CN114317624B - 一种利用微通道反应装置通过三酶催化合成聚-(R)-5-甲基-ε-己内酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用微通道反应装置通过三酶催化合成聚‑(R)‑5‑甲基‑ε‑己内酯的方法，包括如下步骤：S1：以3‑甲基‑2‑环己烯‑1‑酮为原料，利用烯还原酶和环己酮单加氧酶为生物催化剂，得(R)‑5‑甲基‑ε‑己内酯；S2：利用诺维信435脂肪酶为生物催化剂，(R)‑5‑甲基‑ε‑己内酯在微通道反应装置中聚合，得聚‑(R)‑5‑甲基‑ε‑己内酯；其中，所述聚‑(R)‑5‑甲基‑ε‑己内酯的数均分子量为7500～18550。本发明具有反应条件温和、催化效率高、产物收率高、光学纯度高等优点。
Description
技术领域
本发明属于制备技术领域，特别涉及一种利用微通道反应装置通过三酶催化合成聚-(R)-5-甲基-ε-己内酯的方法。
背景技术
聚己内酯类化合物是一类具有良好的生物相容性、生物降解性、药物渗透性的材料，由于其良好的性能以及形状记忆特性，在医药卫生、生物医学工程、阻燃材料、3D打印技术等多种领域都有潜在的应用。己内酯类化合物作为聚酯的一类前体，其合成方法主要分为化学法和生物法。工业上比较成熟的制备己内酯类化合物的化学方法主要由氧化剂过氧酸、双氧水等催化环己酮类化合物发生Baeyer-Villiger(B-V氧化)反应等制备而成。然而，这些方法制备的己内酯类化合物光学纯度低，且存在易爆炸、环境污染严重等缺点，严重制约着其在我国的应用推广。生物催化合成己内酯类化合物主要以单加氧酶为催化剂，空气中的氧气为氧源。这种方法具有反应条件温和、环境友好、立体选择性高等优点。因此，本发明提供了一种三酶催化合成聚-(R)-5-甲基-ε-己内酯的方法。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用微通道反应装置通过三酶催化合成聚-(R)-5-甲基-ε-己内酯的方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种利用微通道反应装置通过三酶催化合成聚-(R)-5-甲基-ε-己内酯的方法，反应机理如图1所示，采用如图2所示的装置进行反应，以3-甲基-2-环己烯-1-酮为原料，利用烯还原酶、环己酮单加氧酶、诺维信435作为生物催化剂进行催化，主要分为三个反应步骤，首先利用烯还原酶将3-甲基-2-环己烯-1-酮还原为(R)-3-甲基环己酮，再利用环己酮单加氧酶催化生成(R)-5-甲基-ε-己内酯，最后利用诺维信435在微通道反应装置中连续制备聚合得到聚-(R)-5-甲基-ε-己内酯。
其中，所述反应包括如下步骤：
S1：以3-甲基-2-环己烯-1-酮为原料，利用烯还原酶和环己酮单加氧酶为生物催化剂，得(R)-5-甲基-ε-己内酯；
S2：利用诺维信435脂肪酶为生物催化剂，(R)-5-甲基-ε-己内酯在微通道反应装置中聚合，得聚-(R)-5-甲基-ε-己内酯；
其中，所述聚-(R)-5-甲基-ε-己内酯的数均分子量为7500～18550，优选为12500～18550。
其中，步骤S1为以下方式中的任意一种：
S11.将3-甲基-2-环己烯-1-酮与烯还原酶和环己酮单加氧酶进行级联反应制得(R)-5-甲基-ε-己内酯；
S12.将3-甲基-2-环己烯-1-酮先与烯还原酶进行第一反应制得(R)-3-甲基环己酮，再与环己酮单加氧酶进行第二反应制得(R)-5-甲基-ε-己内酯。
步骤S1中，所述烯还原酶为将来源于Zymomonas mobilis的烯还原酶(NCR)基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)构建到pET22b(+)载体上，并转入到大肠杆菌中，培养所得的全细胞状态的烯还原酶。
