CN114306746B - 一种抗凝血脱细胞真皮基质的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗凝血脱细胞真皮基质的制备方法。首先采用高碘酸钠对肝素进行氧化，制得含有交联活性醛基的双醛肝素，再将双醛肝素作为交联剂对脱细胞真皮基质进行化学修饰，制得抗凝血脱细胞真皮基质。该材料具有显著的抗凝血性能和抗血小板黏附性能，且抗凝血作用更温和，将其用于体内植入材料与人体血液直接接触时可以减少凝血、血小板减少和出血等并发症的发病率。此外，该材料还兼具良好的热稳定性、耐酶降解性和细胞相容性。可广泛用于组织工程心脏瓣膜、人工血管等抗凝支架材料的制备。

Description

一种抗凝血脱细胞真皮基质的制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗凝血脱细胞真皮基质的制备方法，属于生物医学材料领域。

背景技术

随着全球人口老龄化和瓣膜疾病流行趋势，我国心脏瓣膜疾病的发病率正逐年上升，心脏瓣膜置换术已成为重症心脏瓣膜病的主要治疗手段。目前在临床中常用的两类人工瓣膜中，生物瓣膜的耐久性差、易钙化、易衰败，机械瓣膜容易引发出血栓塞，需要终身抗凝治疗。在心脏瓣膜置换手术中，暴露在人工瓣膜表面的细胞外基质很容易黏附并激活血小板，诱导体内凝血机制，进而引发瓣膜血栓、血管栓塞和出血等高风险术后并发症，因此瓣膜材料的抗凝血性能对于人工心脏瓣膜植入后维持血液通畅具有重要意义。

脱细胞真皮基质在制备过程中去除了表达抗原的细胞成分，保留了胶原纤维和基本组织结构，免疫原性低、生物相容性良好，能为细胞提供天然的黏附位点，促进细胞的黏附、增殖和分化，还能通过去除异种细胞减少钙化，将其用于心脏瓣膜和人工血管等支架材料具有多种优势。但是脱细胞真皮基质的主要成分是胶原，纯胶原的凝血活性较强，作为植入材料使用会激活血小板释放凝血因子，加速血液凝血形成血栓，这将严重影响心脏瓣膜植入后体内血液的通畅性，极其容易引发血管栓塞、血小板减少和出血等手术并发症，甚至威胁患者生命安全。此外，纯胶原的热稳定性低、机械强度较差、耐酶降解能力差，无法满足组织工程心脏瓣膜支架的长期植入需求。为了解决这些问题，化学交联改性早已被广泛应用于改善脱细胞真皮基质材料的理化性能，目前临床上通常采用戊二醛进行交联改性，但经戊二醛交联材料的抗凝血性和生物相容性较差，植入体内后会引起血小板、纤维素的黏附以及血细胞、血浆成分的渗入，极容易出现血栓、阻塞和钙化等问题。因此开发新型交联剂及交联技术，在兼顾材料生物相容性的同时，有效改善脱细胞真皮基质的抗凝血性、抗血小板黏附性和血液安全性，是解决问题的关键。

肝素是一类糖醛酸和葡萄糖胺以1,4-键连接起来的重复二糖单位组成的多糖混合物，具有显著的抗凝血、抗血栓和抗炎症性能，且生物相容性良好、出血风险较小、能促进细胞的迁移和增殖，是临床中常用的一种重要抗凝血剂，已被广泛用于心血管材料表面抗凝血性能修饰。采用肝素对脱细胞真皮基质进行化学修饰可以平衡胶原促凝血的负面作用，改善其抗凝血活性，但肝素与脱细胞真皮基质的结合方式为物理吸附，仅有少量的肝素分子能够发生电离作用与脱细胞真皮基质中的胶原进行络合，由此所得的改性材料表面接枝肝素多糖分子的密度较低，且抗凝血活性不可控。

