CN114314858A - 一种控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂 - Google Patents
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Abstract
一种控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂，所述复合微生态菌剂是通过菌剂的海藻酸钠小球、胞外活性物质、高岭土、硫酸铝钾、氯化钙复配而成，所述复合微生态菌剂包括如下质量份数的组份：高岭土50‑60份、菌剂的海藻酸钠小球35‑45份、氯化钙1‑2份、硫酸铝钾0.5‑1份、胞外活性物质0.002‑0.003份；所述菌剂是以溶藻菌和反硝化聚磷菌为受试菌株通过细胞融合方法制备得到。本发明所述的控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂，配方设计合理，提高了复合微生态菌剂的絮凝效果，菌剂是以溶藻菌和反硝化聚磷菌为受试菌株通过细胞融合方法制备得到，结合了溶藻菌的溶藻能力与反硝化聚磷菌的脱氮除磷能力，提高了控制水体中丝状藻生长的效果，应用前景广泛。
Description
技术领域
本发明属于控藻技术领域，具体涉及一种控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂。
背景技术
丝状藻华指在浅水河道河岸两侧，水流缓慢区域，水体透明度高，水生植物少的区域大型丝状绿藻或丝状蓝藻体的爆发性繁殖现象。丝状藻类的爆发会大量消耗水体中的溶解氧，造成水体营养物质过剩，引起水体二次污染，堵塞鱼类、虾类、双壳类贝壳等的鳃，使其无法呼吸而窒息死亡。
因此，当作为饮用水水源地的水体发生丝状藻华时，无疑将对居民饮水安全造成严重威胁，因此，控制水体中丝状藻生长成为改善水体生态环境、保障供水安全的当务之急。削减水体的营养物质是治理丝状藻华的重要手段，其中，微生物控藻法因其生态安全性好、专一性强等优势，具有较好的应用前景。微生物控藻法控藻这项技术的关键在于获得性能优异的菌株，需要从自然界筛选的溶藻菌兼具高效溶藻和良好的环境适应力。因此，需要研发出一种控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂。
中国专利申请号为 CN201911373674.5公开了具有溶藻活性的假单胞菌及其应用，其公开了一种具有溶藻活性的假单胞菌，具有较高的溶藻效率，将其制成菌体包埋小球后投入蓝藻水华水样中，再辅加一定浓度的葡萄糖作为能源补充，具有良好的控制蓝藻水华的效果。
发明内容
发明目的：为了克服以上不足，本发明的目的是提供一种控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂，配方设计合理，提高了复合微生态菌剂的絮凝效果，菌剂是以溶藻菌和反硝化聚磷菌为受试菌株通过细胞融合方法制备得到，结合了溶藻菌的溶藻能力与反硝化聚磷菌的脱氮除磷能力，提高了控制水体中丝状藻生长的效果，应用前景广泛。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂，所述复合微生态菌剂是通过菌剂的海藻酸钠小球、胞外活性物质、高岭土、硫酸铝钾、氯化钙复配而成，所述复合微生态菌剂包括如下质量份数的组份：高岭土50-60份、菌剂的海藻酸钠小球35-45份、氯化钙1-2份、硫酸铝钾0.5-1份、胞外活性物质0.002-0.003份；所述菌剂是以溶藻菌和反硝化聚磷菌为受试菌株通过细胞融合方法制备得到。
本发明所述的控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂，配方设计合理，将菌剂通过海藻酸钠进行固定，将菌剂的海藻酸钠小球、胞外活性物质与高岭土、硫酸铝钾、氯化钙复配，提高了复合微生态菌剂的絮凝效果，所述菌剂是以溶藻菌和反硝化聚磷菌为受试菌株通过细胞融合方法制备得到，结合了溶藻菌的溶藻能力与反硝化聚磷菌的脱氮除磷能力，不但以丝状藻为碳源进行直接溶藻，还能吸收水体中氮、磷等营养元素进行间接溶藻，提高了控制水体中丝状藻生长的效果，所述复合微生态菌剂使用的原材料价格低廉，制备成本低，对自然生态系统影响较小，应用前景广泛。
进一步的，上述的控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂，所述菌剂的海藻酸钠小球是以海藻酸钠为固定材料、以MM培养基作为溶剂配制成质量百分数为2-5%的海藻酸钠溶液后对上述菌剂进行固定化制备得到。
通过海藻酸钠将菌剂进行固定，可以保证菌剂在各类自然环境中稳定的生长，并且固定化的环境可以为菌剂发挥各自作用提供必需的营养物质。