步骤S1中，所述的环己酮单加氧酶为将来源于Acinetobacter sp.NCIMB 9871的CHMO基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)构建到pET22b(+)载体上，并转入到大肠杆菌中，培养所得的全细胞状态的环己酮单加氧酶。
步骤S1中，所述烯还原酶和所述环己酮单加氧酶均选择全细胞状态参与反应。
步骤S1中，所述烯还原酶分散于PBS缓冲液中参与反应，所述烯还原酶的浓度为0.05～0.15g湿细胞/mL缓冲液，优选为0.1g湿细胞/mL缓冲液；所述环己酮单加氧酶分散于PBS缓冲液中参与反应，所述环己酮单加氧酶的浓度为0.005～0.105g湿细胞/mL缓冲液，优选为0.025～0.1g湿细胞/mL缓冲液。
步骤S1中，反应的溶剂为有机溶剂，所述有机溶剂为甲醇、乙腈、二甲基亚砜、异丙醇中的任意一种或几种组合。
步骤S1中，所述3-甲基-2-环己烯-1-酮与有机溶剂的用量比为0.2～1.8M，优选为0.5～1.5M，优选为1M。
步骤S1中，所述3-甲基-2-环己烯-1-酮、烯还原酶、环己酮的用量比为0.01～0.02mmol:0.1g湿细胞:0.205～0.15g湿细胞，优选为0.01～0.02mmol:0.1g湿细胞:0.025～0.1g湿细胞，同时控制终体系内有机溶剂体积浓度不高于1％。
步骤S1中，反应的温度为25～35℃。
步骤S1中，反应结束后，收集反应液，利用有机溶剂萃取反应液，保留有机相，干燥有机相后，减压浓缩，即得(R)-5-甲基-ε-己内酯；所述有机溶剂为有机溶剂为乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、正己烷中的任意一种或几种组合；所述干燥有机相优选为用无水硫酸镁干燥。
步骤S2中，所述的诺维信435为可直接购买得到的商品化酶。
步骤S2中，将诺维信435脂肪酶固定化的小球填充到微通道反应装置中并固定，所述诺维信435脂肪酶的填充量为(R)-5-甲基-ε-己内酯质量的10％～15％。
步骤S2中，所述微通道反应装置包括通过管道依次相连的原料储罐、注射器、微反应器和产品收集器；其中，所述微通道反应装置中的通道为毛细管或聚四氟乙烯管，优选聚四氟乙烯管。
步骤S2中，所述微通道反应装置中微反应器的内径为1～3mm，优选为1～2mm，进一步优选为2mm。
步骤S2中，所述微通道反应装置中微反应器的体积为20～25mL，优选为20mL。
步骤S2中，将(R)-5-甲基-ε-己内酯、溶剂和引发剂的混合溶液于微通道反应装置中聚合；所述溶剂为有机溶剂，包括但不限于甲苯；所述引发剂为醇类，包括但不限于正己醇和/或正丁醇；所述混合溶液中，所述(R)-5-甲基-ε-己内酯、溶剂和引发剂的用量比为54mg:(301～502)μL:(1～9)mL，优选为54mg:(321～482)μL:5mL。
步骤S2中，反应的温度为40～80℃，优选为40～60℃，进一步优选为60℃。
步骤S2中，所述反应结束后，收集微反应器流出液，减压浓缩即得聚-(R)-5-甲基-ε-己内酯。
综上，本发明采用一种三酶催化合成聚-(R)-5-甲基-ε-己内酯的方法，以3-甲基-2-环己烯-1-酮为底物，绿色、温和地依次经烯还原酶、环己酮单加氧酶、诺维信435进行生物催化，利用微流场反应技术进行聚合，具有反应快速、转化率高、选择性好、安全性高、成本低廉、传质传热效果好等一系列优点，克服了现有技术中现有技术光学纯度低、易爆炸、污染严重等一系列缺点，具有潜在的工业化生产的前景。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)本发明首次以三酶催化合成聚-(R)-5-甲基-ε-己内酯，利用烯还原酶、环己酮单加氧酶、诺维信435作为生物催化剂，以3-甲基-2-环己烯-1-酮为底物，利用三酶催化聚合的方法制备聚-(R)-5-甲基-ε-己内酯，该方法避免了技术难度大、光学纯度低、易爆炸、污染严重的制备方法，操作简单，反应条件温和，立体选择性高，催化效率高，产物收率高，光学纯度高，转化率高，更符合绿色化学的要求。
