CN114315643A

CN114315643A - 一种靶向脂滴和水环境的双色荧光探针及其合成方法和应用

Info

Publication number: CN114315643A
Application number: CN202210042781.5A
Authority: CN
Inventors: 詹梓炫; 李为民
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2042-01-14
Also published as: CN114315643B

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向脂滴和水环境的双色荧光探针及其合成方法和应用。本发明通过简单的一步反应合成了三种典型的D‑π‑A型荧光探针(LDs‑DM、LDs‑HO、LDs‑M0)。双色荧光探针在水中表现出近红外发射，在油中表现出绿色发射，实现了细胞内脂滴和水环境的特异性荧光成像。由于LDs‑DM具有良好的双发射特性和优异的光物理特性，因此在无组织切片的情况下成功应用于区分脂肪肝组织和动脉粥样硬化斑块中的水区域和脂质区域。其次LDs‑DM还可用于区分正常人肝组织和脂肪肝患者的肝组织。因此LDs‑DM在预测脂肪肝的进展、更准确地指导有效治疗方面具有巨大潜力。

Description

一种靶向脂滴和水环境的双色荧光探针及其合成方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向脂滴和水环境的双色荧光探针及其合成方法和应用。

背景技术

脂滴(LDs)被称为能量储存中心和动力细胞器，在活细胞中主要含有胆固醇酯和甘油三酯。据报道，LDs在组织中的异常积累与脂质代谢过程密切相关，可能导致一系列疾病，包括脂肪肝和动脉粥样硬化(AS)。此外，LDs在肝脏中积累的进展可进一步促进脂肪组织和心脏周围的心肌脂肪倾倒。此外，如果能够在现阶段检测并采取预防措施，临床心血管疾病(CVD)事件可以避免或延迟。考虑到LDs在脂肪肝和AS发展中的重要作用，针对LDs的功能并追踪LDs的动态波动，有可能预测疾病进展并指导有效治疗。

为此，报道了一系列用于检测LDs的成像技术，包括拉曼显微镜、透射电子显微镜(TEM)、免疫荧光染色和荧光成像技术。其中，荧光成像具有很高的时间和空间分辨率，更容易在活细胞的亚细胞水平上监测生物分子的位置、浓度和运动。虽然尼罗红和BODIPY493/503 是目前使用最多的两种荧光探针，但这两种染料的光稳定性低，Stokes位移小，在长期组织成像中存在一定的局限性。为了克服这些缺点，人们开发了多种性能优异的荧光探针用于脂滴的特异性成像，包括多环芳烃化合物、StatoMerocyanine衍生物、金属配合物、聚集诱导发射荧光团、分子内电荷转移(ICT)或推拉电子结构化合物等。一般情况下，同时对脂肪肝和AS组织的水环境和脂质聚集部位进行成像，对揭示组织微结构、水/脂质界面、疾病程度等有重要价值。同时，利用其中一个荧光信号作为定位校正和定量分析的参考也是非常有吸引力的。

然而，大多数荧光探针对脂滴只显示单一的荧光开启特性。只有极少数的探针在水和脂质微环境中表现出单一激发波长下的两种不同发射波长。此外，两个波长之间的光谱重叠可能会降低灵敏度并引起一些信号重叠问题。因此，迫切需要研制在水脂微环境下几乎无发射串扰的荧光探针，以准确区分正常组织和病理组织。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种靶向脂滴和水环境的双色荧光探针，采用的技术方案如下：

一种靶向脂滴和水环境的双色荧光探针，所述双色荧光探针的结构式为

其中R为甲氧基、羟基或氮二甲基中的一种。

采用该技术方案后，通过简单的一步反应合成了三种典型的D-π-A型荧光探针(LDs-DM、LDs-HO、LDs-M0)，并通过HRMS、¹H NMR和¹³C NMR确定了其化学结构；通过对双色荧光探针的光物理性能研究发现双色荧光探针具有较强的ICT效应，因此双色荧光探针在水中表现出近红外发射，在油中表现出绿色发射。

