CN109535020A - 一种荧光探针及其制备及在动脉粥样硬化斑块荧光成像中的应用 - Google Patents

一种荧光探针及其制备及在动脉粥样硬化斑块荧光成像中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于荧光材料的技术领域，公开了一种荧光探针及其制备及在动脉粥样硬化斑块荧光成像中的应用。所述荧光探针结构为式I。本发明还公开了荧光探针的制备方法。本发明的荧光探针用于动脉粥样硬化斑块荧光成像剂，特别动脉粥样硬化斑块中小沟槽区域红色荧光成像剂和动脉粥样硬化斑块中脂滴绿色荧光成像剂。同时本发明的荧光探针还可用于细胞内脂滴荧光成像剂，形成绿色荧光。本发明的荧光探针在油相和水相具有不同发光颜色；而且本发明的荧光探针具有活细胞穿透速率快、信噪比高、细胞毒性小、近红外区大的双光子吸收截面等优点。

Description

一种荧光探针及其制备及在动脉粥样硬化斑块荧光成像中的 应用
技术领域
本发明属于荧光检测领域，具体涉及一种能够形成激基缔合物的荧光探针及其制备方法与在动脉粥样硬化斑块荧光成像中的应用。
背景技术
脂滴是脂类分子的贮存场所，与许多疾病密切相关。例如，动脉粥样硬化斑块内脂滴的含量明显增加。为了揭示脂滴在动脉粥样硬化斑块中的分布及生理意义，迫切需要开发在油相和水相具有不同发光颜色的荧光探针。另外，针对动脉粥状斑块成像的荧光探针，需克服传统荧光材料的聚集猝灭发光的缺陷，还需具有大的近红外双光子吸收截面值，从而通过双光子激发荧光成像，有效降低背景噪音，提高深层穿透能力和成像分辨率。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种在油相和水相具有不同发光颜色的荧光探针。
本发明的另一目的在于提供上述荧光探针的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述荧光探针的应用。所述荧光探针用作动脉粥样硬化斑块荧光成像剂或细胞内脂滴荧光成像剂。利用该探针实现动脉粥样硬化斑块中小沟槽区域的红色荧光成像；同时利用该探针实现动脉粥样硬化斑块内脂滴特异性的单光子和双光子激发的绿色荧光成像。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种荧光探针，其结构为式I：
其中R1为氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-8烷基、C1-8烷基氧基(R-O-，R为烷基)、C1-8烷基硫基((R-S-，R为烷基))；R2为氢、卤素、氰基、C1-6烷基、芳基、杂芳基；
所述的烷基为直链或支链烷基；优选为甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、叔丁基；
所述的芳基指具有6-20个碳原子的单环或多环芳族基团，优选为苯基、萘基、蒽基或芘基；
所述的杂芳基指具有1-20个碳原子、1-4个选自N、S、O杂原子的单环或多环杂芳族基团，优选为吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噻唑基、吲哚基、氮杂萘基、氮杂蒽基或氮杂芘基；
优选地，R1为氢，R2为氢。
上述式I化合物的制备方法，包括以下步骤：
将式II化合物和式III化合物溶解于有机溶剂中，在惰性气体保护和碱的作用下，回流反应，得到式I化合物；
式II化合物的结构为式III化合物的结构为
其中R1为为氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-8烷基、C1-8烷基氧基、C1-8烷基硫基；R2为氢、卤素、氰基、C1-6烷基、芳基、杂芳基。R1、R2的定义与式I中相同。
所述式II化合物和式III化合物的摩尔比为1:1～1:1.5，优选为1:1；所述惰性气体为氮气，所述碱为吗啡啉、哌啶、氢氧化钠、氢氧化钾。
