CN114317615A - 一种制备微生物絮凝剂的方法 - Google Patents

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朱希坤
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孙松厚
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张志平
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Abstract

本发明提供了一种制备微生物絮凝剂的方法，包括以下步骤：第一步，配制浓度为1×106~1×107 CFU/mL酱油曲霉孢子悬浮液。第二步，取10μL孢子悬浮液涂布于载片上，干后，将载片放到ARTP诱变育种仪内，诱变功率设定为120~150 W，气流量设定为8~10 SLM，诱变处理时间设定为30 s~40 s。第三步，将诱变后的酱油曲霉孢子接种于发酵培养基中，按照3~5%的接种量接种，于25~30℃，100~130 r/min，振荡培养2~5 d，收集培养液，过滤除去菌体，得到发酵液，再10000 r/min冷冻离心10~15 min，取上清液，即为微生物絮凝剂溶液。本发明方法制备的微生物絮凝剂，絮凝活性大大提高，且具有生物可降解性、无污染、安全高效等特点。

Description

一种制备微生物絮凝剂的方法
技术领域
本发明属于环境生物技术领域，具体地说，涉及污泥脱水技术领域，特别涉及一种制备微生物絮凝剂的方法。
背景技术
随着人口增加，工业生产发展，生活污水与工业污水的排放量日益增多，污泥的产出量大大增加。大量累积的污泥会不仅会占用大量土地面积，污泥中的有害有毒物质、微生物、重金属、以及其中丰富的氮磷元素造成水体富营养化，都会对环境和人类造成危害。
污泥处理是污水处理工艺中不可缺少的重要环节。污水污泥的处理成本较高，占到污水处理成本的20%-50%，甚至更高。如何将污泥处理后使其减量、无害和资源化，是我们需要广泛关注的课题。
污泥含水率很高，一般维持在96%以上，比重较小，呈胶体状态。我们只要将污泥中的水分脱除，使其含水率更低，失去流态，就会大大缩小污泥的体积，这样便于污泥的进一步处理。为了较好达到脱水效果，一般会添加污泥调理剂对污泥进行预处理，其中生物污泥调理剂因安全、无二次污染、絮凝活性高，具有良好的应用前景。
微生物絮凝剂是由微生物细胞成分提取或新陈代谢产生，能使污水中颗粒物、胶体悬浮物、有害物质等微粒发生凝集、沉淀的一类特殊活性有机物，其主要成分为脂类、蛋白质、多糖、核酸等，具有易降解、安全无污染等优点。1981年，欧洲生物技术联盟将控制污染的微生物絮凝剂定为环境生物技术。我国也将开发微生物絮凝剂作为《生物技术中长期发展纲要》的明确方法。微生物的絮凝作用首先是70年代Louis Pasteur在酵母菌中发现的，目前科研工作者已经从不同环境中分离出多种具有絮凝特性的微生物。
目前微生物絮凝剂存在的主要问题是微生物絮凝剂的产量低，稳定、高产的菌株难以获得，导致了生产应用成本加大。如何培育高产絮凝剂菌株及提高絮凝剂絮凝效率，是目前环境微生物的研究方向。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种安全可降解，无二次污染、污泥脱水效率高的微生物絮凝剂的制备方法。
技术方案：
一种微生物絮凝剂的制备方法，包括以下步骤，
1．配制浓度为1×106~1×107 CFU/mL酱油曲霉孢子悬浮液；
2．取10 μL孢子悬浮液涂布于载片上，干后，将载片放到ARTP诱变育种仪内，诱变功率设定为120~150 W，气流量设定为8~10 SLM，诱变处理时间设定为30 s~40 s；
3．将诱变后的酱油曲霉孢子接种于发酵培养基中，按照3~5%的接种量接种，于25~30℃，100~130 r/min，振荡培养2~5 d，收集培养液，过滤除去菌体，得到发酵液，再10000 r/min冷冻离心10~15 min，取上清液，即为微生物絮凝剂溶液。
具体地，包括以下步骤：
1. 配制浓度为1×107 CFU/mL酱油曲霉孢子悬浮液；
