CN114317322A - 一种耐温耐酸碱菌株、筛选方法、菌剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种耐温耐酸碱菌株，该菌株为地尿素芽孢杆菌(Ureibacillus terrenus)，命名为地尿素芽孢杆菌L2，已于2021年07月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22991。该菌株可在40‑90℃保持较高活性，能在较宽pH(4.0‑11.0)环境中生存并保持较高活性，同时兼具显著的纤维素酶活性、蛋白酶活性和脂肪酶活性，因此可广泛应用于各种农业固体废弃物(包括但不限于畜禽粪便、作物秸秆)的好氧堆肥工艺中，为高效堆肥提供可用菌剂。此外，本发明还涉及该菌株的筛选方法及应用。

Description

一种耐温耐酸碱菌株、筛选方法、菌剂及应用

技术领域

本发明涉及应用菌株技术领域，具体涉及一种耐温耐酸碱菌株、筛选方法、菌剂及应用。

背景技术

每年养殖场都会产生大量的畜禽粪便和污水，畜禽粪便对周围环境构成严重威胁。堆肥是一种广泛应用的好氧发酵技术，是对畜禽废弃物的处理方法之一。通过好氧微生物的新陈代谢，可以将复杂的大分子有机质分解成小分子，并进行灭菌杀毒，制成有机肥。在整个过程中，好氧微生物不断繁殖，分解有机物。高温好氧堆肥是一种对环境友好的过程，也是一种管理和回收有机物的可持续替代方法，目的是获得稳定的有机肥料和增值产品。

好氧堆肥是微生物在好氧条件下迅速分解有机物的过程。在堆肥过程中，易降解的有机物被微生物直接吸收利用，而大分子难降解的一部分有机物，会先被吸附在细胞外面，随着细胞释放各种酶，将其降解成小分子易降解有机物，随后被吸收利用。畜禽废弃物中富含微生物生长所需的营养物质，随着微生物的生长、传代，将畜禽废弃物中的有机物质消耗，转化成水、二氧化碳及热量。

高温好氧发酵(堆肥化)技术是一种处理有机固体废弃物、将其资源化利用的重要手段。通常情况下，低于60℃时不能把病原菌、虫卵和草籽杀死。因此发酵温度需高于60℃较好。此外，长期以来，传统的堆肥技术存在发酵温度低、成熟期长、无害化不彻底等缺点，其发展受到严重限制。

作为新型的好氧发酵技术，超高温堆肥(或超高温好氧发酵)在工程实践中证明了可克服传统高温堆肥的诸多缺点。超高温堆肥的实现需要添加外源嗜热菌剂，接种物料可使堆体的温度迅速上升至80℃以上，并在超高温期保持5-7天，促进堆肥快速腐熟和防止畜禽养殖废弃物的污染。但目前国内外微生物发酵菌剂的研究均偏重于以芽孢杆菌、曲霉菌等常温和中温菌株进行微生物菌剂的开发，关于堆肥用超高温嗜热菌剂的报道则不多，尤其是针对堆肥工艺具有良好适应性和功能性的超高温嗜热菌剂产品更是少有公开。

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种耐温耐酸碱菌株，该菌株可以在极端高温条件保持生长，且其适宜的生长温度范围较广，可在40-90℃保持较高活性，能在较宽pH(4.0-11.0)环境中生存并保持较高活性，同时兼具显著的纤维素酶活性、蛋白酶活性和脂肪酶活性，因此可广泛应用于各种农业固体废弃物(包括但不限于畜禽粪便、作物秸秆)的好氧堆肥工艺中，为高效堆肥提供可用菌剂。此外，本发明还涉及该菌株的筛选方法及应用。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

第一方面，本发明提供一种耐温耐酸碱菌株，该菌株为地尿素芽孢杆菌(Ureibacillus terrenus)，命名为地尿素芽孢杆菌L2，已于2021年07 月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22991。

所述菌株被证实在能在90℃的高温下保持生长，且其适宜生长温度范围较广，可在40-90℃保持较高活性，还具有很强的对抗外界有害因子(酸碱和盐度)，能够在较宽的pH(4.0-11.0)环境中生存并保持较高活性。除具有极端环境生长活性的特点之外，本发明提供的地尿素芽孢杆菌L2 还同时兼具显著的纤维素酶活性(分解秸秆纤维素)、蛋白酶活性和脂肪酶活性(分解禽畜粪便中蛋白质、脂肪、可杀灭虫卵和病毒)，可广泛用于畜禽粪便、作物秸秆等农业农业废弃物为原料的好氧堆肥中，提高堆肥的效率。因此，本发明的地尿素芽孢杆菌L2用于成分复杂的畜禽粪污等农业废弃物的腐熟发酵中时，可显著提高堆肥温度、延长发酵的高温期、缩短发酵周期。