可见，如何在保证肝素抗凝血功能的前提下，赋予肝素以化学反应活性，促进其与脱细胞真皮基质之间的产生强烈的相互化学作用，是解决问题的突破口。

为了有效解决该问题，我们采用高碘酸钠将肝素分子中的部分羟基氧化为醛基制得双醛肝素，避免了对其抗凝血活性中心的破坏，从而在保留肝素分子中具有抗凝血活性的戊糖结构的基础上引入具有化学交联活性的醛基。将其与脱细胞真皮基质共同作用时，双醛肝素中的醛基会与胶原中的氨基发生共价交联作用将肝素分子牢固地锁定在材料表面。当材料与血液接触时，锚定在胶原表面的肝素抗凝血结构首先与血液发生作用，产生抗凝血作用，从而掩敝了胶原的凝血作用，有望显著改善并长期维持抗凝血脱细胞真皮基质在血液环境中的抗凝血效果和其它理化性能。

综上所述，本发明专利制备了一种抗凝血脱细胞真皮基质，该材料具有良好的热稳定性、耐酶降解性和细胞相容性，尤其是抗凝血性和抗血小板黏附性得到了显著改善，改性材料中肝素分子的抗凝血活性得到很好的维持，且抗凝血作用更温和，将其用于体内植入材料与人体血液直接接触时可以减少凝血、血小板减少和出血等并发症的发病率，有望应用于组织工程心脏瓣膜、人工血管等抗凝支架材料的制备领域。

发明内容

本发明是通过以下技术方案实现的：

1. 一种抗凝血脱细胞真皮基质的制备方法，其特征是：

（1）双醛肝素的制备：称取 20 重量份的肝素溶于 200~800 重量份的蒸馏水中，加入 40～160 重量份的0.25 mol/L高碘酸钠溶液，在0～10℃、避光条件下磁力搅拌24～72 h，反应结束后加入10～30 重量份的乙二醇终止反应，将产物装入截留分子量为500~2000 Da的透析袋中，在0～10℃的注射用水中透析1~3 d，冷冻干燥回收后获得双醛肝素，保存备用；

（2）抗凝血脱细胞真皮基质的制备：称取 4～20 重量份的双醛肝素溶于 200~1000 重量份的pH 8.0~10.4 缓冲液中，搅拌均匀后加入100 重量份的脱细胞真皮基质（以绝干重计），在25~42℃条件下搅拌反应24～72 h，反应结束后加入1000~2000重量份的注射用水漂洗3次，每次30 min，冷冻干燥后获得抗凝血脱细胞真皮基质。

2. 根据权利要求 1 所述的一种抗凝血脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于所述的肝素包括低分子量肝素、依诺肝素钠、达肝素钠、那曲肝素钙中的一种或几种。

3. 根据权利要求 1 所述的一种抗凝血脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于所述双醛肝素的氧化度为 30%～50%。

4. 根据权利要求 1 所述的一种抗凝血脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于所述pH 8.0~10.4 缓冲液包括碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、硼酸-氯化钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、碳酸钠-氢氧化钠缓冲液中的一种。

5. 根据权利要求 1 所述的一种抗凝血脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于所述脱细胞真皮基质包括猪皮脱细胞真皮基质、胎牛皮脱细胞真皮基质、脱细胞牛心包膜、脱细胞猪心包膜、猪腹膜脱细胞真皮基质中的一种或几种。

6. 根据权利要求 1 所述的一种抗凝血脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于所述抗凝血脱细胞真皮基质的关键性能指标如下：

（1）抗凝血性能：经新鲜兔血检测，活化部分凝血活酶时间为117±5 s，凝血酶原时间为61±5 s，凝血酶时间为33±5 s；

（2）抗血小板黏附性能：经新鲜兔血检测，表面血小板黏附数量显著减少；

（3）溶血率：经新鲜兔血检测，溶血率为0.73±0.21 %；

（4）细胞相容性：72 h浸提液的细胞形态呈正常梭状，且密度分布均匀；第7天的细胞相对增殖率为141±20％，细胞毒性反应 0 级；

（5）耐酶解性能：经3 U/mL浓度的I型胶原酶溶液作用7天后，降解率为18.4±1.3％。

7. 根据权利要求 1 所述的一种抗凝血脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于所述抗凝血脱细胞真皮基质可以应用于心脏瓣膜、人工血管等抗凝支架材料的制备领域。