2. 取10 μL孢子悬浮液涂布于载片上，干后，将载片放到ARTP诱变育种仪内，诱变功率设定为120 W，气流量设定为10 SLM，诱变处理时间设定为30 s；
3. 将诱变后的酱油曲霉孢子接种于发酵培养基中，按照4%的接种量接种，于28℃，130r/min，振荡培养3 d，收集培养液，过滤除去菌体，得到发酵液，再10000 r/min冷冻离心15min，即为微生物絮凝剂溶液。
所述发酵培养基中含有蔗糖10~20 g/L、（NH4）2 SO4 3~6 g/L、KH2PO4 0.05~0.1 g/L、FeSO4·7H2O 0.2~0.4 g/L、NaCl 0.1~0.3 g/L，pH 6.0~6.8。
优选地，发酵培养基中含有蔗糖15 g/L、（NH4）2 SO4 4 g/L、KH2PO4 0.08 g/L、FeSO4·7H2O 0.3 g/L、NaCl 0.1 g/L，pH 6.5。
本发明的另一个目的是提供一种将前述制备的微生物絮凝剂应用在污泥脱水中的方法。
本发明有益效果：
常温室压等离子体（ARTP）诱变技术是近年来开发应用的一种新生物育种技术，利用激发态物质在强电场中产生的等离子体使生物细胞内遗传物质突变，从而让生物体产生新性状和稳定遗传的特性。具有辐射均匀，工作温度低、操作简便安全等特点。本发明采用ARTP技术对酱油曲霉进行诱变，再用诱变菌制备微生物絮凝剂，本发明微生物絮凝剂的絮凝活性大大提高，产剂量高，稳定性强，具有生物可降解性，安全高效，本发明微生物絮凝剂对5%高岭土混悬液的絮凝率均达到90%以上。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明试剂如无特别说明，均为常规试剂，均可由市场购买得到。
实施例1
取斜面保存的酱油曲霉(沪酿3.042)划线接种于LB固体培养基上，于30℃培养3 d，待平板表面长满酱油曲霉菌体，用接种环取轻轻刮取孢子，用无菌水洗脱至的锥形瓶中，室温振荡10 min使孢子充分分散，用脱脂棉脱除菌丝和成团的孢子，通过血球计数板计算酱油曲霉孢子浓度，调整孢子悬浮液终浓度为1×107 CFU/mL。
取10 μL孢子悬浮液均匀涂布于载片上，风干，将载片放到ARTP诱变育种仪（产自无锡源清天木生物科技有限公司）内，诱变条件为诱变功率120 W，诱变气流量为8 SLM，诱变处理时间为30 s。设定辐照距离为2mm。诱变结束后，将载片转移至装有无菌水的EP管中，振荡形成新的酱油曲霉孢子悬液。
将上述酱油曲霉孢子悬液接种于1 L发酵培养基中，按照3%的接种量接种，于25℃，100 r/min，振荡培养2 d，收集培养液。用纱布将培养液中菌体过滤除去，得发酵液，再10000 r/min冷冻离心10 min，取上清液。
发酵培养基中含有蔗糖20 g/L、（NH4）2 SO4 3 g/L、KH2PO4 0.05 g/L、FeSO4·7H2O0.2 g/L、NaCl 0.3 g/L，pH 6.8。
对照组微生物絮凝剂：没有经过ARTP诱变步骤，其余与本实施例制备参数条件步骤相同。
上述方法制备的微生物絮凝剂絮凝能力的测定：
取3 mL上述微生物絮凝剂溶液加入96 mL 0.5%的高岭土悬液中，以1% CaCl2作为助凝剂，调节pH至6.5，300 r/min搅拌15 min，静置10 min。以对照组微生物絮凝剂滴加对照，吸取液面1 cm处的液体，用UV-754型紫外分光光度计在波长550nm处测定吸光度值，计算微生物絮凝剂对高岭土悬液的絮凝率，计算公式为：
絮凝率=（对照的OD550nm值-样品的OD550nm值/对照的OD550nm值）×100%。
测得本实施例微生物絮凝剂对高岭土悬液的絮凝率为96%；对照组微生物絮凝剂对高岭土悬液的絮凝率为88%。
实施例2
取斜面保存的酱油曲霉划线接种于LB固体培养基上，于30℃培养3 d，待平板表面长满酱油曲霉菌体，用接种环取轻轻刮取孢子，用无菌水洗脱至的锥形瓶中，室温振荡10 min使孢子充分分散，用脱脂棉脱除菌丝和成团的孢子，通过血球计数板计算酱油曲霉孢子浓度，调整孢子悬浮液终浓度为1×106 CFU/mL。
取10 μL孢子悬浮液均匀涂布于载片上，风干，将载片放到ARTP诱变育种仪内，诱变条件为诱变功率150 W，诱变气流量为10 SLM，诱变处理时间为35 s。设定辐照距离2mm，诱变结束后，将载片转移至装有无菌水的EP管中，振荡形成新的酱油曲霉孢子悬液。