本发明还提供了一种靶向脂滴和水环境的双色荧光探针的合成方法，采用的技术方案如下：

包括以下步骤：

步骤一：向有机溶剂中加入萘醛化合物、丙二腈和催化剂得到混合溶液，所述萘醛化合物的结构式为

其中R为甲氧基、羟基或氮二甲基中的一种；

步骤二：将得到的混合溶液加热到80℃后回流反应3h；

步骤三：反应结束后，将混合溶液静置冷却至室温后收集反应得到的双色荧光探针晶体；

步骤四：用有机溶剂对得到的双色荧光探针晶体进行洗涤后得到双色荧光探针。

作为优选，所述萘醛化合物、丙二腈和有机溶剂的摩尔比为1：(1-1.2)：(50-200)。

作为优选，所述加入的催化剂的体积为有机溶剂的体积的0.05-0.5％。

作为优选，所述催化剂为所述催化剂为哌啶、1,5-二氮杂双环[4.3.0]-5-壬烯、四甲基胍、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、4-二甲基氨砒啶、N,N-二甲基乙醇胺或氮甲基吗啡啉中的一种。

作为优选，所述有机溶剂为无水乙醇或甲醇中的一种。

作为优选，所述洗涤剂为无水乙醇、甲醇、丙酮或乙醚中的一种。

采用该技术方案后，选用含有不同取代基的萘醛化合物和丙二腈反应，制备三种典型的D-π-A型荧光探针。催化剂做碱可以加快反应速度，溶剂是为了溶解原料以及加快反应速度，洗涤剂为不良溶剂，选用不良溶剂为洗涤剂的目的是洗掉杂质的同时尽可能减少产物损失。合成的双色荧光探针在水中表现出近红外发射，在油中表现出绿色发射，从而实现了细胞内脂滴和水环境的特异性荧光成像。

本发明还提供了一种如权利要求1所述的靶向脂滴和水环境的双色荧光探针在区分脂肪肝组织和动脉粥样硬化斑块中的水区域和脂质区域方面的应用。

采用该技术方案后，动脉血管壁上斑块的形成是AS的一个典型特征，这将进一步诱发一系列心脏病。脂质代谢紊乱和LDs在动脉血管壁的异常积聚将诱发和促进动脉粥样硬化斑块的形成。而双色荧光探针在局部脂质区域(绿色荧光)和水区域(红色荧光)显示出明亮的荧光，几乎没有荧光串扰，这使得它能够精确区分病变和正常区域。肝脏中LDs的大量积累会导致脂肪肝，进而引发不可逆的肝功能障碍。因此，脂肪肝的诊断以及区分脂质区和正常区对于预防疾病发展具有重要意义。

一种如权利要求1所述的靶向脂滴和水环境的双色荧光探针在区分人体正常组织和脂肪肝组织方面的应用。

采用该技术方案后，与正常人肝组织中的弱荧光和少量LDs相比，脂肪肝患者经双色荧光探针染色后可检测到更大尺寸的LDs和亮绿色荧光，因此可以区分正常人体组织和脂肪肝组织。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1.可以通过双色荧光探针在无组织切片的情况下区分脂肪肝组织和动脉粥样硬化斑块中的水区域和脂质区域。

2.双色荧光探针可用于区分正常人肝组织和患有脂肪肝的患者肝组织，在预测脂肪肝的进展、更准确地指导有效治疗方面具有巨大潜力。

3.双色荧光探针在水中表现出近红外发射，在油中表现出绿色发射，从而实现了细胞内脂滴和水环境的特异性荧光成像。

4.脂肪肝的诊断以及区分脂质区和正常区对于预防疾病发展具有重要意义。

5.多种生物分子，如阴离子、阳离子和活性物种不会导致双色荧光探针的荧光变化，这表明双色荧光探针在生命系统中的潜在生物成像应用。

6.LDs-DM的细胞毒性较低。

7.在LDs-DM的双发射成像中，可以很容易地观察到AS早期的脂肪条纹，小体积的脂质堆积很容易观察到，这表明LDs-DM可以用来研究AS的发育过程。因此LDs-DM有望准确预测AS的进展。

