CN114317344A - 一种屎肠球菌及其应用、组合物与屎肠球菌的发酵培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种屎肠球菌及其应用、组合物与屎肠球菌的发酵培养方法，所述屎肠球菌的名称为HSC‑18，分类名称为：Enterococcus faecium，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211446，保藏日期为：2021年11月18日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，该屎肠球菌能够用于制备饲料添加剂、动物饲料、食品添加剂、食品或益生菌剂；该组合物的活性成分包括屎肠球菌HSC‑18，所述组合物为饲料添加剂、动物饲料、食品添加剂、食品或益生菌剂；所述屎肠球菌的发酵培养方法是将屎肠球菌接种于一种屎肠球菌发酵培养基中，在35℃至40℃和pH为5.8至7.0的条件下发酵培养10h至20h。

Description

一种屎肠球菌及其应用、组合物与屎肠球菌的发酵培养方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种屎肠球菌及其应用、组合物与屎肠球菌的发酵培养方法。

背景技术

屎肠球菌(Enterococcus faecium)属于肠球菌属，屎肠球菌为兼性厌氧的革兰氏阳性菌，呈椭圆形或球杆状，无芽孢且无鞭毛。因屎肠球菌能发酵产乳酸，所以屎肠球菌归属于乳酸菌类。屎肠球菌是一种益生微生物，存在于人及动物的肠道中，屎肠球菌发酵产生的乳酸能够有效降低肠道环境的pH值，抑制致病菌的生长；屎肠球菌还能够发酵产生抑菌物质，例如过氧化氢、细菌素等，对肠道中致病菌及腐败菌具有一定的杀灭效果，能够预防或辅助治疗腹泻，并促进营养物质的消化吸收，从而改善肠道的微生态平衡，提高机体的免疫力；此外，屎肠球菌能够附着于肠道粘膜上并形成生物薄膜，以抵御外界病原菌的入侵。屎肠球菌因其益生特性在动物饲料领域应用广泛。

现有的屎肠球菌多来源于商购的工业菌株和标准菌株，不一定适应人体或动物的肠道环境，并且不同株的屎肠球菌性能差异较大，所以筛选获得一株综合性能优异且适应肠道环境的屎肠球菌具有重要意义。在屎肠球菌的传统发酵生产中，多选用MRS培养基进行发酵培养，具有成本高的缺点，并且采用传统发酵方法生产屎肠球菌具有活菌数较低的问题，因此，研发一种适用于屎肠球菌的发酵培养方法以降低生产成本并提高活菌产量，对推进屎肠球菌发酵的工业化具有重大意义与价值。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明提供了一种屎肠球菌及其应用、组合物与屎肠球菌的发酵培养方法。

本发明的技术方案如下所述：

第一方面，本申请提供了一种屎肠球菌，所述屎肠球菌的名称为HSC-18，分类名称为：Enterococcus faecium，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211446，保藏日期为：2021年11月18日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心。

第二方面，本申请提供了如第一方面中所述的屎肠球菌在制备饲料添加剂、动物饲料、食品添加剂、食品或益生菌剂中的应用。

第三方面，本申请提供了一种组合物，所述组合物的活性成分包括如第一方面中所述的屎肠球菌。

进一步地，所述组合物为饲料添加剂、动物饲料、食品添加剂、食品或益生菌剂。

进一步地，所述组合物还包括一种或多种辅料。

进一步地，所述组合物还包括一种或多种益生微生物。

第四方面，本申请提供了一种屎肠球菌发酵培养基，按照质量份数计算，所述屎肠球菌发酵培养基包括：10份至20份的红糖、23份至60份的氮源以及1.4份至5份的无机盐。

进一步地，按照质量份数计算，所述氮源包括：12份至35份的酵母提取物、10份至20份的蛋白胨以及1.0份至5.0份的硫酸铵。

进一步地，按照质量份数计算，所述无机盐包括：0.5份至1.0份的七水硫酸镁、0.02份至0.5份的磷酸二氢钾、0.1份至0.5份的碳酸氢钠、0.3份至1.0份的氯化钾以及0.5份至2.0份的碳酸钙。