(2)本发明采用固定化诺维信435的方法，将商业化的诺维信435小球填充固定在微通道反应器中，可以保存在有机溶剂中重复利用。
(3)本发明利用微通道反应技术，在很小的通道尺寸，使流体在这些通道中流动、混合、反应，因此在这种微构造的化学设备中具有极大的比表面积，由此带来极大的传质传热效率优势，即能实现对反应温度的精确控制和对反应物料以精确配比瞬间混合，极大地提高收率、选择性以及产品质量，具有良好的工业应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为本发明的反应路线图。
图2是本发明反应装置流程示意图。
图3是本发明聚合物的核磁氢谱图。
图4是本发明聚合物的核磁碳谱图。
图5是本发明实施例14聚合物的Gel Permeation Chromatography(GPC)图。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所述微通道反应装置包括通过管道依次相连的原料储罐、注射器、微反应器和产品收集器，所述微通道反应装置中的管道为聚四氟乙烯管，反应器的盘管内径为2mm，长度为25cm。
下述实施例中所述的烯还原酶(NCR)构建步骤如下，(1)将来源于Zymomonasmobilis的烯还原酶基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)构建到pET22b(+)载体上(限制性内切酶位点为Ndel和XhoI)，并转入到大肠杆菌BL21(DE3)中；(2)取步骤(1)构建的NCR甘油菌种50μL接种至5mL LB培养基，并加入终浓度为100μg/mL的抗生素，37℃、200rpm振荡培养14h，得到预培养菌液。将5mL预培养菌液转接至500mL TB(含100mL PBS)培养基中，并加入终浓度为100μg/mL的抗生素，37℃、200rpm振荡培养约4h至OD600达到0.6～0.7，冷却半小时后，加入IPTG至终浓度0.25mM进行诱导表达，继续20℃振荡培养24h。将培养液离心浓缩，收集菌体并称重。将菌体分散到0.05M PBS至最终浓度为0.1g湿细胞/mL(约24.5mg干细胞/mL)。
下述实施例中所述的环己酮单加氧酶(CHMO)构建步骤如下，(1)将来源于Acinetobacter sp.NCIMB 9871的环己酮单加氧酶基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)构建到pET22b(+)载体上(限制性内切酶位点为Ndel和XhoI)，并转入到大肠杆菌BL21(DE3)中；(2)CHMO培养方法同烯还原酶的培养，得到最终浓度为0.1g湿细胞/mL(约24.5mg干细胞/mL)。
实施例1
将1mL，0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的NCR置于10mL茄形瓶中，将3-甲基-环己烯-1-酮溶于二甲基亚砜配成1M，取10μL加入反应体系，使底物浓度为10mM，于25℃下反应30min后，经GC监测生成(R)-3-甲基环己酮，且反应转化率大于等于99％，ee值大于等于99％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.10(1H,dt,J)12,1.2Hz),4.00(1H,dd J)12,8Hz),2.65(1H,t,J)3Hz),2.61(1H,t,J)16Hz),1.94(1H,m),1.86(1H,m),1.67(1H,m),1.38(2H,m),0.98(3H,d,J)20Hz)ppm.13C NMR(100MHz,CDCl3)δ176.0,73.9,36.9,34.4,33.8,21.6,17.7ppm.HRMS(ESI):m/z calc.for C7H12O[M+Na]+:135.0780,found:135.0784.