8.粘度对LDs-DM的荧光变化影响较小，而LDs-DM在不同pH溶液中的荧光也几乎没有变化，说明双色荧光探针具有连良好的稳定性。

9.LDs-DM可用于低浓度LDs的特异性标记。

附图说明

图1为本发明的三种双色荧光探针的合成图；

图2为本发明的LDs-DM在脂质和水微环境中的图示以及在细胞、动脉粥样硬化和脂肪肝组织中的成像图；

图3为本发明的LDs-M0的¹H NMR图；

图4为本发明的LDs-M0的¹³C NMR图；

图5为本发明的LDs-HO的¹H NMR图；

图6为本发明的LDs-HO的¹³C NMR图；

图7为本发明的LDs-DM的¹H NMR图；

图8为本发明的LDs-DM的¹³C NMR图；

图9为本发明的LDs-DM的光物理性质图；

图10为本发明的LDs-HO的光物理性质图；

图11为本发明的LDs-MO的光物理性质图；

图12为本发明的LDs-DM、LDs-HO和LDs-MO在甲苯和水中的偶极矩图；

图13为本发明的LDs-DM在甲苯和水中的HOMO和LUMO能级图；

图14为本发明的LDs-HO在甲苯和水中的HOMO和LUMO能级图；

图15为本发明的LDs-HO在甲苯和水中的HOMO和LUMO能级图；

图16为本发明的粘度对双色荧光探针的荧光变化的影响图；

图17为本发明的LDs-DM在不同PBS缓冲溶剂中的荧光光谱图。

图18为本发明的LDs-DM(10μM)对磷酸盐缓冲液(pH 7.4，10mM)中各种相关分析物的荧光强度图；

图19为本发明的用不同浓度的LDs-DM处理L929和RAW 264.7的细胞活力图；

图20为本发明的用不同浓度的LDs-DM和尼罗红染色的10μM油酸预处理RAW 264.7细胞的共定位成像图；

图21为本发明的10μM油酸预处理RAW 264.7细胞与LDs-DM(500nM)共孵育的同时双色3D成像图；

图22为本发明的脂肪肝组织和动脉粥样硬化斑块中的成像图；

图23为本发明的健康小鼠(对照组)和脂肪肝小鼠肝组织的同时双色3D成像图；

图24为本发明的用LDs-DM和尼罗红染色的脂肪肝小鼠和正常小鼠肝组织的3D成像；

图25为本发明的在488nm单次激发下，在管腔内用500nM LDs-DM染色的人正常组织和脂肪肝组织的同时双色3D成像图；

图26为本发明的油红O(200×)染色的ApoE-/-小鼠主动脉血管切片图。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本申请实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

在下述实施例及相应的实验过程中使用的材料和仪器，除非另有说明，否则材料从商业供应商处获得，使用时无需进一步净化。本发明在Bruker AM400核磁共振谱仪上测量了 ¹H NMR、¹³C NMR谱。NMR谱的质子化学位移以ppm为单位。HRMS光谱数据记录在 Bruke-Daltonics生物飞行时间质谱仪上。吸收光谱和光致发光光谱分别在U-2910和日立 F-7000荧光分光光度计上进行。用尼康-双光子激光扫描共焦显微镜(CLSM)进行细胞和组织成像。

