CN114317825A - 一种猪繁殖与呼吸道综合征的qPCR诊断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪繁殖与呼吸道综合征的qPCR诊断方法，其特征在于：相关试剂为引物，荧光探针，定量试剂，血清稀释液，包括步骤一，收集样品；步骤二，加入引物；步骤三，加入荧光探针；步骤四，样品扩增；步骤五，荧光定量PCR仪检测；步骤六，对比血清稀释；步骤七，稀释血清PCR仪检测；步骤八，数据对比分析。本发明利用实时荧光定量PCR方法测定血液中病毒核酸的含量，因此不必等到猪体内产生抗体，在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低时就可以测定，不仅可以提高一种猪繁殖与呼吸道综合征诊断的准确度还能对病毒的扩增进行预测判断，为后期的治疗提供了一定思路，还能起到推动猪繁殖与呼吸综合征病毒防控工作的效果。
Description
技术领域
本发明涉及兽医诊断技术领域，具体为一种猪繁殖与呼吸道综合征的qPCR诊断方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征是猪群发生以繁殖障碍和呼吸系统症状为特征的一种急性、高度传染的病毒性传染病，猪繁殖与呼吸综合征的主要感染途径为呼吸道，空气传播、接触传播、精液传播和垂直传播为主要的传播方式，病猪、带毒猪和患病母猪所产的仔猪以及被污染的环境、用具都是重要的传染源，此病在仔猪中传播比在成猪中传播更容易，当健康猪与病猪接触，如同圈饲养，频繁调运，高度集中，都容易导致本病发生和流行，猪场卫生条件差，气候恶劣、饲养密度大，可促进猪繁殖与呼吸综合征的流行，为兽医临床诊断猪繁殖与呼吸综合征提供一种快速、准确的方法，为开展大规模的猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查与疫情监测提供技术依据，因此，研究开发猪繁殖与呼吸综合征的检测方法，已经是兽医诊断领域一个亟需解决的问题。
现有的猪繁殖与呼吸综合征诊断方法在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低时会降低诊断的准确度，因此需要无法进行测试等到猪体内产生抗体，延长了猪繁殖与呼吸道综合征病毒检测周期，导致疾病传染率扩大，同时检测成本大，而且操作比较复杂，对医护人员技术要求比较高，不能满足用户需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪繁殖与呼吸道综合征的qPCR诊断方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种猪繁殖与呼吸道综合征的qPCR诊断方法，相关试剂为引物，荧光探针，定量试剂，血清稀释液。
一种猪繁殖与呼吸道综合征的qPCR诊断方法，包括步骤一，收集样品；步骤二，加入引物；步骤三，加入荧光探针；步骤四，样品扩增；步骤五，荧光定量PCR仪检测；步骤六，对比血清稀释；步骤七，稀释血清PCR仪检测；步骤八，数据对比分析；
其中上述步骤一中，抽取检测猪体内血清样品分别装入统一规格的4支试管中，每支试管按照临床标准4ml，将抽取的4支血清样品试管放入保温箱内进行储存以备用；
其中上述步骤二中，选取步骤1中2支血清样品试管，并向2支试管中加入适量的引物，通过震荡机对2支试管进行震荡混合；
其中上述步骤三中，将上述步骤二中的已加入引物的2支试管中再加入荧光探针，通过震荡机对试管震荡5-10s，使其荧光探针与试管中的血清充分混合；
其中上述步骤四，将上述步骤三中加入荧光探针的2支试管中再加入定量试剂，通过震荡试管5-10s进行充分混合
其中上述步骤五，将上述步骤三中震荡后的试管中血清滴入荧光定量PCR仪检测皿中，通过荧光定量PCR仪对检测皿中进行血清进行荧光检测；
其中上述步骤六，将步骤一中剩余两支血清试管中滴入血清稀释液，通过震荡试管5-10s进行充分混合；
其中上述步骤七中，将步骤六中震荡后的血清滴入PCR仪检测皿中，通过PCR仪进行检测；
其中上述步骤八中，通过数据分析软件对步骤五检测数据与步骤七检测数据进行处理分析。
优选的，所述引物具体包含miR-93-5p、miR-17-5p和miR-20-5p中的一种或多种miRNA的引物。
优选的，所述在血清稀释液由以下组分含量组成：译甘氨酸12-15g/L、精氨酸10-14g/L、谷氨酰胺2-6g/L、磷酸钾1-5g/L、丙酮酸钠3-7g/L、氯化钠20-24g/L、氯化镁13-17g/L、EDTA-2K0.2-0.8g/L，水22.4-26.4。
优选的，所述在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