进一步的，上述的控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂，所述胞外活性物质是以MMDT培养基培养胞外多聚物分泌菌、将培养20-24h的培养液通过进一步纯化制备得到。
进一步的，上述的控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂，所述溶藻菌是从水体土著田螺消化道筛选得到。
溶藻菌是从水体土著田螺消化道筛选得到，可以抑制该水体的丝状藻的过度生长，危害水环境安全，从水体土著水生动物体内筛选，不仅可以达到溶藻控藻的目的，而且不会对水体造成二次污染。例如，用于控制太湖的复合微生态菌剂的溶藻菌可以从太湖土著田螺消化道筛选得到。
进一步的，上述的控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂，所述反硝化聚磷菌采用Acinetobacter sp.。
所述反硝化聚磷菌采用Acinetobacter sp.,属于不动杆菌属,具有优异的脱氮除磷能力，采购来自上海谷研实业有限公司。
进一步的，上述的控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂，所述菌剂是先将溶藻菌、反硝化聚磷菌通过菌体重悬、酶解、纯化、融合制得原生质体，然后对原生质体进行筛选得到菌剂。
菌剂是通过原生质体融合技术制备，通过尝试融合不同遗传特性的两个细胞的原生质体，从而人为获取具有特定遗传特性的稳定重组体的过程，从而获得集双亲优良性状于一体的理想菌株。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果： 本发明所述的控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂，配方设计合理，将菌剂通过海藻酸钠进行固定，将菌剂的海藻酸钠小球、胞外活性物质与高岭土、硫酸铝钾、氯化钙复配，提高了复合微生态菌剂的絮凝效果，菌剂是以溶藻菌和反硝化聚磷菌为受试菌株通过细胞融合方法制备得到，结合了溶藻菌的溶藻能力与反硝化聚磷菌的脱氮除磷能力，提高了控制水体中丝状藻生长的效果，原材料价格低廉，制备成本低，对自然生态系统影响较小，应用前景广泛。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通的技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
所述溶藻菌的筛选：
（1）分离和纯化：称取太湖(31.33°N,119.94°E)土著田螺消化道，投加入铜绿微囊藻液，得到处理液，瓶口用纱布扎紧。每天摇晃锥形瓶 3-5 次，待出现明显黄化现象，取0.5 mL处理液与 4.5mL蒸馏水投加入 10 mL离心管中, 采用倍比稀释法，将处理液液稀释成 10 份, 将稀释后的 10 份处理液分别涂布后并倒置光照培养。待菌落长成后挑取不同的个体再次分离纯化培养；
（2）初筛：依次将纯化后的不同菌株，分别投入铜绿微囊藻液中，瓶口用纱布封口并保持每天摇晃 3-5 次，通过观察藻液黄化情况来初步判断各菌的溶藻效果；
（3）复筛：初筛所获具溶藻能力的菌株投入液体培养基中制作成细菌发酵液，按照1:10 的配比转接入铜绿微囊藻液中，光照培养且每隔24 h 测 1 次叶绿素 a含量并计算溶藻率；筛选出溶藻效果最好的溶藻菌。
实施例2
所述菌剂的制备：
（1）取10mL实施例1筛选出的溶藻菌、反硝化聚磷菌（采用Acinetobacter sp.，采购来自上海谷研实业有限公司）的发酵液离心(4000 r·min-1，15 min)处理后，弃上清液并加入 10mL磷酸缓冲液（0.1 mol·L-1，pH 为 6.0）冲洗2-3次后重悬；向上述混合液中加入0.05 mg 溶菌酶（采购自上海生工有限公司），在 35 ℃下水浴酶解 1 .5h，得到原生质体再分别进行热灭设定50℃，20 min)；上述原生质体经离心(4000 r·min-1，10 min)处理后以高渗缓冲液（磷酸缓冲液中加入 0.8 mol·L-1 的甘露醇）洗涤原生质体 2-3 次并重悬，以备后续细胞融合使用；以 PEG 介导法转化，将溶藻菌、反硝化聚磷菌的原生质融合体，涂布于高渗固体培养基（琼脂粉 20 g·L-1，酵母浸出汁 5 g·L-1，蒸馏水 1L，调节溶液 pH至 7.2）上并光照培养；
（2）对上述原生质体进行初筛，然后挑取融合菌分离到高渗培养基上再生，连续纯化培养 代观察自然分离并筛去异核体和二倍体；筛选出遗传性能稳定的菌种。
测试： 分别测定 7d内实施例1的溶藻菌、实施例2的菌种的发酵液在微囊藻液中Chla、TN、TP 浓度，通过溶藻率和脱氮、除磷率表征菌株效能。本次实验参照国家环保总局发布的《水、废水检测与分析方法(第四版)》测定方法。数据结果为，第7d时，实施例1的溶藻菌的溶藻率为81.5%，脱氮去除率为19.6%，除磷率为6.3%，实施例2的菌种的溶藻率为83.2%，脱氮去除率为78.9%，除磷率为94.2%。