将上述酱油曲霉孢子悬液接种于1 L发酵培养基中，按照4%的接种量接种，于30℃，100 r/min，振荡培养5 d，收集培养液。用纱布将培养液中菌体过滤除去，得发酵液，再10000 r/min冷冻离心10 min，取上清液。
发酵培养基中含有蔗糖10 g/L、（NH4）2 SO4 6 g/L、KH2PO4 0.1 g/L、FeSO4·7H2O0.4 g/L、NaCl 0.1 g/L，pH 6.0。
对照组微生物絮凝剂：没有经过ARTP诱变步骤，其余与本实施例制备参数条件步骤相同。
上述方法制备的微生物絮凝剂絮凝能力的测定：
取3 mL上述微生物絮凝剂溶液加入96 mL 0.5%的高岭土悬液中，以1% CaCl2作为助凝剂，调节pH至6.5，300 r/min搅拌15 min，静置10 min。以对照组微生物絮凝剂滴加对照，吸取液面1 cm处的液体，用UV-754型紫外分光光度计在波长550nm处测定吸光度值，计算微生物絮凝剂对高岭土悬液的絮凝率。
测得本实施例微生物絮凝剂对高岭土悬液的絮凝率为97%；对照组微生物絮凝剂对高岭土悬液的絮凝率为85%。
实施例3
取斜面保存的酱油曲霉划线接种于LB固体培养基上，于30℃培养3 d，待平板表面长满酱油曲霉菌体，用接种环取轻轻刮取孢子，用无菌水洗脱至的锥形瓶中，室温振荡10 min使孢子充分分散，用脱脂棉脱除菌丝和成团的孢子，通过血球计数板计算酱油曲霉孢子浓度，调整孢子悬浮液终浓度为1×107 CFU/mL。
取10 μL孢子悬浮液均匀涂布于载片上，风干，将载片放到ARTP诱变育种仪内，诱变条件为诱变功率120 W，诱变气流量为10 SLM，诱变处理时间为30 s。设定辐照距离2mm，诱变结束后，将载片转移至装有无菌水的EP管中，振荡形成新的酱油曲霉孢子悬液。
将上述酱油曲霉孢子悬液接种于1 L发酵培养基中，按照4%的接种量接种，于28℃，130 r/min，振荡培养3 d，收集培养液。用纱布将培养液中菌体过滤除去，得发酵液，再10000 r/min冷冻离心15 min，取上清液。
发酵培养基中含有蔗糖15 g/L、（NH4）2 SO4 4 g/L、KH2PO4 0.08 g/L、FeSO4·7H2O0.3 g/L、NaCl 0.1 g/L，pH 6.5。
对照组微生物絮凝剂：没有经过ARTP诱变步骤，其余与本实施例制备参数条件步骤相同。
上述方法制备的微生物絮凝剂絮凝能力的测定：
取3 mL上述微生物絮凝剂溶液加入96 mL 0.5%的高岭土悬液中，以1% CaCl2作为助凝剂，调节pH至6.5，300 r/min搅拌15 min，静置10 min。以对照组微生物絮凝剂滴加对照，吸取液面1 cm处的液体，用UV-754型紫外分光光度计在波长550nm处测定吸光度值，计算微生物絮凝剂对高岭土悬液的絮凝率。
测得本实施例微生物絮凝剂对高岭土悬液的絮凝率为99%；对照组微生物絮凝剂对高岭土悬液的絮凝率为90%。
实施例4
取斜面保存的酱油曲霉划线接种于LB固体培养基上，于30℃培养3 d，待平板表面长满酱油曲霉菌体，用接种环取轻轻刮取孢子，用无菌水洗脱至的锥形瓶中，室温振荡10 min使孢子充分分散，用脱脂棉脱除菌丝和成团的孢子，通过血球计数板计算酱油曲霉孢子浓度，调整孢子悬浮液终浓度为1×107 CFU/mL。
取10 μL孢子悬浮液均匀涂布于载片上，风干，将载片放到ARTP诱变育种仪内，诱变条件为诱变功率120 W，诱变气流量为10 SLM，诱变处理时间为40 s。辐照距离2mm，诱变结束后，将载片转移至装有无菌水的EP管中，振荡形成新的酱油曲霉孢子悬液。
将上述酱油曲霉孢子悬液接种于1 L发酵培养基中，按照4%的接种量接种，于28℃，130 r/min，振荡培养3 d，收集培养液。用纱布将培养液中菌体过滤除去，得发酵液，再10000 r/min冷冻离心15 min，取上清液。
发酵培养基中含有蔗糖15 g/L、（NH4）2 SO4 4 g/L、KH2PO4 0.08 g/L、FeSO4·7H2O0.3 g/L、NaCl 0.1 g/L，pH 6.5。
对照组微生物絮凝剂：为本实施例3制备的微生物絮凝剂，诱变处理时间不同。
上述方法制备的微生物絮凝剂絮凝能力的测定：
