拌，27℃老化16h，然后离心AuNRs溶液进行纯化(13500rcf，20min)。
2、DNA/AuNRs信号放大器的合成
将5组相同的DNA(5’SH-C6-AGTGCGAGCGAG 3’，10-6mol/L，10μL)分别加入到5种不同纵横比的AuNRs溶液(100μL)中，4℃孵育12h，为避免团聚，将SDS溶液(1％，10μL)加入上述溶液中，室温下混合振荡1h。然后缓慢加入氯化钠溶液(0.5mol/L，50μL)，并继续老化12h。老化后，用PBS溶液以12000rpm洗涤制备的DNA/AuNRs溶液三次，每次20min，洗涤后将收集的DNA/AuNRs分散在1mL PBS中。
3、电化学生物传感器的构建
首先，根据文献“Nanocomposite and nanoporous polyaniline conductingpolymers exhibit enhanced catalysis of nitrite reduction.”对GCEs进行抛光和清洁。采用循环伏安法(CV)在含有10μL EDOT和10mg PEG的5.0mL溶液中电沉积PEG/PEDOT纳米复合材料。设置CV参数如下：最小电压为-0.2V；最大电压为1.2V；起始电压和结束电压均为-0.2V；沉积周期的数量为10(图1)。所得电极定义为PEG/PEDOT/GCE。同样，在含有10μLEDOT和10mg LiClO4的5.0mL溶液中制备LiClO4/PEDOT/GCE。
PEG/PEDOT/GCE在含有链霉亲和素(10-6mol/L)、NHS(0.1M)和EDC(0.4M)的溶液中孵育1h，然后用去离子水洗涤3次。然后将两种多肽以1:1的浓度比混合的溶液(15μL，2.0mg/mL)滴在修饰电极表面(盖上湿烧杯，持续4h)。通过生物素与链霉亲和素的相互作用，生物素标记的多肽被固定在电极表面。修饰电极定义为Pep/PEG/PEDOT/GCE。
将具有不同纵横比的五组DNA/AuNRs分别滴在五个Pep/PEG/PEDOT/GCEs上，孵育10h，使AuNRs通过Au-S键与硫醇封端的多肽结合。洗涤后，将修饰电极浸入20μM MB溶液中1h，将电活性MB负载到DNA链上，从而获得生物传感器。
所有的测量，如抗污染评估、荧光成像和PSA传感，均已说明如下。
(1)抗污染评估。针对四种单蛋白溶液和人血清样品评估了改性表面的防污性能。DPV信号用于比较蛋白质和人血清样品中孵育前后改性表面的变化。蛋白质溶液和复杂的生物样品用PBS(0.2M，pH 7.4)稀释。
(2)荧光成像。使用TCS SP5共聚焦激光显微镜(Leica，德国)监测荧光。测试了裸电极、LiClO4/PEDOT、PEG/PEDOT和Pep/PEG/PEDOT修饰电极。所有界面在0.1mg/mL荧光素异硫氰酸酯标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)溶液中室温孵育0.5h，然后用PBS和Milli-Q水彻底冲洗3次。最后，在488nm激发的共聚焦荧光显微镜下拍摄了三个界面的图像。
(3)PSA的感测。修饰后的电极(MB/SA/Pep/PEG/PEDOT/GCE)在不同浓度的PSA溶液中于37℃孵育0.5h，然后用PBS洗涤3次。通过DPV测试的生物传感器直接在0.2M PBS(pH7.4)溶液中从-0.5到0.1V扫描，并记录峰值电流。
4、结果与分析
4.1 AuNRs的合成和表征
采用种子介导生长法合成了各种纵横比的AuNRs，获得并表征了5种AuNRs。
从图2可以看出，样品1几乎是金纳米粒子，其他4个样品是不同纵横比的AuNRs。TEM表征还表明AuNRs具有良好的分散性和均匀的形状。不同的AuNRs溶液呈现不同的颜色(图2A-E)，合成的AuNRs的紫外吸收光谱表明五种AuNRs的峰位置分别为540nm、660nm、702nm、748nm和831nm，见图2F。溶液中AuNRs的浓度通过测量AuNRs溶液的吸收峰来确定，该吸收峰通过电感耦合等离子体原子发射光谱法进行校准。
4.2 PEG/PEDOT/GCE的表征
用扫描电镜表征了掺杂有LiClO4和PEG的导电聚合物PEDOT的表面形貌和微观结构。
如图3A所示，LiClO4/PEDOT薄膜具有相对平坦的表面，而PEG/PEDOT薄膜表现出特殊的三维多孔网络微观结构(图3B-D)，极大地扩大了PEG/PEDOT的表面积。