第二方面，本发明提供一种耐温耐酸碱菌株，该菌株为地尿素芽孢杆菌(Ureibacillus terrenus)，命名为地尿素芽孢杆菌L2，其具有如SEQ ID NO:1所示的基因序列。

第三方面，本发明提供一种耐温耐酸碱菌株的筛选方法，其包括如下步骤：

S1、菌株的分离

从河北省石家庄市餐厨垃圾堆肥厂获取堆肥产物样品，用蒸馏水搅拌溶解并加热至58-62℃恒温保持3h以上，静置收集上清液，将上清液进行稀释后，涂布装有LB(固体)培养基的平板，经恒温培养至菌落产生，挑取单菌落进行多次划线培养，纯化得到M株菌株，将M株菌株进行4-6 次平板传代后，获得稳定遗传的单克隆菌株；

S2、初步筛选

将S1分离的M株单克隆菌株分别接种到盛有纤维素刚果红培养基的平板，在58-62℃的恒温箱中培养65-80h，根据平板中培养基菌落的透明圈指数≥3的条件，分离筛选耐高温、分泌高活性纤维素酶的N株菌株；

S3、二次筛选

将S2筛选的N株菌株，分别划线接种于装有LB培养基的平板上进行活化培养，即58-62℃的恒温箱中培养20-30h；

然后刮取各平板上的菌落并分别接种于装有LB液体培养基的培养瓶中，于58-62℃、150-220r/min摇床培养20-30h；分别取前述LB液体培养基1mL接种于秸秆培养基，于58-62℃温箱中培养4-7d，分别检测秸秆的降解情况，得到Y株具有耐高温、分泌高活性纤维素酶的菌株；根据秸秆的降解率从高到低排序，以其中降解率最高的菌株为目标菌株。将最终筛选的目标菌株于-80℃保存。

秸秆的降解率(％)＝(W0-Wi)/W0×100％，W0代表接种菌株前培养基中秸秆的干质量(g)；Wi代表培养结束后培养基中秸秆的干质量(g)。

根据本发明的筛选方法，进一步包括：菌株的鉴定，所述鉴定包括：

将目标菌株在LB(固体)培养基上58-62℃培养2-4d，观察菌落形态；提取菌株基因组DNA进行16SrRNA测序，并在NCBI进行BLAST比较分析，根据BLAST结果，该菌株与地尿素芽孢杆菌Bacillus subtilis的 16SrRNA基因序列的相似性为99.38％。

综合菌落形态和16SrRNA序列，鉴定本发明筛选的菌株属于地尿素芽孢杆菌Ureibacillus terrenus，命名为地尿素芽孢杆菌L2，并于2021年07 月30日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.22991。

其中，M＞N＞Y。透明圈指数＝透明圈直径D/菌落直径d，透明圈指数≥3为初步筛选条件。

LB(固体)培养基配方为：胰蛋白胨8-12g/L(优选10g/L)、酵母提取物4-6g/L(优选5g/L)、NaCl 8-12g/L(优选10g/L)、琼脂粉15-20g/L (优选18g/L)。

LB液体培养基配方为：胰蛋白胨8-12g/L(优选10g/L)、酵母提取物4-6g/L(优选5g/L)、NaCl 8-12g/L(优选10g/L)和蒸馏水。

纤维素刚果红培养基配方为：每1L培养基中含有硝酸钠1.0g，磷酸氢二钠1.2g，磷酸二氢钾0.9g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，酵母浸出粉0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，刚果红0.2g，纤维素粉5.0g，琼脂15.0g，pH 7.0±0.1， 1000ml蒸馏水，121℃高压灭菌15min。该纤维素刚果红培养基中各组分的含量可在上下±15％内波动。