所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜，优选为乙醇；所述反应时间为1～5小时；所述反应的温度为60-80℃，优选为78℃。
所述碱的用量与式II化合物、式III化合物的摩尔比为1:1:1。
上述的荧光探针用于动脉粥样硬化斑块荧光成像剂，特别是动脉粥样硬化斑块中小沟槽区域的荧光成像剂(小沟槽区域红色荧光成像剂)，实现动脉粥样硬化斑块中小沟槽区域的红色荧光成像。
上述的荧光探针用于细胞内脂滴荧光成像剂，特别是细胞内脂滴的特异性绿色荧光成像剂，实现细胞内脂滴的特异性绿色荧光成像。
所述细胞为人单核THP-1细胞、泡沫细胞。
上述的荧光探针用于动脉粥样硬化斑块内的脂滴荧光成像剂，特别是动脉粥样硬化斑块内脂滴的特异性绿色荧光成像剂，实现动脉粥样硬化斑块内脂滴的特异性绿色荧光成像。
上述的荧光探针用于水相和油相的双色荧光成像。所述油相优选为脂相。
式I化合物的荧光探针对细胞内脂滴的特异性荧光成像，通过与商用脂滴染料油红O进行共染得到了证实。
式I化合物的荧光探针在近红外区(800-1000nm)具有大的双光子吸收截面，可用于脂滴特异性的双光子激发荧光成像，具有高信噪比的优点。
值得注意的是，本发明制备的式I化合物的发光不同于传统的荧光成像，而是表现出聚集诱导形成激基缔合物发光的性质，这意味着在油相条件下，式I化合物以单分子形式分散，发出绿色荧光(斯托克位移约为56nm)；而在水相条件下，式I化合物通过形成激基缔合物，发出红色荧光(斯托克位移约为148nm)。
需强调的是，在现有技术中，未有文献报道过本发明的式I化合物所具有的独特的在油相与水相的不同颜色的发光行为。
上述荧光探针的反应方程式：
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明的化合物可实现活细胞内脂滴的特异性荧光成像，而且具有易于制备、在近红外区具有大的双光子吸收截面值、成像信噪比高、细胞毒性小、可快速进入活细胞等优点。
2、本发明的化合物在水相条件下，通过形成激基缔合物，发出红色荧光(斯托克位移约为148nm)，可以用于动脉粥样硬化斑块中小沟槽区域的荧光成像(通过形成激基缔合物的荧光成像)。
附图说明
图1为化合物I-1在四氢呋喃中的紫外-可见吸收光谱(10-5mol·L-1)；
图2为化合物I-1的荧光发射光谱图；(A)为化合物I-1(10-5mol·L-1)在四氢呋喃和水的混合溶液中不断增加水含量的荧光发射光谱图；(B)为化合物I-1在四氢呋喃和水的混合溶液中不断增加水含量的最大荧光发射波长和强度变化图；
图3为化合物I-1(10-5mol·L-1)在油相和水相的荧光图；(A)为化合物I-1在油相和水相的荧光照片；(B)为化合物I-1在油相和水相的荧光光谱图；(C)为化合物I-1在油相和水相的分布行为的示意图；
图4为化合物I-1(10-5mol·L-1)在水相中的粒径分布图；
图5为化合物I-1(10-5mol·L-1)的双光子吸收截面值曲线图；
图6为化合物I-1针对HeLa细胞的细胞毒性图；
图7为化合物I-1染色后泡沫细胞脂滴荧光图和流式细胞术分析情况图；(A)油红O与化合物I-1共染后细胞内脂滴共定位情况的荧光图(单光子)；(B)化合物I-1染色后泡沫细胞脂滴双光子荧光图；(C)加入不同浓度氧化低密度脂蛋白(oxLDL)处理的泡沫细胞经化合物I-1染色后的双光子荧光图像；(D)加入不同浓度氧化低密度脂蛋白(oxLDL)处理的泡沫细胞的平均荧光强度分析(流式细胞术分析)；
图8为化合物I-1染色后HeLa脂滴荧光图流式细胞术分析情况图；(A)加入不同浓度油酸处理后HeLa细胞的荧光图像；(B)加入不同浓度油酸处理后的HeLa细胞的平均荧光强度分析；
图9为化合物I-1对ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块染色后的荧光图像；(A)染色前后斑块区域及非斑块区域在白光(左边的图)以及紫外光下(右边的两幅图，上图为非斑块区域，下图为斑块区域)的图像；(B)斑块脂质经化合物I-1染色后的双光子低倍荧光图像(单通道)；(C)斑块内部不同层面的脂质双光子荧光图像；(D)斑块脂质经化合物I-1染色后的双光子荧光图像(放大，双通道)(图D中从左至右分别为脂质区的绿色荧光图，沟槽区的红色荧光图和二者的叠加图)；(E)化合物I-1在斑块内部脂相与油相的分布示意图；