计时库仑法技术用于计算各种电极的电化学活性表面积，并使用Cottrell公式[Q(t)＝(2nFAD1/2π-1/2C)t1/2+Qdl+Qads]。公式中的所有参数表示见文献“Enhancedelectrochemical biosensing of alpha-fetoprotein based on three-dimensionalmacroporous conducting polymer polyaniline”。根据实验结果(图4)，PEG/PEDOT/GCE(曲线c)、LiClO4/PEDOT/GCE(曲线b)和裸电极(曲线a)的活性表面积分别估计为3.03cm2，0.24cm2和0.033cm2。同时可见，PEG/PEDOT/GCE的活性表面积分别是裸电极和LiClO4/PEDOT/GCE的91.7倍和12.5倍。具有大的电活性表面积的PEG/PEDOT/GCE为生物分子的附着和电子转移提供了良好的基质。
4.3生物传感器构建过程的表征
PSA生物传感器的组装过程采用CV法逐步监测。从图5可以看出，与裸电极(曲线a)相比，PEG/PEDOT修饰电极(曲线b)上的氧化还原峰值电流大大增加。电流的大幅增加是由于导电聚合物PEDOT的优异导电性。肽在PEG/PEDOT界面上的固定化直接导致氧化还原峰值电流的降低(曲线c)，这是由于肽的导电性差以及肽上羧基负电荷与[Fe(CN)6]3-/4-探针。将DNA/AuNRs信号放大器组装到修饰电极上后，修饰电极处的氧化还原峰值电流再次降低(曲线d)，这是由于DNA带负电荷的磷酸盐骨架与带负电荷的电化学探针之间的排斥作用所致。
此外，选择XPS表征作为一种有说服力的方式来确认生物传感器的构造。如图6所示，在PEG/PEDOT纳米复合材料中主要检测到三种元素(O、C和S)。在链霉亲和素、肽和DNA/AuNRs信号放大器相继固定后，出现了三种新元素(N、Au和P)(图6和图7)。其中，N元素来自链霉亲和素、肽和DNA，Au和P元素来自DNA/AuNRs信号放大器。同时，C的含量增加，S和O的含量减少(表1)。这些XPS结果证明了PEG/PEDOT的制备以及随后肽和信号放大器的固定，以及生物传感器的成功构建。
表1 PEG/PEDOT和DNA/AuNRs/Pep/PEG/PEDOT涂层ITO表面的原子组成(％)
4.4各种改性界面的抗污染性能
与人体血液接触的表面会发生非特异性蛋白质吸附，这会阻碍膜和生物传感器的有效性。根据伯格定律，在所有可能的参数中，水介导的疏水力和水合力被认为是蛋白质吸附的主要因素。接触角小于65°的亲水表面具有抑制蛋白质非特异性吸附的能力，因为蛋白质不应能够从表面置换水并吸附。为了表征表面亲水性和润湿性，测试了裸电极、LiClO4/PEDOT/GCE、PEG/PEDOT/GCE和Pep/PEG/PEDOT/GCE的静态水接触角(图8A2-D2和表2)。裸电极的接触角为76.7°。LiClO4/PEDOT的接触角为40.1°，表明合成的PEDOT膜具有中等亲水性。PEG/PEDOT/GCE的接触角大大降低至25.4°，表明PEG/PEDOT纳米复合材料具有高亲水性。多肽的进一步修饰后，Pep/PEG/PEDOT/GCE的接触角降低到18.4°，这是由于多肽上有大量的氨基和羧基。因此，PEG/PEDOT和Pep/PEG/PEDOT界面显示出很大的抗污染潜力。
表2裸电极、LiClO4/PEDOT/GCE、PEG/PEDOT/GCE和Pep/PEG/PEDOT/GCE的静态水接触角
为了更直观地比较不同修饰界面的抗污染性能，将裸电极、LiClO4/PEDOT、PEG/PEDOT和Pep/PEG/PEDOT修饰电极在0.1mg/mL FITC-BSA中孵育1h。如图8和图9所示，裸电极和LiClO4/PEDOT修饰表面显示出强烈的荧光强度(BSA严重吸附)，而PEG/PEDOT和Pep/PEG/PEDOT修饰的电极没有显示荧光信号(几乎没有吸附BSA)。
选择BSA、HSA、Hg和LYZ来表征修饰电极的抗污染性能，因为这些蛋白质具有不同的等电点(pI)和分子量。在不同浓度的蛋白质中孵育30min之前和之后，比较了裸电极、LiClO4/PEDOT/GCE、PEG/PEDOT/GCE和Pep/PEG/PEDOT/GCE的DPV响应(图10-13)。图14显示裸电极的电流变化率(ΔI/I0)呈现最大值，其中BSA、HSA、LYZ和Hg在裸电极上的吸附最为严重。相比之下，PEG/PEDOT/GCE和Pep/PEG/PEDOT/GCE的ΔI/I0值远小于裸电极和LiClO4/PEDOT/GCE，证明PEG/PEDOT和Pep/PEG/PEDOT可以大大减少蛋白质吸附，并具有优良的抗污染能力。