优选的，所述定量试剂为UNICON qPCR Master Mix荧光定量PCR试剂，采用了UNICON抗体法热启动Taq酶，UNICON抗体与Taq酶紧密结合，在50℃反应30min条件下，仍然可以封闭95％以上的酶活，有效抑制了Taq酶结合到非目的扩增区域，限制了由于引物非特异性退火而导致的非特异性扩增，同时，提升PCR反应扩增效率，保证定量结果的可靠性。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.实时荧光定量PCR方法测定是血液中病毒核酸的含量，因此不必等到猪体内产生抗体，在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低时就可以测定，为将疾病消灭在超早期作出贡献，不仅可以提高一种猪繁殖与呼吸道综合征诊断的准确度还能对病毒的扩增进行预测判断，为后期的治疗提供了一定思路，准确率比较高，避免因人工失误而导致检测结果错误，同时实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差，提高实验的重复性，操作简单、花费的时间较短、普通工人经过短期培训即可进行操作，大大缩短了猪繁殖与呼吸道综合征病毒检测周期，而且检测结果准确，检测的效率也较高，适于大范围推广使用，还能起到推动猪繁殖与呼吸综合征病毒防控工作的效果。
2.通过在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，保证了荧光测量的准确性。
3.通过加入定量试剂为UNICON qPCR Master Mix荧光定量PCR试剂，采用了UNICON抗体法热启动Taq酶，UNICON抗体与Taq酶紧密结合，在50℃反应30min条件下，仍然可以封闭95％以上的酶活，有效抑制了Taq酶结合到非目的扩增区域，限制了由于引物非特异性退火而导致的非特异性扩增，同时，提升PCR反应扩增效率，保证定量结果的可靠性。
附图说明
图1为本发明的流程图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”“前端”、“后端”、“两端”、“一端”、“另一端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
请参阅图1，本发明提供的一种实施例：
实施例1
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种猪繁殖与呼吸道综合征的qPCR诊断方法，相关试剂为引物，荧光探针，定量试剂，血清稀释液。
一种猪繁殖与呼吸道综合征的qPCR诊断方法，包括步骤一，收集样品；步骤二，加入引物；步骤三，加入荧光探针；步骤四，样品扩增；步骤五，荧光定量PCR仪检测；步骤六，对比血清稀释；步骤七，稀释血清PCR仪检测；步骤八，数据对比分析；
其中上述步骤一中，抽取检测猪体内血清样品分别装入统一规格的4支试管中，每支试管按照临床标准4ml，将抽取的4支血清样品试管放入保温箱内进行储存以备用，利用保温箱可保证血清样本的活性，提升样品检测时的准确性；
其中上述步骤二中，选取步骤1中2支血清样品试管，并向2支试管中加入适量的引物，引物滴加采用胶头滴管进行滴加，便于工作人员对量的控制，通过震荡机对2支试管进行震荡混合，且引物具体包含miR-93-5p、miR-17-5p和miR-20-5p中的一种或多种miRNA的引物，加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。
其中上述步骤三中，将上述步骤二中的已加入引物的2支试管中再加入荧光探针，通过震荡机对试管震荡5-10s，使其荧光探针与试管中的血清充分混合，荧光探针滴加采用胶头滴管进行滴加，便于工作人员对量的控制；
其中上述步骤四，将上述步骤三中加入荧光探针的2支试管中再加入定量试剂，通过震荡试管5-10s进行充分混合，滴加采用胶头滴管进行滴加，便于工作人员对量的控制；
其中上述步骤五，将上述步骤三中震荡后的试管中血清滴入荧光定量PCR仪检测皿中，通过荧光定量PCR仪对检测皿中进行血清进行荧光检测，扩增的结果通过荧光定量PCR仪中荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出；
其中上述步骤六，将步骤一中剩余两支血清试管中滴入血清稀释液，通过震荡试管5-10s进行充分混合，血清稀释液由以下组分含量组成：译甘氨酸12-15g/L、精氨酸10-14g/L、谷氨酰胺2-6g/L、磷酸钾1-5g/L、丙酮酸钠3-7g/L、氯化钠20-24g/L、氯化镁13-17g/L、EDTA-2K0.2-0.8g/L，水22.4-26.4；
其中上述步骤七中，将步骤五中震荡后的血清滴入PCR仪检测皿中，通过PCR仪进行检测，通过PCR仪对血清中的长链非编码RNA和microRNA进行检测，联合检测长链非编码RNAH19、miR93-5P和miR17-5P，不仅可以提高检测猪繁殖与呼吸道综合征诊断的准确度还能对病毒的扩增进行预测判断，准确率比较高，避免因人工失误而导致检测结果错误；