秸秆培养基配方为：每1L培养基中含有粉碎玉米秸秆2g、尿素3g、 (NH₄)₂SO₄6g、蛋白胨3g、CaCl20.1g、MgSO4·7H₂O 0.5g、K₂HPO₄1g、 NaCl 0.1g、FeSO₄·7H₂O 0.05g、MnSO₄·7H₂O 0.016g、ZnSO₄·7H₂O 0.014g、 CoCl₂·6H2O 0.037g、蒸馏水1000mL，pH 7.0±0.1，121℃高压灭菌30min。所述秸秆培养基各组分的含量可在上下±15％内波动。

第四方面，本发明提供一种含有地尿素芽孢杆菌L2菌剂产品，

所述菌剂产品为固体菌剂或液体菌剂；

其中，所述固体菌剂为：将地尿素芽孢杆菌L2的扩大培养液进行喷雾干燥，得到地尿素芽孢杆菌L2菌粉，将得到的地尿素芽孢杆菌L2菌粉与可溶性淀粉混合，使其中的活菌数达到1×10⁸～5×10¹⁰CFU/g，再加入菌粉质量5倍的无机营养物混合均匀，得到地尿素芽孢杆菌L2固体菌剂；

所述液体菌剂为：将地尿素芽孢杆菌L2的扩大培养液通过板框过滤的方法得到地尿素芽孢杆菌L2菌体，将得到的地尿素芽孢杆菌L2菌体加入营养液中，使其中活菌数达到1×10⁸～5×10¹⁰CFU/mL，得到地尿素芽孢杆菌L2液体菌剂；所述营养液中含有质量浓度为10-20％的无机营养物；

其中，所述无机营养物为含氮化合物、含磷化合物、含钾化合物的混合物，且三者分别以N、P₂O₅和K₂O计时质量比为3:1:1。

第五方面，本发明提供一种地尿素芽孢杆菌L2的用途，其用于接种到含有禽畜粪便或/和秸秆的农业固体废弃物中，进行堆肥发酵。

根据本发明所述的用途，在堆肥发酵时，所述地尿素芽孢杆菌L2以固体菌剂或液体菌剂的形式接种到农业固体废弃物中，所述固体菌剂中活菌数达到1×10⁸～5×10¹⁰CFU/g，所述液体菌剂中活菌数达到 1×10⁸～5×10¹⁰CFU/mL；接种量为堆肥原料质量0.1-0.3％的所述固体菌剂或液体菌剂。

根据本发明所述的用途，在堆肥发酵时，所述堆肥原料的初始C/N比为20-30，含水量为50-70％。

根据本发明所述的用途，在所述发酵过程中进行连续式曝气，所述连续曝气过程中每立方米所述堆肥原料的曝气量为50-100L/min。

在本申请中，如果是以菌体接种，则接种浓度指的是该菌体在接种培养基中的质量浓度；若以菌液或菌悬液接种，则指该菌液或菌悬液的体积浓度，例如以5％的菌液接种，则表示每5mL菌液对应(100-5)mL的培养基。

(三)有益效果

本发明的主要技术效果是：

本发明提供的地尿素芽孢杆菌L2，被证实在能在高达90℃的高温下保持生长，属于耐高温菌，且其适宜生长温度范围较广，可在40-90℃保持较高活性，还具有很强的对抗外界有害因子(酸碱和盐度)，能够在较宽的pH(4.0-11.0)环境中生存并保持较高活性，属于耐酸碱菌。

所述地尿素芽孢杆菌L2除具有耐高温耐酸碱等在极端环境生长活性的特点之外，其产生的脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶的活力都很高，纤维素酶活性可以分解秸秆纤维素、蛋白酶活性和脂肪酶活性分解禽畜粪便中蛋白质、脂肪、可杀灭虫卵和病毒。因此，本发明筛选的地尿素芽孢杆菌L2 可广泛用于畜禽粪便、作物秸秆等农业农业废弃物为原料的好氧堆肥中，提高堆肥的效率。

据实验证明，本发明的地尿素芽孢杆菌L2用于成分复杂的畜禽粪污等农业废弃物的腐熟发酵中时，可显著提高堆肥温度、延长发酵的高温期、进一步缩短腐熟时间和发酵周期。在保持堆肥原料较高无害化处理(以种子发芽率指数代表无害化处理进程，据NY525-2012要求，种子发芽率指数达到90％以上认为完成无害化处理)的条件下，可使整个腐熟周期缩短至16天以内。