第五方面，本申请提供了一种屎肠球菌的发酵培养方法，包括步骤：将屎肠球菌的种子液接种于如第四方面中任意一种所述的屎肠球菌发酵培养基中，在35℃至40℃和pH为5.8至7.0的条件下发酵培养10h至20h。

本申请提供了一种屎肠球菌及其应用、组合物与屎肠球菌的发酵培养方法，产生如下的技术效果：

相较于屎肠球菌CICC 20671，本发明的HSC-18屎肠球菌具有更佳的益生特性，具体表现为：屎肠球菌HSC-18对产气荚膜梭菌CP-1、金黄色葡萄球菌S、表皮葡萄球菌Sp、猪链球菌SS-2、猪链球菌SS-9、沙门氏菌Sah以及鸡白痢沙门氏菌SA083均具有理想的抑制效果，而屎肠球菌CICC 20671对产气荚膜梭菌CP-1、表皮葡萄球菌Sp和鸡白痢沙门氏菌SA083均无抑制效果，并且屎肠球菌HSC-18对金黄色葡萄球菌S、猪链球菌SS-2、猪链球菌SS-9以及沙门氏菌Sah的抑制效果明显优于屎肠球菌CICC 20671，此外，HSC-18屎肠球菌的产酸能力、耐高温能力、耐酸能力以及耐胆盐能力均优于屎肠球菌CICC 20671，由动物实验可知，HSC-18屎肠球菌更有助于提高哺乳仔猪的多项生理指标，例如体重、体增重/采食量等，并且显著降低试验仔猪的腹泻率。

本发明中屎肠球菌的发酵培养方法是将屎肠球菌的种子液接种于一种用于培养屎肠球菌的发酵培养基中，并结合特定的发酵过程工艺控制进行发酵生产，改善传统屎肠球菌发酵生产成本高、活菌数较低的问题，当发酵规模为2吨发酵罐时，下罐的发酵液中屎肠球菌的活菌数量可达180亿CFU/mL，极大地提高了屎肠球菌的活菌发酵水平。

附图说明

下面结合附图，通过对本发明的具体实施方式详细描述，将使本发明的技术方案及其它有益效果显而易见。

图1为本申请中屎肠球菌HSC-18和屎肠球菌CICC 20671的抑菌效果图一，其中，A1至A4分别代表屎肠球菌HSC-18对CP-1、S、Sp和SS-2的抑制效果图，B1至B4分别代表屎肠球菌CICC 20671对CP-1、S、Sp和SS-2的抑制效果图。

图2为本申请中屎肠球菌HSC-18和屎肠球菌CICC 20671的抑菌效果图二，其中，A5至A7分别代表屎肠球菌HSC-18对SS-9、Sah和SA083的抑制效果图，B5至B7分别代表屎肠球菌CICC 20671对SS-9、Sah和SA083的抑制效果图。

图3为本申请实施例2的发酵过程中碱液消耗量的变化情况图。

图4为本申请实施例2的发酵过程中pH的变化情况图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。

需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。本申请的各个实施例可以以一个范围的型式存在；应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，“10份至20份的红糖”应当认为从10份到20的范围描述已经具体公开子范围，如从10份到13份、从13份到15份、从15份到17份、从18份到20份等，以及所数范围内的单一数字，例如11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份以及20份，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。

一、本发明实施例中涉及的抑菌实验说明。

1.1、抑菌实验中涉及的指示菌

表1指示菌的种类、来源、特性及培养条件

备注：表1中涉及的培养基均购自青岛海博生物技术有限公司，按照厂商条件使用。

1.2、抑菌实验器材

牛津杯：内径为6.0±0.1mm，外径为7.8±0.1mm，高为10.0±0.1mm；

生化培养箱；

CR 22G冷冻高速离心机(Hitachi)。

1.3、抑菌实验方法

S_a、制备屎肠球菌上清液：将置于甘油管保存的屎肠球菌活化接种于MRS琼脂培养基斜面，在37℃下培养24h，然后挑取一环MRS琼脂培养基斜面上生长的菌落接种于MRS肉汤液体培养基中，置于37℃下静置培养直至菌液的OD600为1.3，将培养获得的菌液在12000r/min的转速下离心5min，收集上清液以备用；