复杂的生物介质，如FBS，也被用来评估改性表面的抗污染性能。如图15所示，浸入不同浓度FBS后，PEG/PEDOT和Pep/PEG/PEDOT修饰电极的氧化峰值电流略有变化。还发现，即使在未稀释的血清中孵育后，峰值电流仍保持其初始值的71.78％。由于改性表面具有良好的亲水性，PEG/PEDOT和Pep/PEG/PEDOT不仅对单一蛋白质表现出抗污染能力，而且对复杂生物样品也表现出优异的抗污染能力。
4.5生物传感器对PSA的电化学检测
为了确认生物传感器的可行性，使用吸附在信号放大器中的MB氧化还原指示剂，利用PSA孵育前后DPV信号的变化来增强PSA检测中的敏感信号。
图16显示生物传感器在-0.25V处表现出明确的DPV信号(曲线a)，这对应于MB的电化学氧化信号。在PSA中孵育后，生物传感器的电化学电流信号显着降低(曲线b)，表明残留在生物传感器上的MB被PSA特异性裂剪切多肽而减少。因此，在这项工作中，PSA检测是基于测试MB氧化峰的电化学信号变化进行的。
为了获得PSA检测的最佳条件，详细研究了PEG/PEDOT沉积圈数、AuNR的纵横比和PSA孵育时间对信号变化率(ΔIp/Ip0)的影响，如图17所示。根据实验结果，采用以下最佳实验条件。(A)PEG/PEDOT电沉积的CV循环为15个循环；(B)AuNRs的纵横比为样品2；(C)PSA孵育时间为30min。
通过灵敏的DPV方法研究了制备的具有不同量PSA的抗污染生物传感器。如图18A所示，PSA生物传感器在优化条件下在PBS 7.4中与不同量的PSA表现出极好的关联。正如预期的那样，随着PSA浓度的增加，由于PSA对剪切多肽，导致传感器上信号放大器的减少，PSA生物传感器的电化学响应急剧下降。在PBS7.4中获得信号变化率(ΔIp/Ip0)和PSA浓度的对数之间获得了线性关系，范围从0.10pg/mL到10.0ng/mL(图18B)。回归方程为ΔIp/Ip0＝0.0328logC+0.889(R2＝0.99)。检测限估计为0.035pg/mL。此外，通过所提出的生物传感器测定了5％FBS中不同浓度的PSA。如图18C所示，线性回归方程为ΔIp/Ip0＝0.0384logC+0.967(R2＝0.98)，与PBS 7.4中获得的校准曲线相似。这表明该生物传感器在复杂样品中具有很高的实际应用可能性。生物传感器的这种高分析性能主要归功于PEG/PEDOT的纳米多孔微结构和抗污染性能、DNA/AuNRs信号放大器的强大信号放大功能以及目标PSA的特异性强裂解。
4.6 PSA生物传感器的特异性、重现性和稳定性
评价了电化学生物传感器的特异性，认为它是检测肿瘤生物标志物PSA的有效方法。在不同干扰条件下，通过PSA、BSA、HSA、Hg、LYZ、IgG、AFP和CEA验证了工程PSA生物传感器的选择性。如图18D所示，PSA(1.0ng/mL)的信号变化率显着降低，而其他干扰蛋白(10.0ng/mL)的响应则可以忽略不计。因此，所制备的PSA生物传感器不受各种干扰蛋白的影响，表明PSA检测具有良好的特异性。
还研究了所提出的PSA生物传感器的长期稳定性。三个不同的生物传感器在一周内检测到1.0ng/mL PSA，检测频率为每天一次。结果如图19A所示，1周检测结果基本无变化，表明该生物传感器具有优异的长期稳定性。进行测定内和测定间以评估该方法的再现性。当使用五个生物传感器测试相同浓度的PSA(1.0ng/mL)时，生物传感器的相对标准偏差(RSD)为5.1％(图19B)。当同一电极在一定浓度的PSA(1.0ng/mL)下重复检测5次时，5次结果的RSD为5.2％(图19C)。
4.7实际样品中的分析应用
为了评估所提出方法的准确性，还使用PSA生物传感器来确定健康人真实血清样品中不同PSA浓度的回收率。血清样本由青岛农业大学附属医院提供。我们使用标准添加方法来评估该生物传感器的适用性。如表3所示，令人满意的回收率范围为101.6％至107.0％，RSD值为3.2％至6.1％。结果表明，该生物传感器在医学检测方面具有广阔的前景。