附图说明

图1为筛选的地尿素芽孢杆菌L2的菌落形态特征。

图2为筛选的地尿素芽孢杆菌L2的菌体电子显微图片。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

实施例1

本实施例为地尿素芽孢杆菌L2的筛选方法，其包括以下步骤：

(1)菌株的分离

从河北省石家庄市餐厨垃圾堆肥厂堆肥产物样品，在60℃条件下，用稀释涂平板的方法通过LB固体培养基(配方：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L)进行分离，得到21个菌株，将其进行5次平板传代后，获得稳定遗传的单克隆菌株，并在-80℃进行保存。

(2)初步筛选耐高温、高活性纤维素酶的菌株

将分离的21个单克隆菌株用纤维素刚果红培养基(配方：硝酸钠1.0g，磷酸氢二钠1.2g，磷酸二氢钾0.9g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，酵母浸出粉0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，刚果红0.2g，纤维素粉5.0g，琼脂15.0g， pH 7.0±0.1，1000ml蒸馏水，121℃高压灭菌15min)，在60℃恒温箱中培养72h，根据培养基菌落的透明圈指数(透明圈直径D/菌落直径d≥3)，分离筛选耐高温、分泌纤维素酶且活性高的菌株，获得17株具有耐高温、高活性纤维素酶的菌株，于-80℃保存。

(3)二次筛选目标耐高温、高活性纤维素酶的菌株

将初筛获得的17株具有耐高温、高活性纤维素酶的菌株从-80℃取出，分别划线接种于LB平板上进行活化，60℃培养24h。用接种环刮去LB平板上的菌落并接种于装有50ml的LB液体培养基的三角瓶中，60℃、 200r/min摇床培养24h。

分别取上述培养液1mL接种于秸秆培养基(配方：粉碎玉米秸秆2g、尿素3g、(NH4)₂SO₄ 6g、蛋白胨3g、CaCl₂ 0.1g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、K₂HPO₄ 1g、NaCl 0.1g、FeSO₄·7H₂O0.05g、MnSO₄·7H₂O 0.016g、ZnSO₄·7H₂O 0.014g、CoCl₂·6H₂O 0.037g、蒸馏水1000mL，pH7.0±0.1，121℃高压灭菌30min)，60℃恒温箱中培养5d，检测秸秆的降解情况，有6株具有耐高温、高活性纤维素酶的菌株的秸秆降解率如表1所示。

将其中对玉米秸秆降解效果最佳的菌株L2(表1第4行)，留取并于 -80℃甘油保存，作为目标菌株。下表中，秸秆降解率(％) ＝(W₀-W_i)/W₀×100％，W₀代表接种菌株前培养基中秸秆的干质量(g)； W_i代表培养结束后培养基中秸秆的干质量(g)。

表1

菌株	秸秆降解率％
		L1	22.8
<u>L2</u>	<u>35.2</u>
		L3	26.6
L4	27.2
		L5	22.5
L6	21.3

(4)菌株L2的16S rRNA鉴定

取-80℃保存的L2菌株在LB固体培养基上60℃培养2天。观察菌落形态，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，如图1所示；显微镜观察细胞形态，细胞呈杆状，直径0.6μm-1.0μm，长1.5μm-2.0μm，芽孢中生，椭圆，如图2所示。

进一步提取L2菌株的基因组DNA，以L2菌株的基因组DNA为模版，用16SrRNA通用引物的上游引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3′和下游引物1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增。PCR 扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸 60s，30个循环；72℃延伸10min。电泳检测扩增产物纯度和大小，将扩增长度正确的PCR产物送上海生工进行测序，测序序列如SEQ ID NO:1，并在NCBI进行BLAST比较分析，根据BLAST结果，该L2菌株与地尿素芽孢杆菌Bacillus subtilis的16SrRNA基因序列的相似性为99.38％。

综合菌落形态及和16SrRNA序列，可以确定本发明L2菌株属于地尿素芽孢杆菌Ureibacillus terrenus，命名为地尿素芽孢杆菌L2，并于2021 年07月30日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.22991。

实施例2

本实施例涉及地尿素芽孢杆菌L2的生理特征鉴定，包括耐高温性能和耐酸碱性能的特征鉴定，方法如下：

(1)将-80℃保存的地尿素芽孢杆菌L2划线接种于LB固体平板(配方参见前文)上，分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、 75℃、85℃和90℃的温度条件下培养3d，观察不同温度条件下菌株L2的生长状况，结果如表2所示：