S_b、将处于对数生长期的指示菌，其OD₆₀₀达到表2要求，稀释至其使用倍数后涂布于对应的培养基平板上，每种指示菌设置三个平行样；

表2指示菌的对数期OD₆₀₀及使用稀释倍数

名称	编号	对数期OD<sub>600</sub>	稀释倍数	取用量
					产气荚膜梭菌	CP-1	0.86	10<sup>-1</sup>	100μL
金黄色葡萄球菌	S	1.72	10<sup>-3</sup>	100μL
					鸡白痢沙门氏菌	SA083	1.19	10<sup>-4</sup>	100μL
表皮葡萄球菌	Sp	1.42	10<sup>-4</sup>	100μL
					沙门氏菌	Sah	0.98	10<sup>-4</sup>	150μL
猪链球菌	SS-2	0.39	10<sup>-3</sup>	100μL
					猪链球菌	SS-9	0.52	10<sup>-3</sup>	100μL

S_c、在涂布有指示菌的培养基平板上等距离放置四个无菌牛津杯；

S_d、向各个牛津杯中分别加入0.15mL的屎肠球菌上清液，然后置于4℃下扩散24h，再置于37℃下培养24h，采用游标卡尺测量抑菌圈的直径(未扣除牛津杯的直径)，计算每个平板上所有抑菌圈的平均直径值，并拍照记录。

二、本发明实施例中涉及的产酸能力实验说明

2.1、产酸能力实验中涉及的培养基

商购的MRS肉汤培养基。

2.2、产酸能力实验中涉及的器材

pH计。

2.3、实验方法

将置于甘油管保存的供试屎肠球菌活化接种于MRS培养基斜面上，在37℃下培养24h，然后挑取一环MRS培养基斜面上生长的菌落接种于20mL的MRS肉汤液体培养基(盛装于100mL锥形瓶中)，置于37℃下静置培养直至OD₆₀₀为0.8，获得培养液，按照体积比为1％的接种量将培养液转接于20mL的MRS肉汤液体培养基(盛装于100mL的锥形瓶中)，置于37℃静置培养24h后用pH计测定培养液的pH值。

三、本发明实施例中设计的耐高温实验

3.1、耐高温实验中涉及的培养基

商购MRS琼脂培养基。

3.2、实验方法

取10mL的上述2.3中用于测定pH值的菌株培养液，并加入至试管中，检测活菌数，然后置于85℃下水浴加热5min，取加热后的菌株培养液进行活菌检测，每种菌株三个重复，通过加热前后的活菌数计算存活率。

四、本发明实施例中设计的耐酸实验

4.1、耐酸实验中设计的培养基

商购MRS琼脂培养基。

4.2、实验方法

取100g/L的盐酸16.4mL加蒸馏水稀释，使pH值分别为2.5、3.0和4.0，获得三种盐酸溶液。每种盐酸溶液取100mL，然后分别加入1g胃蛋白酶，使其充分溶解，得模拟胃液，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。取1mL的上述2.3中用于测定pH值的菌株培养液加入至9mL的模拟胃液中(即十倍逐级稀释)，并迅速在振荡器上充分混匀，置于37℃静置培养2h后立即计数残存活菌数，与原活菌数进行比较，计算存活率。

五、本发明实施例中设计的耐胆盐实验

5.1、耐胆盐实验中设计的培养基

商购MRS琼脂培养基。

5.2、实验方法

采用胰液素制成1g/L的溶液，并在溶液中加入0.3％的猪胆盐，用10％的NaOH调整pH为8.0，然后用0.45μm微滤膜过滤并除菌。取1mL的上述2.3中用于测定pH值的菌株培养液加入至9mL的模拟胆盐中，处理2h后计数残存活菌数，与原活菌数进行比较，计算存活率。