图10为ApoE-/-小鼠动脉切片经苏木精-伊红染色图像；(A)正常动脉壁结构；(B)发生动脉粥样斑块的动脉壁结构；
图11为化合物I-1对ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块染色后的高倍双光子荧光图像；(A)斑块三维重构图像；(B)斑块内部不同层面的脂质分布图；(C)斑块内部不同层面的荧光定量分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下面以化合物I-1为例进行具体说明。
实施例1
化合物I-1：2-(4-(二丁胺基)苯亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(R1＝氢，R2＝氢)，其结构式如下：
化合物I-1的制备方法，包括以下步骤：
4-二丁胺基苯甲醛(233mg，1.0mmol)，1,3-茚二酮(146mg，1.0mmol)和吗啡啉(85mg，1.0mmol)溶于5mL乙醇中，随后在氮气保护下，回流反应(78℃下反应3小时)；待反应结束，恢复至室温后，过滤后真空干燥得到红色固体产物2-(4-(二丁胺基)苯亚甲基)-1H-茚-1,3(2H)-二酮(260mg，产率72％)。有关结构表征数据如下：
1H NMR(DMSO-d6,500MHz):δδ8.51(d,J＝8.0Hz,2H),7.93–7.90(m,2H),7.78(s,1H),7.77–7.70(m,2H),6.73(d,J＝8.5Hz,2H),3.41(t,J＝8.0Hz,4H),1.66–1.62(m,4H),1.42–1.37(m,4H),0.99(t,J＝7.0Hz,6H)；13C NMR(CD3Cl,125MHz):δ191.9,190.1,147.3,142.2,139.9,138.2,134.3,134.0,122.4,111.5,51.1,29.4,20.2,13.9；HRMS(ESI):m/z[M+Na]+calcd for C24H27NNaO2,384.1939；found 384.1937.
实施例2
化合物I-1的光物理性质表征：
(1)将四氢呋喃和水按照不同的体积比(四氢呋喃:水＝100:0，90:10，80:20，70:30，60:40，50:50，40:60，30:70，20:80，10:90，1:99)混合，形成含水量(fw)不同的混合液，将化合物I-1溶解到这些混合液中，使化合物的浓度为10-5mol·L-1，随后检测荧光发射光谱和在四氢呋喃中的紫外-可见吸收光谱。图1为化合物I-1的紫外-可见吸收光谱图；图2为化合物I-1的荧光发射光谱图，其中图2(A)为化合物I-1在四氢呋喃和水的混合溶液中不断增加水含量的荧光发射光谱图(10-5mol·L-1)；图2(B)为化合物I-1在四氢呋喃和水的混合溶液中不断增加水含量的最大荧光发射波长和强度变化图。
从图2可以看出，当不断增加混合溶液体系中的水含量至80％时，化合物I-1的荧光首先减弱，荧光发射波长不断红移，这是由于扭曲的分子内电荷转移效应造成的。进一步在四氢呋喃和水的混合溶剂体系中增加水的比例至99％时，化合物I-1的溶解度降低从而聚集，荧光强度迅速增强，荧光发射波长的红移明显增加至632nm，这是由于形成激基缔合物且分子内运动受限造成的。
(2)另外，本发明的化合物I-1在形成晶体时，在晶体中，单分子的化合物I-1通过π…π作用形成了二聚体(π平面距离为)，二聚体与二聚体之间存在C-H…O作用(其中C-H是指化合物I-1的1,3-茚二酮结构中苯环上的C-H，O是指化合物I-1的1,3-茚二酮结构中酮上的O)。本发明的化合物I-1通过π…π作用形成的晶体堆积，这是通过晶体堆积图得到验证的。