实施例1

一种靶向脂滴和水环境的双色荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

步骤一：向10mL无水乙醇中加入186mg 6-甲氧基-2-萘甲醛、132mg丙二腈和20μL哌啶得到混合溶液；

步骤二：将得到的混合溶液加热到80℃后回流反应3h；

步骤四：用3℃的无水乙醇对得到的双色荧光探针晶体进行洗涤后得到双色荧光探针 (LDs-M0)。

实施例2

步骤一：向10mL无水乙醇中加入172mg 6-羟基-2-萘甲醛、132mg丙二腈和20μL哌啶得到混合溶液；

步骤二：将得到的混合溶液加热到80℃后回流反应3h；

步骤四：用3℃的无水乙醇对得到的双色荧光探针晶体进行洗涤后得到双色荧光探针 (LDs-HO)。

实施例3

步骤一：向10mL无水乙醇中加入199mg 6-(二甲氨基)-2-萘甲醛、132mg丙二腈和20μL哌啶得到混合溶液；

步骤二：将得到的混合溶液加热到80℃后回流反应3h；

步骤四：用3℃的无水乙醇对得到的双色荧光探针晶体进行洗涤后得到双色荧光探针 (LDs-DM)。

实施例4

LDs-M0、LDs-HO和LDs-DM的化学结构的确定：

如图1和图2(该图真实的彩色实验图示详见其他证明文件的对应附图)所示，通过简单的一步反应合成了三种典型的D-π-A型荧光探针(LDs-DM、LDs-HO、LDs-MO)，然后通过HRMS、¹H NMR和¹³C NMR确定了三种双色荧光探针化学结构，其中LDs-M0的¹H NMR图如图3所示，¹³C NMR图如图4所示；LDs-HO的¹H NMR图如图5所示，¹³C NMR图如图6所示； LDs-DM的¹H NMR图如图7所示，¹³C NMR图如图8所示。

实施例5

LDs-M0、LDs-HO、LDs-DM光物理性质研究：

(1)三种双色荧光探针在不同溶剂中的光物理性质：

LDs-DM、LDs-HO和LDs-MO在不同溶剂中(甲苯(Toluene)、二恶烷(Dioxane)、乙酸乙酯(EtOAc)、丙酮(Acetone)、二甲基亚砜(DMSO)、水(H₂O))的光物理性质如表1 所示。如图9(图9中(A)为LDs-DM(10μM)在不同溶剂中的归一化吸收光谱图；(B) 为LDs-DM(10μM)在不同溶剂中的归一化荧光光谱图；(C)为LDs-DM(10μM)的最大荧光波长(λem)与不同极性(ET(30))之间的线性关系图；(D)为LDs-DM(10μM)在水和油中的荧光光谱图)、图10(图10中(A)为LDs-HO在不同溶剂中的吸光度图；(B) 为LDs-HO在不同溶剂中的荧光性质图；(C)为LDs-HO的最大发射波长与溶剂极性之间的线性关系图；(D)为LDs-HO在油和水中的荧光图(λex＝410nm，10μM))和图11(图 11中(A)为LDs-MO在不同溶剂中的吸光度图，(B)为LDs-MO在不同溶剂中的荧光性质图，(C)为LDs-MO的最大发射波长与溶剂极性之间的线性关系图；(D)为LDs-MO在油和水中的荧光图(λex＝380nm，10μM))中可以看出，三种双色荧光探针的最大吸收仅显示轻微位移，而LDs-DM、LDs-HO和LDs-M0的最大荧光发射显示从甲苯到水的正溶剂化变色，分别为184nm、76nm和99nm的光谱位移。此外，如图9(C)LDs-DM中溶剂极性和发射波长之间存在良好的线性关系。

总的来说，从随着极性的增加，荧光光谱的红移可能是由于激发态释放了更多的能量，形成了更稳定的状态。此外，分子偶极子在光子吸收时的显著变化可能导致溶剂化变色响应，导致激发态和基态的稳定能量不同。为了进一步验证三种探针的溶剂效应，在两种不同溶剂(甲苯和水)中进行了密度泛函理论(DFT)计算。如图12和图13-15所示，分子偶极矩随极性的增加而增加，能带隙随极性的增加而减小。这些结果与光物理性能一致，表明三种双色荧光探针的经典ICT效应。

其次，如图10(D)和图11(D)所示，LDs-HO和LDsMO在水中的最大荧光发射分别为531nm和534nm，但扣除背景荧光后，葵花籽油中几乎没有荧光。但如图9(D)所示，LDs-DM 在水中显示近红外荧光发射(707nm)，在油中显示亮绿色荧光发射(535nm)。从水到脂质环境的最大荧光发射峰可以达到172nm，这使得可以用作跟踪脂质和水微环境的单一探针，而无发射串扰。