六、发明实施例中涉及的动物实验说明

6.1、实验动物

选用若干头21日龄健康状况良好、体重接近的“杜长大”哺乳仔猪，随机分成四个组，每组设置两个重复，每个重复15头仔猪，任意两头仔猪之间的出生日期差异在±1天，且任意两头仔猪之间的体重差异在±0.05kg。免疫程序由工作人员按照常规进行，各个组的饲养管理方式和环境条件均相同，实验周期为21天。

6.2、实验试剂

生理盐水；

混合抗生素溶液，由土霉素钙、金霉素、恩拉霉素以及去离子水组成，其中，土霉素钙的浓度为100ppm，金霉素的浓度为75ppm，恩拉霉素的的浓度为10ppm；

益生菌剂，由供试屎肠球菌和葡萄糖组成，其中，供试屎肠球菌的有效浓度为1.0×10⁹CFU/g；

6.3、实验方法

在实验周期内，每天对对照一组中的各头仔猪灌服生理盐水、对对照二组中的各头仔猪灌服混合抗生素溶液，以及对实验组中的各头仔猪灌服益生菌剂，每次每头仔猪灌服对应试剂的剂量为2mL，每天灌服1次，各个组每次灌服的时间保持一致，记录每头仔猪的初始体重，并每天记录每头仔猪的体重和健康状况，以及计算各个组的21日龄平均体重(Kg/头)、实验周期内的日平均增重(g/d)、实验周期内的日平均采食量(g/d)、体增重/采食量(g/g)以及腹泻率(％)。“21日龄平均体重”是指各组中所有存活仔猪在第21日龄的平均体重，各组取两个重复的平均值，各组中每个重复的所有存活仔猪在第21日龄的平均体重为：所有存活仔猪在第21日龄的总体重/存活头数；“实验周期内的日平均增重”是指各组中在实验周期内存活的所有仔猪在实验周期内的平均日增重，各组取两个重复的平均值，各组的每个重复中在实验周期内存活的所有仔猪在实验周期内的平均日增重的计算公式为：所有存活仔猪在第21日龄的总体重-所有存活仔猪的初始总体重)/(实验天数*存活仔猪头数)；“日平均采食量”是指各组中在实验周期内存活的所有仔猪在实验周期内的平均日采食量；“体增重/采食量”是指各组中在实验周期内存活的所有仔猪在实验周期内的日平均增重/日平均采食量的比值；“腹泻率”是指在实验周期(21天)内，各组中腹泻仔猪的头数占各组中仔猪总头数的百分比。

本发明实施例提供了一种屎肠球菌，所述屎肠球菌的名称为HSC-18，分类名称为：Enterococcus faecium，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211446，保藏日期为：2021年11月18日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心。屎肠球菌HSC-18来源于健康奶牛的牛奶样品。

HSC-18的筛选过程如下：

S1、采集光明牛场的健康奶牛牛奶样品，将牛奶样品与玻璃珠和无菌水混合制得样品悬浮液，将样品悬浮液稀释分别涂布于MRS培养基平板及双歧杆菌培养基(产品型号为HB8527,购自青岛海博生物技术有限公司)平板，置于37℃厌氧培养24h；

S2、在MRS培养基平板上挑取白色透明且光滑的菌落进行划线分离纯化，并在双歧杆菌培养基平板上挑取白色圆润的菌落进行划线分离纯化，然后采用100倍的油镜对纯化后获得的单菌落镜检，挑选出镜检结果为纯菌且是球菌的菌株，并根据《伯杰细菌鉴定手册》第八版及《常见细菌系统鉴定手册》中关于屎肠球菌的形态特征及生理生化指标的描述，初步筛选获得八株菌；

S3、将步骤S2中的八株菌进行16S rDNA序列鉴定，测序由北京擎科生物科技有限公司完成，鉴定结果为八株菌均是屎肠球菌；

S4、对八株屎肠球菌分别进行抑菌实验、产酸能力实验、耐高温实验、耐酸实验、耐胆盐实验以及动物实验，筛选获得综合性能优异的一株屎肠球菌，命名为HSC-18；

选取中国工业微生物菌种保藏管理中心编号为CICC 20671的屎肠球菌作为实验菌株，将HSC-18和CICC 20671分别进行抑菌实验、产酸实验以及动物实验，以比较HSC-18与CICC 20671的抑菌能力、产酸能力、耐高温能力、耐酸能力、耐胆盐能力以及对动物的益生效果，结果详见下表3至表7。