表2不同温度下L2的生长状况

注：+表示可以生长(固体培养基上有菌落)，++生长状况良好(固体培养基上的菌落数在10-50个)，+++生长旺盛(固体培养基上的菌落数大于50个)。

由表2可知，地尿素芽孢杆菌L2能在高温条件(40-90℃)下的LB 培养基上生长良好，属于耐高温菌。

(2)取实施例1的步骤(3)中1ml的L2的LB液体培养液，分别接种至pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0和11.0 的纤维素刚果红固体培养基上，60℃培养3d，观察不同温度条件下L2的生长状况，结果如表3所示：

表3不同pH下L2的生长状况

注：+表示可以生长(固体培养基上有菌落)，++生长状况良好(固体培养基上的菌落数在10-50个)，+++生长旺盛(固体培养基上的菌落数大于50个)。

由表3可知，地尿素芽孢杆菌L2能在极端pH条件下(4.0-11.0)的纤维素刚果红培养基上生长良好，属于耐酸碱菌。

实施例3

本实施例涉及地尿素芽孢杆菌L2的产酶活性进行鉴定，包括产脂肪酶、蛋白酶和纤维素酶。鉴定方法如下：

(1)对地尿素芽孢杆菌L2菌株的产脂肪酶的能力进行验证：将L2 菌株活化后接种至营养肉汤培养基中(蛋白胨10g/L、牛肉粉浸出粉3g/L、氯化钠5g/L，pH值7.2±0.2)，60℃培养24h。采用碱滴定法测定培养液中脂肪酶的活力。经测定，培养液中脂肪酶的活力为10.2U/mL。

(2)将L2菌株活化后接种至50mL脱脂奶粉培养基中(蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、脱脂奶粉1.5g、蒸馏水1000ml)中，50℃培养24h。采用Folin-酚法测定混合物中蛋白酶的活力。经测定，混合物中蛋白酶的活力为20.7U/mL。

(3)将L2菌株活化后接种至纤维素培养液中(蛋白胨10g、牛肉膏 5g、氯化钠5g、羧甲基纤维素钠5g、蒸馏水1000ml)，50℃培养24h。采用DNS法测定混合物中纤维素酶的活力。经测定，培养液中纤维素酶的活力为24.93U/mL。

通过地尿素芽孢杆菌L2的产酶活性鉴定可知，该地尿素芽孢杆菌L2 兼具产脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的能力。

实施例4

本实施例涉及地尿素芽孢杆菌L2的固体菌剂/液体菌剂的制备方法：

在制备固体菌剂时，

第一步，先将实施例1中保藏的地尿素芽孢杆菌L2依次进行如下培养过程：

菌种活化：将-80℃保存的L2菌株划线接种于LB平板上，50℃培养 24h。

一级种子培养：用接种环刮去LB平板上的L2菌落并接种于装有LB 液体培养基的三角瓶中，60℃、200r/min摇床培养24h。

二级种子发酵：将上述一级种子培养液按10％的接种量接种于装有 10L的LB液体培养基的种子罐中，60℃、200rpm/min发酵1d。

扩大培养：将得到的二级种子发酵液按5％的接种量接种于装有50L 的LB液体培养基的发酵罐中，60℃、200rpm/min发酵2d。

第二步，喷雾干燥：将地尿素芽孢杆菌L2的扩大培养液进行喷雾干燥，得到地尿素芽孢杆菌L2菌粉。

第三步，将得到的地尿素芽孢杆菌L2菌粉与可溶性淀粉混合，使其中的活菌数达到1×10⁹CFU/g，再加入菌粉质量5倍的无机营养物(3:1:1 的N、P₂O₅和K₂O)，混合均匀，得到地尿素芽孢杆菌L2固体菌剂。

在制备液体菌剂时，

第一步，先将实施例1中保藏的地尿素芽孢杆菌L2依次进行如下培养过程：

菌种活化：将-80℃保存的L2菌株划线接种于LB平板上，50℃培养 24h。

一级种子培养：用接种环刮去LB平板上的L2菌落并接种于装有LB 液体培养基的三角瓶中，60℃、200r/min摇床培养24h。

二级种子发酵：将上述一级种子培养液按10％的接种量接种于装有 10L的LB液体培养基的种子罐中，60℃、200rpm/min发酵1d。

扩大培养：将得到的二级种子发酵液按5％的接种量接种于装有50L 的LB液体培养基的发酵罐中，60℃、200rpm/min发酵2d。

第二步，将得到的地尿素芽孢杆菌L2的扩大培养液通过板框过滤的方法得到地尿素芽孢杆菌L2菌体。

第三步，将得到的地尿素芽孢杆菌L2菌体加入营养液中(含有质量浓度为15％(可加10-20％)的无机营养物，无机营养物中N、P₂O₅和K₂O 的质量比为3:1:1)，使其中的活菌数达到1×10⁹CFU/mL，得到地尿素芽孢杆菌L2液体菌剂。