实施例2
将1mL，0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的NCR置于10mL茄形瓶中，将3-甲基-环己烯-1-酮溶于二甲基亚砜配成1M，取15μL加入反应体系，使底物浓度为15mM，于25℃下反应30min后，经GC监测生成(R)-3-甲基环己酮，且反应转化率大于等于99％，ee值大于等于99％。HRMS(ESI):m/z calc.for C7H12O[M+K]+:151.0520,found:151.0525.
实施例3
将1mL，0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的NCR置于10mL茄形瓶中，将3-甲基-环己烯-1-酮溶于二甲基亚砜配成1M，取20μL加入反应体系，使底物浓度为20mM，于25℃下反应30min后，经GC监测生成(R)-3-甲基环己酮，且反应转化率大于等于99％，ee值大于等于99％。HRMS(ESI):m/z calc.for C7H12O[M+Na]+:135.0780,found:135.0787.
实施例4
将1mL，0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的NCR置于10mL茄形瓶中，将3-甲基-环己烯-1-酮溶于二甲基亚砜配成1M，取25μL加入反应体系，使底物浓度为25mM，于25℃下反应30min后，经GC监测生成(R)-3-甲基环己酮，且反应转化率为90％，ee值大于等于99％。HRMS(ESI):m/z calc.for C7H12O[M+K]+:151.0520,found:151.0522.
实施例5
将1mL，0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的NCR置于10mL茄形瓶中，将3-甲基-环己烯-1-酮溶于二甲基亚砜配成1M，取20μL加入反应体系，使底物浓度为20mM，于20℃下反应30min后，经GC监测生成(R)-3-甲基环己酮，反应转化率为93％，ee值大于等于99％。HRMS(ESI):m/z calc.for C7H12O[M+Na]+:135.0780,found:135.0781.
实施例6
将1mL，0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的NCR置于10mL茄形瓶中，将3-甲基-环己烯-1-酮溶于二甲基亚砜配成1M，取20μL加入反应体系，使底物浓度为20mM，于30℃下反应30min后，经GC监测生成(R)-3-甲基环己酮，反应转化率为95％，ee值大于等于99％。HRMS(ESI):m/z calc.for C7H12O[M+Na]+:135.0780,found:135.0785.
实施例7
将1mL，0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的NCR置于10mL茄形瓶中，将3-甲基-环己烯-1-酮溶于二甲基亚砜配成1M，取20μL加入反应体系，使底物浓度为20mM，于25℃下反应30min后，用乙酸乙酯萃取，保留有机相，真空浓缩得(R)-3-甲基环己酮，加20μL二甲基亚砜将(R)-3-甲基环己酮溶解后，向体系内加入0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的环己酮单加氧酶，25℃下反应1h后，经GC监测生成(R)-5-甲基-ε-己内酯。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ4.10(1H,dt,J)12,1.2Hz),4.00(1H,dd J)12,8Hz),2.65(1H,t,J)3Hz),2.61(1H,t,J)16Hz),1.94(1H,m),1.86(1H,m),1.67(1H,m),1.38(2H,m),0.98(3H,d,J)20Hz)ppm.13C NMR(100MHz,CDCl3)δ176.0,73.9,36.9,34.4,33.8,21.6,17.7ppm.HRMS(ESI):m/z calc.for C7H12O2[M+K]+:167.0469,found:167.0465.
实施例8
将1mL，0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的NCR、1mL，0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的环己酮单加氧酶置于10mL茄形瓶中，将3-甲基-环己烯-1-酮溶于二甲基亚砜配成1M，取20μL加入反应体系，使底物浓度为20mM，于25℃下反应1h后，经GC监测生成(R)-5-甲基-ε-己内酯，且反应转化率大于等于99％，ee值大于等于99％。HRMS(ESI):m/z calc.for C7H12O2[M+K]+:167.0469,found:167.0466.