其中上述步骤八中，通过数据分析软件对步骤四检测数据与步骤六检测数据进行处理分析，荧光定量PCR仪利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，通过计算机分析处理系统对荧光定量PCR仪测定数据与PCR仪测定数据进行对比分析，可以得出猪繁殖与呼吸道综合征诊断的实时结果，提升猪繁殖与呼吸道综合征诊断的准确度，还能对病毒的扩增进行预测判断，为后期的治疗提供了一定思路，为将疾病消灭在超早期作出贡献。
实施例2
实时荧光定量PCR方法测定是血液中病毒核酸的含量，因此不必等到猪体内产生抗体，在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低时就可以测定，为将疾病消灭在超早期作出贡献，不仅可以提高一种猪繁殖与呼吸道综合征诊断的准确度还能对病毒的扩增进行预测判断，为后期的治疗提供了一定思路，准确率比较高，避免因人工失误而导致检测结果错误，同时实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差，提高实验的重复性，操作简单、花费的时间较短、普通工人经过短期培训即可进行操作，大大缩短了猪繁殖与呼吸道综合征病毒检测周期，而且检测结果准确，检测的效率也较高，适于大范围推广使用，还能起到推动猪繁殖与呼吸综合征病毒防控工作的效果；在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，保证了荧光测量的准确性；定量试剂为UNICON qPCR MasterMix荧光定量PCR试剂，采用了UNICON抗体法热启动Taq酶，UNICON抗体与Taq酶紧密结合，在50℃反应30min条件下，仍然可以封闭95％以上的酶活，有效抑制了Taq酶结合到非目的扩增区域，限制了由于引物非特异性退火而导致的非特异性扩增，同时，提升PCR反应扩增效率，保证定量结果的可靠性。
本发明未详述之处，均为本领域技术人员的公知技术。
最后所要说明的是：以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改和等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (6)
1.一种猪繁殖与呼吸道综合征的qPCR诊断方法，其特征在于：相关试剂为引物，荧光探针，定量试剂，血清稀释液。
2.一种猪繁殖与呼吸道综合征的qPCR诊断方法，包括步骤一，收集样品；步骤二，加入引物；步骤三，加入荧光探针；步骤四，样品扩增；步骤五，荧光定量PCR仪检测；步骤六，对比血清稀释；步骤七，稀释血清PCR仪检测；步骤八，数据对比分析，其特征在于：
其中上述步骤一中，抽取检测猪体内血清样品分别装入统一规格的4支试管中，每支试管按照临床标准4ml，将抽取的4支血清样品试管放入保温箱内进行储存以备用；
其中上述步骤二中，选取步骤1中2支血清样品试管，并向2支试管中加入适量的引物，通过震荡机对2支试管进行震荡混合；
其中上述步骤三中，将上述步骤二中的已加入引物的2支试管中再加入荧光探针，通过震荡机对试管震荡5-10s，使其荧光探针与试管中的血清充分混合；
其中上述步骤四，将上述步骤三中加入荧光探针的2支试管中再加入定量试剂，通过震荡试管5-10s进行充分混合
其中上述步骤五，将上述步骤三中震荡后的试管中血清滴入荧光定量PCR仪检测皿中，通过荧光定量PCR仪对检测皿中进行血清进行荧光检测；
其中上述步骤六，将步骤一中剩余两支血清试管中滴入血清稀释液，通过震荡试管5-10s进行充分混合；
其中上述步骤七中，将步骤六中震荡后的血清滴入PCR仪检测皿中，通过PCR仪进行检测；
其中上述步骤八中，通过数据分析软件对步骤五检测数据与步骤七检测数据进行处理分析。
3.根据权利要求2所述的一种猪繁殖与呼吸道综合征的qPCR诊断方法，其特征在于：所述引物具体包含miR-93-5p、miR-17-5p和miR-20-5p中的一种或多种miRNA的引物。
4.根据权利要求2所述的一种猪繁殖与呼吸道综合征的qPCR诊断方法，其特征在于：所述在血清稀释液由以下组分含量组成：译甘氨酸12-15g/L、精氨酸10-14g/L、谷氨酰胺2-6g/L、磷酸钾1-5g/L、丙酮酸钠3-7g/L、氯化钠20-24g/L、氯化镁13-17g/L、EDTA-2K0.2-0.8g/L，水22.4-26.4。
5.根据权利要求2所述的一种猪繁殖与呼吸道综合征的qPCR诊断方法，其特征在于：所述在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
6.根据权利要求2所述的一种猪繁殖与呼吸道综合征的qPCR诊断方法，其特征在于：所述定量试剂为UNICON qPCR Master Mix荧光定量PCR试剂，采用了UNICON抗体法热启动Taq酶，UNICON抗体与Taq酶紧密结合，在50℃反应30min条件下，仍然可以封闭95％以上的酶活，有效抑制了Taq酶结合到非目的扩增区域，限制了由于引物非特异性退火而导致的非特异性扩增，同时，提升PCR反应扩增效率，保证定量结果的可靠性。
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