对于抑菌实验，图1和图2示出了HSC-18和CICC 20671两株屎肠球菌的抑菌效果图，抑菌实验结果详见下表3：

表3 HSC-18和CICC 20671两株屎肠球菌的抑菌实验结果

由表3可知，屎肠球菌HSC-18对产气荚膜梭菌CP-1、金黄色葡萄球菌S、表皮葡萄球菌Sp、猪链球菌SS-2、猪链球菌SS-9、沙门氏菌Sah以及鸡白痢沙门氏菌SA083均具有理想的抑制效果，而屎肠球菌CICC 20671对金黄色葡萄球菌S、猪链球菌SS-2、猪链球菌SS-9以及沙门氏菌Sah具有抑制效果，但抑制效果不如屎肠球菌HSC-18，并且屎肠球菌CICC 20671对产气荚膜梭菌CP-1、表皮葡萄球菌Sp和鸡白痢沙门氏菌SA083均无抑制效果。

HSC-18和CICC 20671两株屎肠球菌的产酸能力实验结果详见下表4：

表4 HSC-18和CICC 20671两株屎肠球菌的产酸能力实验结果

屎肠球菌名称	pH值
		HSC-18	4.38
CICC 20671	4.65

由表4可知，HSC-18的产酸能力明显优于CICC 20671。

HSC-18和CICC 20671两株屎肠球菌的耐高温能力实验结果详见下表5：

表5 HSC-18和CICC 20671两株屎肠球菌的耐高温能力实验结果

由表5可知，HSC-18的耐高温能力明显优于CICC 20671。

HSC-18和CICC 20671两株屎肠球菌的耐酸能力实验结果详见下表6至表8：

表6 HSC-18和CICC 20671两株屎肠球菌的耐酸能力实验结果一

由表6可知，在pH2.5的模拟胃液环境下，HSC-18屎肠球菌的耐酸能力明显优于屎肠球菌CICC 20671。

表7 HSC-18和CICC 20671两株屎肠球菌的耐酸能力实验结果二

由表7可知，在pH3.0的模拟胃液环境下，HSC-18屎肠球菌的耐酸能力略优于屎肠球菌CICC 20671。

表8 HSC-18和CICC 20671两株屎肠球菌的耐酸能力实验结果三

由表8可知，在pH4.0的模拟胃液环境下，HSC-18屎肠球菌的耐酸能力与屎肠球菌CICC 20671的耐酸能力相当。综合地看，HSC-18屎肠球菌的耐酸能力优于屎肠球菌CICC20671。

HSC-18和CICC 20671两株屎肠球菌的耐胆盐能力实验结果详见下表9：

表9 HSC-18和CICC 20671两株屎肠球菌的耐胆盐能力实验结果

由表9可知，HSC-18屎肠球菌的耐胆盐能力明显优于屎肠球菌CICC 20671。

HSC-18和CICC 20671两株屎肠球菌的动物实验结果详见下表10：

表10 HSC-18和CICC 20671两株屎肠球菌的动物实验结果一览表

由表10可知，实验一组和实验二组中哺乳仔猪的21日龄平均体重、实验周期内的日平均增重、实验周期内的日平均采食量以及体增重/采食量均高于对照一组和对照二组，并且实验一组和实验二组中哺乳仔猪的腹泻率均低于对照一组和对照二组，实验一组中哺乳仔猪的各项指标均优于实验二组，充分说明HSC-18的益生效果优于CICC 20671。

本申请实施例还提供了屎肠球菌HSC-18在制备饲料添加剂、动物饲料、食品添加剂、食品或益生菌剂中的应用。

本申请实施例还提供了一种组合物，所述组合物的活性成分包括屎肠球菌HSC-18。可以理解的是，屎肠球菌HSC-18在组合物中的存在形式可以是：纯种屎肠球菌HSC-18、屎肠球菌HSC-18的发酵培养物、屎肠球菌HSC-18的发酵培养物离心所得的培养液或其干燥物、屎肠球菌HSC-18的发酵培养物离心所得的菌体或其干燥物。组合物可以是液体，也可以是固体，例如组合物为片剂、颗粒剂、粉剂、喷雾剂、混悬液剂、乳剂、胶囊剂或膏剂。