表3生物传感器检测血清中的PSA
总之，基于抗污染和PSA特异性裂解多肽以及DNA/AuNRs信号放大器，构建了一种能够检测人血清中靶标的抗污染和超灵敏PSA生物传感器。三个因素保证了该生物传感器独特而优异的传感性能：首先，设计的包括抗污染两性离子域和PSA诱导裂解域的肽段为生物传感器在复杂的生物环境中提供了良好的选择性和抗污染能力。其次，DNA/AuNRs和MB的信号放大系统确保了电化学生物传感器的高灵敏度。第三，PEG/PEDOT提供了具有大电活性表面积、优异导电性和抗污染能力的三维多孔基材。提出的基于PEG/PEDOT平台与DNA/AuNRs信号放大器和设计的肽相关的具有超高灵敏度和超低污染的电化学生物传感器的开发策略为构建生物传感器和生物电子学提供了一种有效的方法来检测复杂生物介质中的目标。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种检测人血清中的前列腺特异性抗原的生物传感器及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
His Ser Ser Lys Leu Gln Lys
1 5
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Pro Pro Pro Pro Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu
1 5 10
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Pro Pro Pro Pro Glu Lys Glu Lys Glu Lys Glu His Ser Ser Lys Leu
1 5 10 15
Gln Cys
Claims (8)
1.一种检测人血清中的前列腺特异性抗原的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：合成金纳米棒，并利用DNA对所述金纳米棒功能化，得到DNA功能化的金纳米棒；
步骤2：在电极表面电沉积PEG/PEDOT纳米复合材料，然后再其上固定链霉亲和素以及生物素标记的多肽；
步骤3：将步骤1中DNA功能化的金纳米棒固定到步骤2制备的电极上，并用亚甲基蓝分子吸附在DNA上形成信号放大器，即得到检测人血清中的前列腺特异性抗原的生物传感器。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述多肽包括多肽1和多肽2，所述多肽1为防污结构域PPPPEKEKEKE，所述多肽2由前列腺特异性抗原特异性识别结构域HSSKLQK和防污结构域PPPPEKEKEKE构成。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述多肽的末端用巯基基团官能化。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，利用种子介导法制备金纳米棒，再用DNA与所述金纳米棒溶液在4℃孵育12h，得到DNA功能化的金纳米棒。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，电沉积条件设置为：最小电压为-0.2V；最大电压为1.2V；起始电压和结束电压均为-0.2V；沉积周期的数量为10-15圈。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述多肽1和所述多肽2生物素化后，按照体积比1:1混合，所述多肽1和所述多肽2浓度均为2.0mg/mL。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的制备方法制备的检测人血清中的前列腺特异性抗原的生物传感器。
8.一种如权利要求7所述的生物传感器在制备检测人血清中的前列腺特异性抗原水平的检测产品中的应用，其特征在于，将所述生物传感器前列腺特异性抗原孵育10-60min，测定所述生物传感器的抗污染性能。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN116008370A (zh) * | 2022-12-15 | 2023-04-25 | 青岛科技大学 | 基于peg-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器及其制备方法与应用 |