实施例9
将1mL，0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的NCR、1mL，0.075g湿细胞/mL全细胞状态下的环己酮单加氧酶置于10mL茄形瓶中，将3-甲基-环己烯-1-酮溶于二甲基亚砜配成1M，取20μL加入反应体系，使底物浓度为20mM，于25℃下反应1h后，经GC监测生成(R)-5-甲基-ε-己内酯，且反应转化率大于等于99％，ee值大于等于99％。HRMS(ESI):m/z calc.forC7H12O2[M+K]+:167.0469,found:167.0468.
实施例10
将1mL，0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的NCR、1mL，0.05g湿细胞/mL全细胞状态下的环己酮单加氧酶置于10mL茄形瓶中，将3-甲基-环己烯-1-酮溶于二甲基亚砜配成1M，取20μL加入反应体系，使底物浓度为20mM，于25℃下反应1h后，经GC监测生成(R)-5-甲基-ε-己内酯，且反应转化率大于等于99％，ee值大于等于99％。HRMS(ESI):m/z calc.for C7H12O2[M+Na]+:151.0730,found:151.0728.
实施例11
将1mL，0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的NCR、1mL，0.025g湿细胞/mL全细胞状态下的环己酮单加氧酶置于10mL茄形瓶中，将3-甲基-环己烯-1-酮溶于二甲基亚砜配成1M，取20μL加入反应体系，使底物浓度为20mM，于25℃下反应1h后，经GC监测生成(R)-5-甲基-ε-己内酯，且反应转化率为85％，ee值大于等于99％。HRMS(ESI):m/z calc.for C7H12O2[M+Na]+:151.0730,found:151.0735.
实施例12
将25mL，0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的NCR、25mL，0.05g湿细胞/mL全细胞状态下的环己酮单加氧酶置于250mL茄形瓶中，将55mg的3-甲基-环己烯-1-酮溶于二甲基亚砜配成1M后加入反应体系，使底物浓度为20mM，于25℃下反应1h后，经GC监测反应完成后，取反应液，用乙酸乙酯萃取三次，留有机相，经无水硫酸镁干燥后，真空浓缩得54mg的(R)-5-甲基-ε-己内酯。将8mg的诺维信435小球颗粒填充到内径为2mm的聚四氟乙烯管道中，将54mg的(R)-5-甲基-ε-己内酯与482μL底正丁醇作为引发剂(底物摩尔量的八十分之一)溶于5mL甲苯，置于原料储罐，注射器注射入微反应装置中，反应温度为60℃，控制流速，反应约40min后，产率高达92％，经GPC监测聚合物数均分子量约为12500，核磁如图3和图4所示。
实施例13
将25mL，0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的NCR、25mL，0.05g湿细胞/mL全细胞状态下的环己酮单加氧酶置于250mL茄形瓶中，将55mg的3-甲基-环己烯-1-酮溶于二甲基亚砜配成1M后加入反应体系，使底物浓度为20mM，于25℃下反应1h后，经GC监测反应完成后，取反应液，用乙酸乙酯萃取三次，留有机相，经无水硫酸镁干燥后，真空浓缩得54mg的(R)-5-甲基-ε-己内酯。将8mg的诺维信435小球颗粒填充到内径为2mm的聚四氟乙烯管道中，将54mg的(R)-5-甲基-ε-己内酯与386μL底正丁醇作为引发剂(底物摩尔量的百分之一)溶于5mL甲苯，置于原料储罐，注射器注射入微反应装置中，反应温度为60℃，控制流速，反应约40min后，产率高达95％，经GPC监测聚合物数均分子量约为16500。
实施例14
将25mL，0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的NCR、25mL，0.05g湿细胞/mL全细胞状态下的环己酮单加氧酶置于250mL茄形瓶中，将55mg的3-甲基-环己烯-1-酮溶于二甲基亚砜配成1M后加入反应体系，使底物浓度为20mM，于25℃下反应1h后，经GC监测反应完成后，取反应液，用乙酸乙酯萃取三次，留有机相，经无水硫酸镁干燥后，真空浓缩得54mg的(R)-5-甲基-ε-己内酯。将8mg的诺维信435小球颗粒填充到内径为2mm的聚四氟乙烯管道中，将54mg的(R)-5-甲基-ε-己内酯与321μL底正丁醇作为引发剂(底物摩尔量的一百二十分之一)溶于5mL甲苯，置于原料储罐，注射器注射入微反应装置中，反应温度为60℃，控制流速，反应约40min后，产率为95％，经GPC监测聚合物数均分子量约为17257(图5)。
实施例15