在本申请的一些实施例中，组合物为饲料添加剂、动物饲料、食品添加剂、食品或益生菌剂。当组合物为饲料添加剂或动物饲料时，喂食动物包括但不限于是猪、鸡、牛、羊等禽畜，具有与抗生素类饲料相类似的益生功能，但无抗生素饲料的副作用，能够调节动物的肠道内微生态平衡以提高机体的免疫功能，并且具有提供营养因子、促进营养物质的消化吸收、预防或辅助治疗消化系统疾病(例如腹泻)以及促进幼年动物的胃肠道发育的作用，从而有利于动物的生长发育。当组合物为食品添加剂或食品时，主要适用于人类，具有益生功效。

在本申请的一些实施例中，组合物还包括一种或多种辅料。辅料是指生产组合物和调配处方时所用的附加成分，具有赋形、保护活性成分、提高稳定性、增溶、助溶、缓控释放等重要功能，以使组合物达到一定的保质期和生物利用度，从而提高组合物的安全性和有效性，辅料包括但不限于是赋形剂、稀释剂、填充剂、溶剂、支持剂、预混剂、崩解剂、表面活性剂和吸附载体等。当组合物应用于制备饲料时，辅料可以是动物饲料科学领域中任何常规的辅料，辅料的选择将取决于组合物的使用方式。当组合物应用于制备食品时，辅料可以是食品科学可接受的辅料，例如香味剂、甜味剂等。

在本申请的一些实施例中，所述组合物还包括一种或多种益生微生物，例如：双歧杆菌、乳酸杆菌等。

本申请实施例还提供了一种屎肠球菌发酵培养基，按照质量份数计算，屎肠球菌发酵培养基包括：10份至20份的红糖、23份至60份的氮源以及1.4份至5份的无机盐。其中，采用红糖作为碳源的优势之处在于：第一方面，价格便宜，有利于降低生产成本；第二方面，便于保存，稳定性较高，若采用糖蜜作为碳源，则具有易污染、保存不便的缺点；第三方面，红糖富含丰富的维生素、微量元素以及氨基酸，有利于提高菌体的生长繁殖速度，从而提高发酵生产的活菌数量。

氮源可以是蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、豆粕粉、发酵豆粕、玉米浆、硝酸盐、铵盐以及尿素中的一种或多种。无机盐可以是磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸锰、无水氯化钙或硫酸亚铁中的一种或多种。

在本申请的一些实施例中，按照质量份数计算，氮源包括：12份至35份的酵母提取物、10份至20份的蛋白胨以及1.0份至5.0份的硫酸铵，既有利于控制发酵成本，又有利于提高菌体的生长繁殖速度。

在本申请的一些实施例中，按照质量份数计算，无机盐包括：0.5份至1.0份的七水硫酸镁、0.02份至0.5份的磷酸二氢钾、0.1份至0.5份的碳酸氢钠、0.3份至1.0份的氯化钾以及0.5份至2.0份的碳酸钙，既有利于控制发酵成本，又有利于提高菌体的生长繁殖速度。

本申请实施例还提供了一种屎肠球菌的发酵方法，包括步骤：将屎肠球菌接种于本申请实施例中任意一种所述的屎肠球菌发酵培养基，在35℃至40℃和pH为5.8至7.0的条件下发酵培养10h至20h。

需要说明的是，申请实施例的屎肠球菌的发酵方法适用于摇瓶发酵阶段、小试阶段、中试阶段、大罐试产阶段以及工业化生产阶段，发酵规模包括但不限于是30L发酵罐、100L发酵罐、500L发酵罐、2吨发酵罐、10吨发酵罐等，本领域技术人员根据发酵规模，能够依赖自身所掌握的专业知识逐级制备种子液。