实施例5

本实施例涉及以新鲜牛粪和玉米秆秸为原料，利用实施例4制备的地尿素芽孢杆菌L2固体菌剂进行堆肥，具体方法为：

原料预处理：新鲜牛粪(含水率74.35％)，秸秆(含水率10.67％)，秸秆经过粉碎处理，将玉米秸秆打碎至1到2cm；然后与粉碎后的秸秆按照质量比为3:1(牛粪：秸秆)混合，接种固体菌剂，接种量为发酵原料质量的0.2％；混合后原料的初始C/N比为25，含水率为60％；混合物料在发酵过程中进行连续式曝气，每立方米原料的曝气量为100L/min。

发酵过程中，发酵第二天温度就达到了85.8℃，高温期维持时间为18 天。发酵过程结束之后，发酵产物经微生物检测，其大肠杆菌和蛔虫卵的杀灭率均达到100％。

发酵产物呈松散状态且没有任何氨臭味，含水率为30％，种子发芽率为124％，无渗滤液产生。

实施例6

本实施例涉及以新鲜牛粪和玉米秆秸为原料，利用实施例4制备的地尿素芽孢杆菌L2液体菌剂进行堆肥，具体方法为：

原料预处理：新鲜牛粪(含水率74.35％)，秸秆(含水率10.67％)，秸秆经过粉碎处理，将玉米秸秆打碎至1到2cm；然后与粉碎后的秸秆按照质量比为3:1(牛粪：秸秆)混合，接种液体菌剂，接种量为发酵原料质量的0.2％；混合后原料的初始C/N比为25，含水率为60％；混合物料在发酵过程中进行连续式曝气，每立方米原料的曝气量为100L/min。

发酵过程中，发酵第二天温度就达到了76.8℃，高温期维持时间为18 天，发酵过程的最高温度达到81.2℃。发酵过程结束之后，发酵产物经微生物检测，其大肠杆菌和蛔虫卵的杀灭率均达到100％。

发酵产物呈松散状态且没有任何氨臭味，含水率为28％，种子发芽率为117％，无渗滤液产生。

对比例1

原料预处理：新鲜牛粪(含水率74.35％)，秸秆(含水率10.67％)，秸秆经过粉碎处理，将玉米秸秆打碎至1到2cm；然后与粉碎后的秸秆按照质量比为3:1(牛粪：秸秆)混合；混合后原料的初始C/N比为25，含水率为60％；混合物料在发酵过程中进行连续式曝气，每立方米原料的曝气量为100L/min。

发酵过程中，发酵第二天温度达到了46.8℃，在发酵第三天达到了最高温度65.2℃，高温期维持时间为10天。发酵过程结束之后，发酵产物经微生物检测，其大肠杆菌和蛔虫卵的杀灭率均达到100％。

发酵产物呈松散状态且有土腥味，含水率为44％，种子发芽率为95％，有一定渗滤液产生。

对比例2

原料预处理：新鲜牛粪(含水率74.35％)，秸秆(含水率10.67％)，秸秆经过粉碎处理，将玉米秸秆打碎至1到2cm；然后与粉碎后的秸秆按照质量比为3:1(牛粪：秸秆)混合；接种市购已商品化的堆肥菌剂，接种量按照使用说明添加，混合后原料的初始C/N比为25，含水率为60％；混合物料在发酵过程中进行连续式曝气，每立方米原料的曝气量为 100L/min。

发酵过程中，发酵第二天温度达到了56.8℃，在发酵第三天达到了最高温度72.3℃，高温期维持时间为10天。发酵过程结束之后，发酵产物经微生物检测，其大肠杆菌和蛔虫卵的杀灭率均达到100％。