将25mL，0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的NCR、25mL，0.05g湿细胞/mL全细胞状态下的环己酮单加氧酶置于250mL茄形瓶中，将55mg的3-甲基-环己烯-1-酮溶于二甲基亚砜配成1M后加入反应体系，使底物浓度为20mM，于25℃下反应1h后，经GC监测反应完成后，取反应液，用乙酸乙酯萃取三次，留有机相，经无水硫酸镁干燥后，真空浓缩得54mg的(R)-5-甲基-ε-己内酯。将8mg的诺维信435小球颗粒填充到内径为2mm的聚四氟乙烯管道中，将54mg的(R)-5-甲基-ε-己内酯与321μL底正丁醇作为引发剂(底物摩尔量的一百二十分之一)溶于5mL甲苯，置于原料储罐，注射器注射入微反应装置中，反应温度为60℃，控制流速，反应约30min后，产率为90％，经GPC监测聚合物数均分子量约为15900。
实施例16
将25mL，0.1g湿细胞/mL全细胞状态下的NCR、25mL，0.05g湿细胞/mL全细胞状态下的环己酮单加氧酶置于250mL茄形瓶中，将55mg的3-甲基-环己烯-1-酮溶于二甲基亚砜配成1M后加入反应体系，使底物浓度为20mM，于25℃下反应1h后，经GC监测反应完成后，取反应液，用乙酸乙酯萃取三次，留有机相，经无水硫酸镁干燥后，真空浓缩得54mg的(R)-5-甲基-ε-己内酯。将8mg的诺维信435小球颗粒填充到内径为2mm的聚四氟乙烯管道中，将54mg的(R)-5-甲基-ε-己内酯与321μL底正丁醇作为引发剂(底物摩尔量的一百二十分之一)溶于5mL甲苯，置于原料储罐，注射器注射入微反应装置中，反应温度为60℃，控制流速，反应约50min后，产率为95％，经GPC监测聚合物数均分子量约为17000。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种利用微通道反应装置通过三酶催化合成聚-(R)-5-甲基-ε-己内酯的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1101
<212> DNA
<213> NCR
<400> 1
atgccgagcc tgtttgaccc gattcgtttt ggtgccttta ccgccaaaaa tcgtatttgg 60
atggccccgt taacccgtgg tagagccacc cgtgaccacg ttcccaccga aattatggcc 120
gaatattatg cccagcgtgc atcagcgggt ttaattatca gcgaagcaac cggtattagc 180
caggaagggc tgggttggcc gtatgcacct ggaatttgga gcgacgcaca ggttgaagcg 240
tggctgccga taacacaagc cgttcatgat gccgggggac tgatattcgc acagctgtgg 300
cacatgggtc gtatggttcc ctcaaatgtt agtggtatgc agcctgttgc gccgagtgcg 360
tcacaggcac cgggtttagg tcacacctat gatggaaaaa aaccgtatga tgttgcacgt 420
gcactgcgtc tggatgaaat tccgcgtctg ctggatgatt atgaaaaagc agcacgtcat 480
gcactgaaag caggttttga tggtgttcag attcatgcag caaatggtta tctgattgat 540
gaatttattc gtgatagcac caatcatcgt catgatgaat atggtggtgc agttgaaaat 600
cgtattcgtc tgctgaaaga tgttaccgaa cgtgttattg caaccattgg taaagaacgt 660
accgcagttc gtctgagccc gaatggtgaa attcagggta ccgttgatag ccatccggaa 720
caggttttta ttccggcagc aaaaatgctg agcgatctgg atattgcatt tctgggtatg 780
cgtgaaggtg cagttgatgg tacctttggt aaaaccgatc agccgaaact gagcccggaa 840
attcgtaaag tttttaaacc gccgctggtt ctgaatcagg attatacctt tgaaaccgca 900
caggcagcac tggatagcgg tgttgcagat gcaattagct ttggtcgtcc gtttattggt 960
aatccggatc tgccgcgtcg tttttttgaa aaagcaccgc tgaccaaaga tgttattgaa 1020
acctggtata cccagacccc gaaaggttat accgattatc cgctgctggg tgatctggaa 1080
catcatcatc atcatcatta a 1101
<210> 2
<211> 1632
<212> DNA
<213> CHMO
<400> 2
atgtcacaaa aaatggattt tgatgctatc gtgattggtg gtggttttgg cggactttat 60