取3 mL上述微生物絮凝剂溶液加入96 mL 0.5%的高岭土悬液中，以1% CaCl2作为助凝剂，调节pH至6.5，300 r/min搅拌15 min，静置10 min。以本发明实施例3作为对照组，吸取液面1 cm处的液体，用UV-754型紫外分光光度计在波长550nm处测定吸光度值，计算微生物絮凝剂对高岭土悬液的絮凝率。
测得本实施例微生物絮凝剂对高岭土悬液的絮凝率为94%。
实施例5
取斜面保存的酱油曲霉划线接种于LB固体培养基上，于30℃培养3 d，待平板表面长满酱油曲霉菌体，用接种环取轻轻刮取孢子，用无菌水洗脱至的锥形瓶中，室温振荡10 min使孢子充分分散，用脱脂棉脱除菌丝和成团的孢子，通过血球计数板计算酱油曲霉孢子浓度，调整孢子悬浮液终浓度为1×107 CFU/mL。
取10 μL孢子悬浮液均匀涂布于载片上，风干，将载片放到ARTP诱变育种仪内，诱变条件为诱变功率120 W，诱变气流量为10 SLM，诱变处理时间为30 s。辐照距离2mm，诱变结束后，将载片转移至装有无菌水的EP管中，振荡形成新的酱油曲霉孢子悬液。
将上述酱油曲霉孢子悬液接种于1 L发酵培养基中，按照4%的接种量接种，于28℃，130 r/min，振荡培养3 d，收集培养液。用纱布将培养液中菌体过滤除去，得发酵液，再10000 r/min冷冻离心15 min，取上清液。
发酵培养基中为天然原麦汁培养基。
对照组微生物絮凝剂：实施例3制备的微生物絮凝剂，发酵培养基不同。
上述方法制备的微生物絮凝剂絮凝能力的测定：
取3 mL上述微生物絮凝剂溶液加入96 mL 0.5%的高岭土悬液中，以1% CaCl2作为助凝剂，调节pH至6.5，300 r/min搅拌15 min，静置10 min。以实施例3絮凝剂作为对照，吸取液面1 cm处的液体，用UV-754型紫外分光光度计在波长550nm处测定吸光度值，计算微生物絮凝剂对高岭土悬液的絮凝率。
测得本实施例微生物絮凝剂对高岭土悬液的絮凝率为82%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于，包括以下步骤，
（1）配制浓度为1×106~1×107 CFU/mL酱油曲霉孢子悬浮液；
（2）取10 μL孢子悬浮液涂布于载片上，干后，将载片放到ARTP诱变育种仪内，诱变功率设定为120~150 W，气流量设定为8~10 SLM，诱变处理时间设定为30 s~40 s；
（3）将诱变后的酱油曲霉孢子接种于发酵培养基中，按照3~5%的接种量接种，于25~30℃，100~130 r/min，振荡培养2~5 d，收集培养液，过滤除去菌体，得到发酵液，再10000 r/min冷冻离心10~15 min，取上清液，即为微生物絮凝剂溶液。
2.如权利要求1所述的制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）配制浓度为1×107CFU/mL酱油曲霉孢子悬浮液；
（2）取10 μL孢子悬浮液涂布于载片上，干后，将载片放到ARTP诱变育种仪内，诱变功率设定为120 W，气流量设定为10 SLM，诱变处理时间设定为30 s；
（3）将诱变后的酱油曲霉孢子接种于发酵培养基中，按照4%的接种量接种，于28℃，130r/min，振荡培养3 d，收集培养液，过滤除去菌体，得到发酵液，再10000 r/min冷冻离心15min，即为微生物絮凝剂溶液。
3.如权利要求1或2所述的制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于：发酵培养基中含有蔗糖10~20 g/L、（NH4）2 SO4 3~6 g/L、KH2PO4 0.05~0.1 g/L、FeSO4·7H2O 0.2~0.4 g/L、NaCl 0.1~0.3 g/L，pH 6.0~6.8。
4.如权利要求3所述的制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于：发酵培养基中含有蔗糖15 g/L、（NH4）2 SO4 4 g/L、KH2PO4 0.08 g/L、FeSO4·7H2O 0.3 g/L、NaCl 0.1 g/L，pH 6.5。
5.一种将权利要求1-4任一项制备的微生物絮凝剂应用在污泥脱水中的方法。
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