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1835763A (zh) * | 2003-06-20 | 2006-09-20 | 妙甯公司 | Ccn1组合物和方法 |
| CN104040341A (zh) * | 2011-10-25 | 2014-09-10 | 斯隆－凯特林纪念癌症中心 | 用于前列腺癌的诊断、预测和治疗的游离psa抗体 |
| US20150004621A1 (en) * | 2013-06-28 | 2015-01-01 | Milagen, Inc. | Biological marker for early cancer detection and methods for cancer detection (bf819) |
| WO2017128888A1 (zh) * | 2016-01-26 | 2017-08-03 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种基于蛋白纳米线的3d探针-磁性微珠复合物及其应用 |
-
2021
- 2021-12-27 CN CN202111613689.1A patent/CN114324526B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1835763A (zh) * | 2003-06-20 | 2006-09-20 | 妙甯公司 | Ccn1组合物和方法 |
| CN104040341A (zh) * | 2011-10-25 | 2014-09-10 | 斯隆－凯特林纪念癌症中心 | 用于前列腺癌的诊断、预测和治疗的游离psa抗体 |
| CN106872702A (zh) * | 2011-10-25 | 2017-06-20 | 斯隆－凯特林纪念癌症中心 | 用于前列腺癌的诊断、预测和治疗的游离psa抗体 |
| US20150004621A1 (en) * | 2013-06-28 | 2015-01-01 | Milagen, Inc. | Biological marker for early cancer detection and methods for cancer detection (bf819) |
| WO2017128888A1 (zh) * | 2016-01-26 | 2017-08-03 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种基于蛋白纳米线的3d探针-磁性微珠复合物及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YAN XU ET AL: "Ratiometric Antifouling Electrochemical Biosensors Based on Multifunctional Peptides and MXene Loaded with Au Nanoparticles and Methylene Blue", ACS APPL. MATER. INTERFACES * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116008370A (zh) * | 2022-12-15 | 2023-04-25 | 青岛科技大学 | 基于peg-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器及其制备方法与应用 |
| CN116008370B (zh) * | 2022-12-15 | 2024-11-15 | 青岛科技大学 | 基于peg-多肽偶联物的抗污染电化学免疫传感器及其制备方法与应用 |
| CN119310161A (zh) * | 2024-12-18 | 2025-01-14 | 国科温州科技发展有限公司 | 一种电化学生物传感器及其应用与检测方法和装置 |
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