(3)通过检测化合物I-1(10-5mol·L-1)在油相和水相中的荧光光谱，见图3。图3为化合物I-1(10-5mol·L-1)在油相(绿色)和水相(红色)的荧光图；(A)为化合物I-1在油相和水相的荧光照片；(B)为化合物I-1在油相和水相的荧光光谱图；(C)为化合物I-1在油相和水相的分布行为的示意图。进一步证实了化合物I-1在油相中以单分子形式存在，在水相中以二聚体形式堆叠在一起。
图4为化合物I-1(10-5mol·L-1)在水相中的粒径分布图。从图4可知，化合物I-1在水相中形成的平均纳米粒径为52.3nm。
(4)通过测量化合物I-1在四氢呋喃和水的混合溶液(四氢呋喃:水＝100:0，30:70，20:80，1:99)以及固态下的量子产率和荧光寿命(见表1)，发现相对于在水含量为80％的混合溶液中，化合物I-1在水含量为99％的混合溶液中的量子产率增加了32.67倍，荧光寿命增加了3.03倍，辐射速率增加了10.6倍，非辐射速率降低了3.36倍。而且化合物I-1在水含量为99％的混合溶液中和固态下的斯托克位移分别为139和122nm，进一步证实了其形成了激基缔合物。
表1化合物I-1在四氢呋喃和水的混合溶液以及固态下的测试参数
(5)通过在近红外区检测化合物I-1的双光子吸收截面值，发现其在900nm处，具有最大的双光子吸收截面值为33.4GM(图5)。
图5为化合物I-1(10-5mol·L-1)的双光子吸收截面值曲线图。
实施例3
化合物I-1的细胞毒性实验：
化合物I-1针对HeLa的细胞毒性的实验结果如图6所示。图6为化合物I-1针对HeLa细胞的细胞毒性图。该结果表明，化合物I-1在不同浓度下(0，2.5，5.0，10，20μM)都几乎没有细胞毒性。
实施例4
化合物I-1在脂滴特异性荧光成像中的应用：我们利用泡沫细胞(一种见于动脉粥样硬化组织中富含脂质的巨噬细胞)为模型，考察了化合物I-1的染色效果。泡沫细胞由人单核细胞系THP-1在佛波酯诱导为贴壁巨噬细胞后，与氧化低密度脂蛋白孵育，刺激分化而成。
图7为化合物I-1染色后泡沫细胞脂滴荧光图和流式细胞术分析情况图；(A)油红O与化合物I-1共染后细胞内脂滴共定位情况的荧光图(单光子)；(B)化合物I-1染色后泡沫细胞脂滴双光子荧光图；(C)加入不同浓度氧化低密度脂蛋白(oxLDL)处理的泡沫细胞经化合物I-1染色后的双光子荧光图像；(D)加入不同浓度氧化低密度脂蛋白(oxLDL)处理的泡沫细胞的平均荧光强度分析(流式细胞术分析)。
如图7A所示，泡沫细胞在化合物I-1孵育后，荧光显微镜下胞浆内可见大小不一的绿色荧光点，我们随之使用脂质染料油红O染色后，在普通显微镜下观察，在泡沫细胞绿色荧光阳性的相同区域可以观察到油红O染色共定位并且分辨率提高的点状绿色荧光，表明化合物I-1选择性定位于细胞内脂滴。我们随后进一步探索化合物I-1在活细胞中的双光子成像效果，如图7B所示。活泡沫细胞与化合物I-1孵育20分钟后，活细胞中荧光标记脂滴可以在900nm激发时清晰可见，并且背景荧光非常低。荧光的信噪比和成像质量均明显优于单光子荧光图像，这使得细胞内脂滴可以在纳米尺度上高分辨率成像(图7B)并重构出高质量的三维图像。我们接下来探讨脂质合成诱导物对活细胞内化合物I-1荧光变化的影响。在双光子显微镜下，我们可清楚地看到oxLDL处理显著增加了活泡沫细胞中荧光脂滴的数量和体积(图7C)。与观察结果一致，流式细胞分析表明随着ox-LDL处理浓度的增加，细胞平均荧光强度值呈浓度依赖性地增加(图7D)。
相似的实验趋势在另一种细胞模型中(使用油酸诱导HeLa细胞中脂质生成)亦可观察得到(图8)。图8为化合物I-1染色后HeLa脂滴荧光图流式细胞术分析情况图；(A)加入不同浓度油酸处理后HeLa细胞的荧光图像；(B)加入不同浓度油酸处理后的HeLa细胞的平均荧光强度分析。油酸处理显著增加了细胞中荧光脂滴的数量和体积。
以上数据表明化合物I-1是一种可高效、特异地标记细胞脂质的荧光探针，并可适用于双光子生物成像和细胞脂质的定量分析。