表1

(2)粘度对双色荧光探针的荧光变化的影响：

粘度可能会限制LDs-DM中单键的自由旋转，从而影响荧光强度。首先如图16(A)(该图为LDs-DM在甲醇(Methanol)和甘油体系(Methanol-Glycerol)中不同粘度下的荧光光谱图)所示,LDs-DM在50％甘油体系中的荧光强度仅略高于在甲醇中的荧光强度。其次研究了 LDs-DM在甲醇和四氢呋喃(THF)中的荧光，因为这两种溶剂的极性非常不同(ET(30)＝55.4 vs 37.4)，但粘度几乎相同(0.6cP vs 0.53cP)。如图16(B)(该图为LDs-DM在四氢呋喃(THF)和甲醇(Methanol)中的荧光光谱图)所示，LDs-DM在四氢呋喃中的荧光强度远高于在甲醇中的荧光强度，最大发射蓝移，这表明粘度对LDs-DM的荧光变化影响较小。

(3)pH值对双色荧光探针的荧光强度的影响：

如图17所示，LDs-DM在不同pH溶液中的荧光几乎没有变化。

(4)LDs-DM对不同分析物的响应：

荧光探针的选择性对于探索生命系统中疾病的发展具有重要意义。LDs-DM对不同分析物的响应结果如图18所示。根据图18可以看出多种生物分子，如阴离子、阳离子和活性物种不会导致荧光变化，这表明LDs-DM在生命系统中的潜在生物成像应用。

实施例7

细胞毒性试验

本发明通过MTT法检测LDs-DM在细胞中的生存能力。具体方法为：L929细胞和RAW264.7细胞在37℃、5％的CO₂气氛下，在含有10％的胎牛血清的dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)的96孔微孔板中培养24小时。然后用含有不同浓度LDs-DM(1、5、10、15和 20μM)的新鲜培养基替换培养基，细胞再培养24小时。之后，添加最终浓度为0.5mg/mL 的MTT试剂，细胞在37℃下培养4小时。之后，移除培养基并向每个孔中添加150μL二甲基亚砜以溶解福尔马赞。最后，使用多功能酶标仪测量490nm处的吸光度。

如图19所示，RAW 264.7细胞和L929细胞在与20μM LDs-DM孵育24小时后的存活率均保持在80％以上，这表明LDs-DM的细胞毒性较低。

实施例8

细胞成像实验

将RAW 264.7细胞在玻璃底培养皿中培养24小时。然后，移除培养基并用含有10μM油酸的无血清培养基替换。培养2h后，用PBS洗涤原始264.7细胞三次，并用含有1μM LDs-DM的新培养基再处理1h。然后，在去除培养基后，用尼罗红(1μM，在无血清培养基中)进一步染色细胞0.5h。最后，用PBS再次洗涤细胞三次，并通过CLSM成像。

为了进一步研究LDs-DM的LDs成像能力，在培养皿中培养的RAW 264.7细胞用10μM油酸处理2h，然后分别用不同浓度的LDs-DM(500nM、100nM和20nM)染色1h和尼罗红染色0.5h。最后，用PBS洗涤细胞三次，并通过CLSM成像。

为了研究LDs-DM在揭示水/脂界面或观察细胞微观结构方面的成像能力，LDs-DM用于油酸处理的RAW 264.7细胞的LDs染色(500nM)。LDs-DM的荧光信号分别在FITC通道(λem＝500-550nm)和Cy5通道(λem＝663-738nm)采集。

油酸可以诱导活细胞产生脂质。13h后，研究LDs-DM的LDs标记能力。RAW 264.7细胞用油酸预处理，然后用不同浓度的LDs-DM和尼罗红(Nile Red)孵育。如图20(该图真实的彩色实验图示详见其他证明文件的对应附图)(比例尺为25μm)所示，LDs-DM(λex＝488nm，λem＝500-550nm)显示绿色荧光信号，而尼罗红(1μM，λex＝488nm，λem＝570-620 nm)显示红色荧光信号。两种荧光信号融合良好，主要位于细胞质上，即使在低浓度LDs-DM(20nm)下，皮尔逊系数(Rr)也高达97％。这些结果表明，LDs-DM可用于低浓度LDs的特异性标记。

然后，用油酸处理RAW 264.7细胞，并获得FITC通道和Cy5通道中的三维图像，所述三维图像如图21(对于FITC通道，λex＝488nm，λem＝500-550nm；对于Cy 5通道，λex＝488nm，λem＝663-738nm，比例尺为20μm)(该图真实的彩色实验图示详见其他证明文件的对应附图)所示。在相同的激光激发下，FITC通道中LDs-DM的荧光可以特异性染色LDs，而明亮的近红外发射也可以在细胞质中收集。此外，两个通道的荧光几乎没有融合。这些结果表明，LDs-DM在实时跟踪LDs产生和成像水和脂质微环境方面有着广阔的应用前景，而活细胞中没有发射串扰。