下面通过具体实施例对本申请的屎肠球菌发酵方法及技术效果进行详细说明，以下实施例仅仅是本申请的部分实施例，并非对本申请作出具体限定。

实施例1

本实施例提供了一种屎肠球菌HSC-18的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。

一、制备种子液

(1)种子活化

取-80℃甘油管保存的屎肠球菌HSC-18，待屎肠球菌HSC-18甘油管完全融化后，吸取0.5mL的菌液接种于50mL的MRS液体培养基中，置于37℃、160r/min的条件下培养12h，然后挑取菌液划线于MRS培养基平板，置于37℃培养18h，获得屎肠球菌HSC-18的单菌落。

(2)制备一级种子液

从MRS培养基平板上挑取屎肠球菌HSC-18的单菌落，接种于50mL的MRS培养基，置于37℃、160r/min的条件下摇瓶培养12h，获得一级种子液。

(3)制备二级种子液

按照体积比1％的接种量将一级种子液转接于二级种子培养基，按照质量百分比计算，二级种子培养基由2％的蛋白胨、1％的酵母粉、2％的蔗糖以及0.07％的七水硫酸镁组成，二级种子培养基的pH为7.0，置于37℃、160r/min的条件下摇瓶培养6h，获得二级种子液。

二、2吨发酵罐发酵生产

(1)发酵培养基

发酵培养基包括以下成分：

16g/L的红糖、31g/L的酵母膏、16g/L的鱼蛋白胨、0.7g/L的七水硫酸镁、3.0g/L的硫酸铵、0.02g/L的磷酸二氢钾、0.1g/L的碳酸氢钠、0.625g/L的氯化钾以及1.5g/L的轻质碳酸钙。

(2)2吨发酵罐实消

根据发酵罐装液量(罐体积的70％)，称取发酵培养基的各个组分，将称取好的各个组分相混合，并加水分散均匀后倒至发酵罐中，加入2‰(体积比,V/V)的聚醚消泡剂，氢氧化钠调节pH为7.0，然后121℃灭菌20min，灭菌结束后向夹套内通冷水以快速冷却降温，并向罐内通入无菌空气保压0.05Mpa。

(3)发酵控制

当罐温冷却至40℃，将二级种子液按1％(体积比,V/V)的接种量接种上罐，搅拌混合15min后，调节罐温至37℃并停止搅拌和通气，保压静置3h后，屎肠球菌HSC-18进入对数生长期，且pH降至6.0；开启搅拌并控制转速为100r/min以及微通气(见明显气泡即可)，流加40％(质量体积百分数,m/V)氢氧化钠溶液以控制发酵pH为6.2，并在37℃、通气量为0.5vvm以及转速为100r/min的条件下继续发酵，在发酵第6.5h、8.5h、10h以及11h流加葡萄糖，葡萄糖的总流加浓度为54g/L(分四次流加)，最后一次补糖后停止补碱，以pH自然回升3h作为发酵终点，总发酵时间为16h，取样镜检无杂菌污染即可下罐。

在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于MRS培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃静置培养18h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中活菌数量为150亿CFU/mL。

实施例2

本实施例提供了一种屎肠球菌HSC-18的发酵培养方法，其中，发酵规模为30L发酵罐。具体操作过程为：按照实施例1中的方法制备获得一级种子液和二级种子液，按照按体积比为1％的接种量将二级种子液接种于30L的发酵罐(装液量为16L，发酵培养基与实施例1相同，发酵罐的实消方法参照实施例1进行)，调节罐温至37℃并停止搅拌和通气，保压静置3h后，屎肠球菌HSC-18进入对数生长期，且pH降至6.0；开启搅拌并控制转速为100r/min以及微通气(见明显气泡即可)，流加40％(质量体积百分数,m/V)氢氧化钠溶液以控制发酵pH为6.7，并在37℃、通气量为0.5vvm以及转速为100r/min的条件下继续发酵，根据pH变化确定加糖时间点，整个发酵过程中pH变化情况如图4所示，请参阅图4，整个发酵过程中共有七处pH回升点a至g，a至f分别对应六次加糖时间点，g对应下罐时间点，发酵过程中碱液消耗量如图3所示。