实施例5
化合物I-1在动脉粥样硬化斑块成像成像中的应用：化合物I-1在体外培养细胞系中的优异特性促使我们进一步探索其组织水平上的应用效果。我们以动脉粥样硬化-一种以动脉脂质异常沉积为特征的常见疾病作为研究模型。动物模型由载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠喂食高脂饮食6月所构建，小鼠主动脉经麻醉、放血、固定后仔细分离所得。主动脉被仔细分离并纵向展开，随之通过化合物I-1染色1分钟后在UV照射下观察。图9为化合物I-1对ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块染色后的荧光图像；(A)染色前后斑块区域及非斑块区域在白光(左边的图)以及紫外光下(右边的两幅图，上图为非斑块区域，下图为斑块区域)的图像；(B)斑块脂质经化合物I-1染色后的双光子低倍荧光图像(单通道)；(C)斑块内部不同层面的脂质双光子荧光图像；(D)斑块脂质经化合物I-1染色后的双光子荧光图像(放大，双通道)(图D中从左至右分别为脂质区的绿色荧光图，沟槽区的红色荧光图和二者的叠加图)；(E)化合物I-1在斑块内部脂相与油相的分布示意图。
如图9所示，在UV灯照射下，我们可以清楚地看到动脉的特定区域发出强烈的绿色荧光(图9A的右下图，斑块区域)，并且绿色荧光区域与日光下血管内壁上白色沉积物质分布一致，其余区域无可见荧光。我们随后将动脉置于双光子荧光显微镜下，分析其形态特点。如图9B所示，在双光子荧光成像下荧光区域呈现极高的信噪比，这使得斑块的形状、大小以及区域均清晰可见，低倍镜下可见斑块内大小不等的脂质点。值得一提的是，我们在斑块周围观察到呈现一定规律的纹路结构，该条纹大小约10微米宽，呈纵向波浪形平行排列，局部放大可见荧光信号主要源于动脉内膜下的条带形点状信号(图9B)，结合动脉组织学分析，我们推测该条带为聚集于动脉内膜下，因动脉收缩轻微隆起而形成的内膜下脂质积聚结构，并将其命名为微脂纹(Micro Fatty Streak)。我们进一步通过双光子显微镜连续扫描模式，对动脉斑块进行逐层连续扫描。如图9C所示，化合物I-1良好的光稳定性使其可经受长时间的连续荧光扫描(约2小时)而仍然维持高荧光强度并实现斑块深层成像：在900nm激光的激发下可逐层观察斑块的脂质组成，最大深度可达表层下400μm处，这得益于化合物I-1的高亮度、良好的双光子成像性质以及在长波长激发下更强的组织穿透能力与更低的组织散射干扰。有趣的是，我们在绿色微脂纹条带间可观察到条状红色荧光的细小晶体，与微脂纹相间平行排列(图9D)。结合化合物I-1的光物理学特性，我们推测该结晶是由于化合物I-1与动脉孵育后，在动脉内层微皱褶内的微量水溶液中析出形成固态红色荧光结晶所致(图9E)。这种水相(红色)与脂相(绿色)荧光的显著差异，有助于我们同时可视化地分析组织的组成差异与微观结构。这对复杂生物体脂/水相双色成像具有重要意义：例如在血管成像中，化合物I-1可以充当脂质区域(如动脉粥样硬化斑块)与血液(水相)同时双色成像且无需变换激光通道，并可用于位置的相互校正。
图10为ApoE-/-小鼠动脉切片经苏木精-伊红染色图像；(A)正常动脉壁结构；(B)发生动脉粥样斑块的动脉壁结构。荧光区域利用组织切片HE染色可见为主动脉内膜增厚，内膜下可见大量脂质积聚以及胆固醇结晶(图10A)，表明荧光区域为动脉斑块区域(图10B)，而无荧光区域则为正常动脉组织结构(图10A)。
脂质的数量、大小、形态以及分布对相关研究具有重要价值。我们紧接着在双关子荧光显微镜高倍镜下分析化合物I-1对脂质成像的精度。为此，我们选取一动脉中极小的脂斑作为分析对象，并在高倍镜下做双光子逐层扫描。如图11所示。图11为化合物I-1对ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块染色后的高倍双光子荧光图像；(A)斑块三维重构图像；(B)斑块内部不同层面的脂质分布图(i-iv是斑块内部深度依次加深的层面图，依次为5、10、15及20μm。v是正常的动脉内膜的荧光成像图)；(C)斑块内部不同层面的荧光定量分析图。