实施例9

双色荧光探针在区分脂肪肝组织和动脉粥样硬化斑块中的水区域和脂质区域方面的应用

Balb/c雌性小鼠每七天皮下注射含有0.3％四氯化碳(质量比)的200μL橄榄油(共三次)。三周后，处死小鼠，分离肝脏并立即用PBS清洗，然后用LDs-DM和尼罗红或仅LDs-DM染色。部分肝组织用多聚甲醛溶液固定，进一步进行苏木精-伊红(H&E)染色和油红染色。开放的动脉血管壁中的苍白病变(如图22(A)(该图为ApoE-/-小鼠主动脉开放的正面照片)所示，该图真实的彩色实验图示详见其他证明文件的对应附图)和主动脉血管的油红O染色结果(如图26所示，该图真实的彩色实验图示详见其他证明文件的对应附图)表明AS小鼠模型的成功构建。动脉血管壁上斑块的形成是AS的一个典型特征，这将进一步诱发一系列心脏病。脂质代谢紊乱和LDs在动脉血管壁的异常积聚会诱发和促进动脉粥样硬化斑块的形成。因此，开发了载脂蛋白E-/-(雌性)作为小鼠模型，以研究LDs-DM是否可用于靶向LDs功能非常有必要。

然后用LDs-DM和尼罗红染色的苍白病变在不同深度进一步成像。如图22(C)(该图为为在不同成像深度用LDs-DM(500nM)和尼罗红(1μM)染色的动脉粥样硬化斑块图(比例尺为200μM)，该图真实的彩色实验图示详见其他证明文件的对应附图)所示，即使在120μm的深度也观察到亮绿色荧光。如图22(B)(该图为LDs-DM(500nM)和尼罗红(1μM)染色的动脉粥样硬化斑块微观结构的同时3D成像图，该图真实的彩色实验图示详见其他证明文件的对应附图)所示，LDs-DM和尼罗河红的荧光图像在不同深度以及3D重建图像中融合良好。这些结果证明了LDs在AS中的积累以及LDs-DM的巨大LDs特异性成像能力。

如图22D(该图为在488nM单次激发下，用500nM LDs-DM在管腔内同时对动脉粥样硬化斑块和主动脉组织的微观结构进行双色3D成像图(分离发射范围为500-550nM和 663-738nM，比例尺为70μM)，该图真实的彩色实验图示详见其他证明文件的对应附图) 中的3D重建图像，与仅在LDs区域发射单一荧光的正常荧光团不同，LDs-DM在局部脂质区域(绿色荧光)和水区域(红色荧光)显示出明亮的荧光，几乎没有荧光串扰，这使得它能够精确区分病变和正常区域。在LDs-DM的双发射成像中，可以很容易地观察到AS早期的脂肪条纹(如图22(D)所示)。小体积的脂质堆积很容易观察到，这表明LDs-DM可以用来研究AS的发育过程。这些结果表明，LDs-DM有望准确预测AS的进展。

实施例10

双色荧光探针在区分正常人体组织和脂肪肝组织方面的应用。

肝脏中LDs的大量积累会导致脂肪肝，进而引发不可逆的肝功能障碍。因此，脂肪肝的诊断和鉴别脂质区与正常区对预防疾病发展具有重要意义。为此，通过高脂饮食和皮下注射四氯化碳建立脂肪肝小鼠模型。如图23所示(该图真实的彩色实验图示详见其他证明文件的对应附图)，进行H&E、Masson和油红O染色，与对照组相比，脂肪肝小鼠的组织显示出明显的LDs积聚、炎性细胞浸润和纤维化，表明成功建立了小鼠模型。