gcagtcaaaa aattaagaga cgagctcgaa cttaaggttc aggcttttga taaagccacg 120
gatgtcgcag gtacttggta ctggaaccgt tacccaggtg cattgacgga tacagaaacc 180
cacctctact gctattcttg ggataaagaa ttactacaat cgctagaaat caagaaaaaa 240
tatgtgcaag gccctgatgt acgcaagtat ttacagcaag tggctgaaaa gcatgattta 300
aagaagagct atcaattcaa taccgcggtt caatcggctc attacaacga agcagatgcc 360
ttgtgggaag tcaccactga atatggtgat aagtacacgg cgcgtttcct catcactgct 420
ttaggcttat tgtctgcgcc taacttgcca aacatcaaag gcattaatca gtttaaaggt 480
gagctgcatc ataccagccg ctggccagat gacgtaagtt ttgaaggtaa acgtgtcggc 540
gtgattggta cgggttccac cggtgttcag gttattacgg ctgtggcacc tctggctaaa 600
cacctcactg tcttccagcg ttctgcacaa tacagcgttc caattggcaa tgatccactg 660
tctgaagaag atgttaaaaa gatcaaagac aattatgaca aaatttggga tggtgtatgg 720
aattcagccc ttgcctttgg cctgaatgaa agcacagtgc cagcaatgag cgtatcagct 780
gaagaacgca aggcagtttt tgaaaaggca tggcaaacag gtggcggttt ccgtttcatg 840
tttgaaactt tcggtgatat tgccaccaat atggaagcca atatcgaagc gcaaaatttc 900
attaagggta aaattgctga aatcgtcaaa gatccagcca ttgcacagaa gcttatgcca 960
caggatttgt atgcaaaacg tccgttgtgt gacagtggtt actacaacac ctttaaccgt 1020
gacaatgtcc gtttagaaga tgtgaaagcc aatccgattg ttgaaattac cgaaaacggt 1080
gtgaaactcg aaaatggcga tttcgttgaa ttagacatgc tgatatgtgc cacaggtttt 1140
gatgccgtcg atggcaacta tgtgcgcatg gacattcaag gtaaaaacgg cttggccatg 1200
aaagactact ggaaagaagg tccgtcgagc tatatgggtg tcaccgtaaa taactatcca 1260
aacatgttca tggtgcttgg accgaatggc ccgtttacca acctgccgcc atcaattgaa 1320
tcacaggtgg aatggatcag tgataccatt caatacacgg ttgaaaacaa tgttgaatcc 1380
attgaagcga caaaagaagc ggaagaacaa tggactcaaa cttgcgccaa tattgcggaa 1440
atgaccttat tccctaaagc gcaatcctgg atttttggtg cgaatatccc gggcaagaaa 1500
aacacggttt acttctatct cggtggttta aaagaatatc gcagtgcgct agccaactgc 1560
aaaaaccatg cctatgaagg ttttgatatt caattacaac gttcagatat caagcaacct 1620
gccaatgcct aa 1632
Claims (6)
1.一种利用微通道反应装置通过三酶催化合成聚-(R)-5-甲基-ε-己内酯的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：以3-甲基-2-环己烯-1-酮为原料，利用烯还原酶和环己酮单加氧酶为生物催化剂，得(R)-5-甲基-ε-己内酯；所述烯还原酶为将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的烯还原酶基因构建到pET22b（+）载体上，并转入到大肠杆菌中，培养所得的全细胞状态的烯还原酶；
S2：利用诺维信435脂肪酶为生物催化剂，将(R)-5-甲基-ε-己内酯、溶剂和引发剂的混合溶液于微通道反应装置中聚合，得聚-(R)-5-甲基-ε-己内酯；