发酵产物呈松散状态且有土腥味，含水率为38％，种子发芽率为99％，有一定渗滤液产生。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种耐温耐酸碱菌株，其特征在于，该菌株为地尿素芽孢杆菌(Ureibacillusterrenus)，命名为地尿素芽孢杆菌L2，已于2021年07月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22991。

2.一种耐温耐酸碱菌株，其特征在于，该菌株为地尿素芽孢杆菌(Ureibacillusterrenus)，命名为地尿素芽孢杆菌L2，其具有如SEQ ID NO:1所示的基因序列。

3.一种耐温耐酸碱菌株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、菌株的分离

从河北省石家庄市餐厨垃圾堆肥厂获取堆肥产物样品，用蒸馏水搅拌溶解并加热至58-62℃恒温保持3h以上，静置收集上清液，将上清液进行稀释后，涂布装有LB培养基的平板，经恒温培养至菌落产生，挑取单菌落进行多次划线培养，纯化得到M株菌株，将M株菌株进行4-6次平板传代后，获得稳定遗传的单克隆菌株；

S2、初步筛选

将S1分离的M株单克隆菌株分别接种到盛有纤维素刚果红培养基的平板，在58-62℃的恒温箱中培养65-80h，根据平板中培养基菌落的透明圈指数≥3的条件，分离筛选耐高温、分泌高活性纤维素酶的N株菌株；其中，透明圈指数＝透明圈直径/菌落直径；

S3、二次筛选

将S2筛选的N株菌株，分别划线接种于装有LB培养基的平板上进行活化培养，即58-62℃的恒温箱中培养20-30h；

然后刮取各平板上的菌落并分别接种于装有LB液体培养基的培养瓶中，于58-62℃、150-220r/min摇床培养20-30h；分别取前述LB液体培养基1mL接种于秸秆培养基，于58-62℃温箱中培养4-7d，分别检测秸秆的降解情况，得到Y株具有耐高温、分泌高活性纤维素酶的菌株；根据秸秆的降解率从高到低排序，以其中降解率最高的菌株为目标菌株；

其中，M、N、Y为自然数，且M＞N＞Y。

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，菌株的鉴定步骤，所述鉴定包括：将目标菌株在LB培养基上58-62℃培养2-4d，观察菌落形态；提取菌株基因组DNA进行16SrRNA测序。

5.一种含有权利要求1或2所述的地尿素芽孢杆菌L2菌剂产品，所述菌剂产品为固体菌剂或液体菌剂；

其中，所述固体菌剂为：将地尿素芽孢杆菌L2的扩大培养液进行喷雾干燥，得到地尿素芽孢杆菌L2菌粉，将得到的地尿素芽孢杆菌L2菌粉与可溶性淀粉混合，使其中的活菌数达到1×10⁸～5×10¹⁰CFU/g，再加入菌粉质量5倍的无机营养物混合均匀，得到地尿素芽孢杆菌L2固体菌剂；

所述液体菌剂为：将地尿素芽孢杆菌L2的扩大培养液通过板框过滤的方法得到地尿素芽孢杆菌L2菌体，将得到的地尿素芽孢杆菌L2菌体加入营养液中，使其中活菌数达到1×10⁸～5×10¹⁰CFU/mL，得到地尿素芽孢杆菌L2液体菌剂；所述营养液中含有质量浓度为10-20％的无机营养物；

其中，所述无机营养物为含氮化合物、含磷化合物、含钾化合物的混合物，且三者分别以N、P₂O₅和K₂O计时质量比为3:1:1。

6.一种权利要求1或2所述的地尿素芽孢杆菌L2的用途，其用于接种到含有禽畜粪便或/和秸秆的农业固体废弃物中，进行堆肥发酵。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，在堆肥发酵时，所述地尿素芽孢杆菌L2以固体菌剂或液体菌剂的形式接种到农业固体废弃物中，所述固体菌剂中活菌数达到1×10⁸～5×10¹⁰CFU/g，所述液体菌剂中活菌数达到1×10⁸～5×10¹⁰CFU/mL；接种量为堆肥原料质量0.1-0.3％的所述固体菌剂或液体菌剂。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，在堆肥发酵时，所述堆肥原料的初始C/N比为20-30，含水量为50-70％。

9.根据权利要求6或7或8所述的用途，其特征在于，在所述发酵过程中进行连续式曝气，所述连续曝气过程中，每立方米所述堆肥原料的曝气量为50-100L/min。

10.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述堆肥时间为≤16天。

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