通过图24(比例尺为50μm，该图真实的彩色实验图示详见其他证明文件的对应附图) 可以看出LDs-DM在脂肪肝组织中LDs靶向的潜在能力。与常规喂养小鼠体内的LDs均匀和少量相比，脂肪肝组织中的LDs越来越大，荧光增强程度也越来越大。此外，LDs-DM(500nM，λex＝488nM，λem＝500-550nM)和尼罗红(1μM，λex＝488nM，λem＝570-620nM) 的荧光融合良好，Rr值较高，在健康小鼠和脂肪肝小鼠中分别达到88.19％和99.09％。更重要的是，LDs-DM不仅可以成功地应用于脂肪肝组织中的LDs图像，如图23所示，还可以使用不同的荧光通道来区分脂质区域和正常区域(在488nM单次激发下，在管腔内用500nM LDs-DM染色，分离发射范围为500-550nM和663-738nM，标尺为70μm，正常小鼠和脂肪肝小鼠的H&E、masson和油红O染色，所有组织200×)。

如图25(分离发射范围为500-550nm和663-738nm，刻度尺为70μm，该图真实的彩色实验图示详见其他证明文件的对应附图)所示，与正常人肝组织中的弱荧光和少量LDs相比，脂肪肝患者中的LDs和亮绿色荧光在LDs-DM染色后可以检测到更大的尺寸。此外，在没有荧光串扰的人体脂肪肝组织中，具有绿色荧光和红色荧光的LDs-DM的双重发射特性更为明显。人体组织样本的结果表明，LDs-DM在临床诊断脂肪肝方面具有很大的潜力。

通过上述实施例表明，本申请提供了的三种具有不同给电子基团的推拉荧光探针。其中，在相同的激发波长下，LDs-DM在水中表现出近红外发射，在油中表现出绿色发射，实现了细胞内脂滴和水环境的特异性荧光成像。同时，LDs-DM对活细胞和组织中的脂滴具有良好的生物相容性和高度的特异性。此外，由于LDs-DM具有良好的双发射特性和优异的光物理特性，因此在无组织切片的情况下成功应用于区分脂肪肝组织和动脉粥样硬化斑块中的水区域和脂质区域。LDs-DM可用于区分正常人肝组织和脂肪肝患者的肝组织。因此， LDs-DM在预测脂肪肝的进展、更准确地指导有效治疗方面具有巨大潜力。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims

1.一种靶向脂滴和水环境的双色荧光探针，其特征在于：所述双色荧光探针的结构式为

其中R为甲氧基、羟基或氮二甲基中的一种。

2.一种如权利要求1所述的靶向脂滴和水环境的双色荧光探针的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：

其中R为甲氧基、羟基或氮二甲基中的一种；

步骤二：将得到的混合溶液加热到70-80℃后回流反应3-8h；

步骤四：用0-4℃的洗涤剂对得到的双色荧光探针晶体进行洗涤后得到双色荧光探针。

3.根据权利要求2所述的一种靶向脂滴和水环境的双色荧光探针的合成方法，其特征在于：所述萘醛化合物、丙二腈和有机溶剂的摩尔比为1：(1-1.2)：(50-200)。

4.根据权利要求2所述的一种靶向脂滴和水环境的双色荧光探针的合成方法，其特征在于：所述加入催化剂的体积为有机溶剂的体积的0.05-0.5％。

5.根据权利要求2所述的一种靶向脂滴和水环境的双色荧光探针的合成方法，其特征在于：所述催化剂为哌啶、1,5-二氮杂双环[4.3.0]-5-壬烯、四甲基胍、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、4-二甲基氨砒啶、N,N-二甲基乙醇胺或氮甲基吗啡啉中的一种。

6.根据权利要求2所述的一种靶向脂滴和水环境的双色荧光探针的合成方法，其特征在于：所述有机溶剂为无水乙醇或甲醇中的一种。

7.根据权利要求2所述的一种靶向脂滴和水环境的双色荧光探针的合成方法，其特征在于：所述洗涤剂为无水乙醇、甲醇、丙酮或乙醚中的一种。

8.一种如权利要求1所述的靶向脂滴和水环境的双色荧光探针在区分脂肪肝组织和动脉粥样硬化斑块中的水区域和脂质区域方面的应用。

9.一种如权利要求1所述的靶向脂滴和水环境的双色荧光探针在区分人体正常组织和脂肪肝组织方面的应用。