步骤S1中，所述环己酮单加氧酶为将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的环己酮单加氧酶基因构建到pET22b（+）载体上，并转入到大肠杆菌中，培养所得的全细胞状态的环己酮单加氧酶；
步骤S1中，所述3-甲基-2-环己烯-1-酮、烯还原酶、环己酮的用量比为0.01~0.02mmol:0.1 g湿细胞:0.025~0.15 g湿细胞；
步骤S1中，反应的温度为25~35 ℃；
步骤S2中，所述溶剂为有机溶剂；所述引发剂为醇类；所述混合溶液中，所述(R)-5-甲基-ε-己内酯、溶剂和引发剂的用量比为54 mg:(301~502) μL: (1~9) mL；
步骤S2中，反应的温度为40~80 ℃；
其中，所述聚-(R)-5-甲基-ε-己内酯的数均分子量为7500~18550。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1为以下方式中的任意一种：
S11. 将3-甲基-2-环己烯-1-酮与烯还原酶和环己酮单加氧酶进行级联反应制得(R)-5-甲基-ε-己内酯；
S12. 将3-甲基-2-环己烯-1-酮先与烯还原酶进行第一反应制得(R)-3-甲基环己酮，再与环己酮单加氧酶进行第二反应制得(R)-5-甲基-ε-己内酯。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述烯还原酶分散于缓冲液中参与反应，所述烯还原酶的浓度为0.05~0.15 g湿细胞/mL缓冲液；所述环己酮单加氧酶分散于缓冲液中参与反应，所述环己酮单加氧酶的浓度为0.005~0.105 g湿细胞/mL缓冲液。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S1中，反应的溶剂为有机溶剂，所述有机溶剂为甲醇、乙腈、二甲基亚砜、异丙醇中的任意一种或几种组合；所述3-甲基-2-环己烯-1-酮与有机溶剂的用量比为0.2~1.8 M。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述诺维信435脂肪酶的填充量为(R)-5-甲基-ε-己内酯质量的10%~15%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述微通道反应装置中微反应器的内径为1~3 mm。
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| CN (1) | CN114317624B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015113848A1 (en) * | 2014-01-28 | 2015-08-06 | Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald | Process for the enzymatic production of oligo-/polyesters |
| CN105969816A (zh) * | 2016-05-06 | 2016-09-28 | 南京工业大学 | 一种利用微反应装置制备巯基功能化聚内酯的方法 |
| CN113584099A (zh) * | 2021-07-28 | 2021-11-02 | 南京先进生物材料与过程装备研究院有限公司 | 一种采用微流场反应技术制备二氢香豆素或其衍生物的方法 |
-
2021
- 2021-12-02 CN CN202111457609.8A patent/CN114317624B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015113848A1 (en) * | 2014-01-28 | 2015-08-06 | Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald | Process for the enzymatic production of oligo-/polyesters |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| An enzyme cascade synthesis of ε-caprolactone and its oligomers;Sandy Schmidt 等;Angew Chem Int Ed Engl;第54卷(第9期);摘要、Scheme 1、附加材料 * |
| 烯键还原酶的表达及应用研究;肖文华;中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑;第4.4.3节 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114317624A (zh) | 2022-04-12 |
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