在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于MRS培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃静置培养18h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中活菌数量为160亿CFU/mL。

实施例3

本实施例提供了一种屎肠球菌HSC-18的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵培养方法，本实施例的发酵培养方法的区别之处在于：发酵培养基不相同，本实施例的发酵培养基包括10g/L的红糖、12g/L的酵母膏、10g/L的鱼蛋白胨、0.5g/L的七水硫酸镁、1g/L的硫酸铵、0.02g/L的磷酸二氢钾、0.1g/L的碳酸氢钠、0.3g/L的氯化钾以及0.5g/L的轻质碳酸钙组成。

在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于MRS培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃静置培养18h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中活菌数量为80亿CFU/mL。

实施例4

本实施例提供了一种屎肠球菌HSC-18的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵培养方法，本实施例的发酵培养方法的区别之处在于：发酵培养基不相同，本实施例的发酵培养基包括20g/L的红糖、35g/L的酵母膏、20g/L的鱼蛋白胨、1g/L的七水硫酸镁、5g/L的硫酸铵、0.5g/L的磷酸二氢钾、0.5g/L的碳酸氢钠、1g/L的氯化钾以及2g/L的轻质碳酸钙组成

将下罐的发酵液稀释涂布于MRS培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃静置培养18h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中活菌数量为180亿CFU/mL。

实施例5

本实施例提供了一种屎肠球菌的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵培养方法，本实施例的发酵培养方法的区别之处仅在于：将(3)发酵控制替换为“当罐温冷却至40℃，将二级种子液按1％(体积比,V/V)的接种量接种上罐，在37℃、通气量为0.5vvm、转速为100r/min以及pH为6.2的条件下进行发酵培养，通过流加40％氢氧化钠溶液以控制发酵培养过程中的pH为6.2，在发酵第6.5h、8.5h、10h以及11h流加葡萄糖，葡萄糖的总流加浓度为54g/L(分四次流加)，最后一次补糖后停止补碱，以pH自然回升3h作为发酵终点，总发酵时间为16h，取样镜检无杂菌污染即可下罐”。

将下罐的发酵液稀释涂布于MRS培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃静置培养18h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中活菌数量为150亿CFU/mL。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例/对比例/实验例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。

以上对本发明实施例所提供的一种屎肠球菌及其应用、组合物与屎肠球菌的发酵培养方法，进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例的技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种屎肠球菌，其特征在于，所述屎肠球菌的名称为HSC-18，分类名称为：

Enterococcus faecium，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211446，保藏日期为：2021年11月18日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心。

2.根据权利要求1所述的屎肠球菌在制备饲料添加剂、动物饲料、食品添加剂、食品或益生菌剂中的应用。

3.一种组合物，其特征在于，所述组合物的活性成分包括如权利要求1中所述的屎肠球菌。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物为饲料添加剂、动物饲料、食品添加剂、食品或益生菌剂。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括一种或多种辅料。

6.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括一种或多种益生微生物。

7.一种屎肠球菌发酵培养基，其特征在于，按照质量份数计算，所述屎肠球菌发酵培养基包括：10份至20份的红糖、23份至60份的氮源以及1.4份至5份的无机盐。

8.根据权利要求7所述的屎肠球菌发酵培养基，其特征在于，按照质量份数计算，所述氮源包括：12份至35份的酵母提取物、10份至20份的蛋白胨以及1.0份至5.0份的硫酸铵。

9.根据权利要求7所述的屎肠球菌发酵培养基，其特征在于，按照质量份数计算，所述无机盐包括：0.5份至1.0份的七水硫酸镁、0.02份至0.5份的磷酸二氢钾、0.1份至0.5份的碳酸氢钠、0.3份至1.0份的氯化钾以及0.5份至2.0份的碳酸钙。

10.一种屎肠球菌的发酵培养方法，其特征在于，包括步骤：将屎肠球菌的种子液接种于如权利要求7至9任一项中所述的屎肠球菌发酵培养基中，在35℃至40℃和pH为5.8至7.0的条件下发酵培养10h至20h。

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