实施例3
菌剂的海藻酸钠小球的制备：
使用80 mL MM培养基为溶剂，溶解海藻酸钠，配制质量分数为3%的海藻酸钠溶液。将100μL的上述菌种（OD600=0.6）接种到100mL LB培养基，40℃、200rpm培养48h后，6500rpm离心10min，收集菌体。再用20 mL MM培养基再将菌体重悬，并将该悬浮液加入到上述海藻酸钠溶液中，充分混合后，使用1mL蓝色枪头将该混合液逐滴注入体积为100mL 的CaCl2溶液（质量分数为3%）中，5℃静置28h后，制备出包埋着菌种的海藻酸钠小球，直径平均为2mm。
实施例4
所述胞外活性物质的制备：
取1mL活化的细菌DT（OD600=0.5），接种的1L MMDT培养基中，30℃，200rpm培养24h，室温下静置48h；将上述培养液4000rpm离心30min后丢弃上清，然后用50mL无菌水溶解沉淀，加入-20℃预冰的丙酮100mL，于4℃冰箱中静置24h待析出物稳定；4000rpm离心30min后，丢弃上清收集沉淀部分；用50mL无菌水溶解上述制备的沉淀，加入50 mLSevage (氯仿：正丁醇=5：1)溶液，涡旋振荡器充分振荡5min后，离心（4000rpm离心30min）收集上清液，冷冻干燥机对收集到的上清液冷冻干燥，制得胞外活性物质。
实施例5
所述复合微生态菌剂的制备：
将菌剂的海藻酸钠小球、胞外活性物质、高岭土、硫酸铝钾、氯化钙复配而成，所述复合微生态菌剂包括如下质量份数的组分：高岭土52.3份、菌剂的海藻酸钠小球36.5份、氯化钙1.25份、硫酸铝钾0.53份、胞外活性物质0.0022份。
测试：（1）絮凝效果：取1g复合微生态菌剂，投入到100mL的铜绿微囊藻水样（OD680= 1.0），每隔30s取1mL上清液，测定上清液的OD550，验证其絮凝效果。在2min内，该复合微生态菌剂的絮凝除藻效率能达到98.1%，在5min时，其絮凝除藻接近100%；（2）测定 7d内复合微生态菌剂在微囊藻液中 Chla、TN、TP 浓度，通过溶藻率和脱氮、除磷率表征菌株效能。数据结果为，第7d时，实施例5的溶藻率为85.2%，脱氮去除率为80.1%，除磷率为94.6%。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂，其特征在于，所述复合微生态菌剂是通过菌剂的海藻酸钠小球、胞外活性物质、高岭土、硫酸铝钾、氯化钙复配而成，所述复合微生态菌剂包括如下质量份数的组份：高岭土50-60份、菌剂的海藻酸钠小球35-45份、氯化钙1-2份、硫酸铝钾0.5-1份、胞外活性物质0.002-0.003份；所述菌剂是以溶藻菌和反硝化聚磷菌为受试菌株通过细胞融合方法制备得到。
2.根据权利要求1所述的控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂，其特征在于，所述菌剂的海藻酸钠小球是以海藻酸钠为固定材料、以MM培养基作为溶剂配制成质量百分数为2-5%的海藻酸钠溶液后对上述菌剂进行固定化制备得到。
3.根据权利要求1所述的控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂，其特征在于，所述胞外活性物质是以MMDT培养基培养胞外多聚物分泌菌、将培养20-24h的培养液通过进一步纯化制备得到。
4.根据权利要求1所述的控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂，其特征在于，所述溶藻菌是从水体土著田螺消化道筛选得到。
5.根据权利要求4所述的控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂，其特征在于，所述反硝化聚磷菌采用Acinetobacter sp.。
6.根据权利要求5所述的控制水体中丝状藻生长的复合微生态菌剂，其特征在于，所述菌剂是先将溶藻菌、反硝化聚磷菌通过菌体重悬、酶解、纯化、融合制得原生质体，然后对原生质体进行筛选得到菌剂。
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| RU2808835C1 (ru) * | 2023-05-04 | 2023-12-05 | Общество с ограниченной ответственностью "Альготек" (ООО "Альготек") | Способ борьбы с нитчатыми водорослями |
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