在双光子显微镜下，我们可以清晰地观察到微小脂斑中散在分布的脂质分布，脂质在化合物I-1的荧光染色中可明显呈现出其形态的异质性，通过双光子逐层扫描，我们可高分辨地逐层分析脂斑中各层的脂滴形态特点，结合软件我们可简便地原位测量脂斑每层的脂滴数目、大小以及分布(图11B、C)，并重构出高质量的三维立体图像(图11A)。从中我们可测出该脂斑在z轴深度为5、10、15及20μm处的脂质数目随着横截面积的增大而增多，数目分别为64、228、404以及662个，大多数脂质体积小于30μm2，其中最大的脂质位于15μm深截面处，面积可达到241.6μm2(图11C)。而在脂斑外的正常动脉内皮中脂质密度明显少于脂斑中，面积也更小(均小于2μm2)。得益于化合物I-1优异光学特性，组织中脂质的成像分辨率可达纳米级，并且可无损、原位、三维分析感兴趣组织区域的脂质分布，这比传统化学染色方法需作逐层切片染色及复杂的染色过程要显著简便，并且具传统脂质染料方法无可比拟的分辨率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种荧光探针，其特征在于：结构为式I：
其中R1为氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-8烷基、C1-8烷基氧基、C1-8烷基硫基；R2为氢、卤素、氰基、C1-6烷基、芳基、杂芳基。
2.根据权利要求1所述荧光探针，其特征在于：所述烷基为甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、叔丁基；
所述芳基指具有6-20个碳原子的单环或多环芳族基团；
所述杂芳基指具有1-20个碳原子、1-4个选自N、S、O杂原子的单环或多环杂芳族基团。
3.根据权利要求2所述荧光探针，其特征在于：
所述芳基为苯基、萘基、蒽基、芘基；
所述杂芳基为吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噻唑基、吲哚基、氮杂萘基、氮杂蒽基或氮杂芘基。
4.根据权利要求1所述荧光探针，其特征在于：R1为氢，R2为氢。
5.根据权利要求1～4任一项所述荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
将式II化合物和式III化合物溶解于有机溶剂中，在惰性气体保护和碱的作用下，回流反应，得到式I化合物；
式II化合物的结构为式III化合物的结构为其中R1、R2如权利要求1中式I所定义。
6.根据权利要求5所述荧光探针的制备方法，其特征在于：所述式II化合物和式III化合物的摩尔比为1:1～1:1.5；所述惰性气体为氮气，所述碱为吗啡啉、哌啶、氢氧化钠、氢氧化钾；
所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜；
所述反应时间为1～5小时；所述反应的温度为60-80℃。
7.根据权利要求1～4任一项所述荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光探针用于动脉粥样硬化斑块荧光成像剂。
8.根据权利要求7所述荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光探针用于动脉粥样硬化斑块中小沟槽区域荧光成像剂和/或动脉粥样硬化斑块内脂滴荧光成像剂。
9.根据权利要求1～4任一项所述荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光探针用于细胞内脂滴荧光成像剂。
10.根据权利要求1～4任一项所述荧光探针在水相和油相的双色荧光成像中的应用。
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