本发明具有以下的优点：

（1）优异的化学交联活性：肝素与脱细胞真皮基质的结合方式为物理吸附，仅有少量的肝素分子能够与脱细胞真皮基质中的胶原发生电离作用，两者间的相互作用力较弱，且抗凝血活性不可控。本发明通过高碘酸钠氧化制得的双醛肝素是在肝素的天然分子链基础上引入了醛基，既保留了肝素的抗凝血活性，又赋予其优异的化学交联活性，使其能与脱细胞真皮基质中胶原的氨基形成多个席夫碱键，从而将肝素分子通过较强的共价键结合在脱细胞真皮基质材料表面，形成稳定的肝素包覆胶原结构。

（2）优异的抗凝血性能：脱细胞真皮基质的主要成分是胶原，凝血活性较强，抗凝血性能较差，作为植入材料使用会加速血液凝血形成血栓，极易引发血管栓塞、血小板减少和出血等手术并发症。肝素是临床应用最广泛的抗凝血类药物，具有显著的抗凝血性能。本发明通过高碘酸钠对肝素进行部分氧化，制得的双醛肝素较多地保留有肝素分子中产生抗凝血活性的戊糖结构成分，避免了对其抗凝血活性中心的破坏。氧化肝素通过多个席夫碱共价键将肝素分子中的抗凝血结构引入并锁定在材料表面，形成稳定的肝素包覆胶原结构。由于氧化肝素与胶原结合过程中对胶原氨基等的封闭，特别是肝素抗凝血结构的引入，有效逆转了胶原的凝血作用，能够显著改善并长期维持抗凝血脱细胞真皮基质在血液环境中的抗凝血效果，较成功地解决了胶原基生物材料在血液接触应用场景中的凝血问题。

（3）优良的抗血小板黏附性能：双醛肝素分子中含有羧酸基、磺酸基等阴离子基团，可以与血小板表面上的负电荷产生静电排斥作用，进而减少血浆蛋白质及血液细胞在材料表面的大量吸附。因此，本发明制得的抗凝血脱细胞真皮基质具有优良的抗血小板黏附性能。

（4）良好的血液安全性：本发明制得的抗凝血脱细胞真皮基质在血液环境中并未出现明显的溶血作用，且溶血率远远小于国际标准中规定的上限值5%，符合血液接触材料的安全标准，具有良好的血液安全性。

（5）优异的生物相容性：本发明制得的抗凝血脱细胞真皮基质采用的是肝素的氧化产物作为交联剂，继承了肝素中天然多糖分子链优异的生物相容，这在很大程度上弥补了醛基对细胞增殖率带来的负面影响。经检测，本发明制得的抗凝血脱细胞真皮基质的细胞毒性为 0 级，并具有诱导细胞粘附、增殖和生长的能力，符合人体植入材料的使用要求，可用于生物医用领域。

（6）优良的耐酶降解性能：本发明制得的抗凝血脱细胞真皮基质中双醛肝素和脱细胞真皮基质之间形成的较多、较强的共价交联键，大大提高了抗凝血脱细胞真皮基质的结构稳定性和耐降解性。

（7）良好的热稳定性：本发明制得的抗凝血脱细胞真皮基质中双醛肝素和脱细胞真皮基质之间形成的较强的共价交联作用，使得抗凝血脱细胞真皮基质的分子结构更加稳定，需要更多的能量进行结构分解，热稳定性更强。

（8）制备过程安全、简便、环保：整个操作过程的条件和反应都很温和，无毒无害无苛刻要求，易于实现，且对环境友好，对操作人员友好。

附图说明

图 1 是在体外抗凝血活性实验中，本发明制得的抗凝血脱细胞真皮基质的活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间和凝血酶时间数据图片。

图 2 是在细胞相容性实验中，本发明制得的抗凝血脱细胞真皮基质的细胞相对增殖率图片。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，本实施例只是对本发明进行进一步补充说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例 1

（1）双醛肝素的制备：称取3.5 g依诺肝素钠溶于50 mL重量份的蒸馏水中，加入80mL重量份的0.25 mol/L的高碘酸钠溶液，在4℃、避光条件下磁力搅拌48 h，反应结束后加入15 mL重量份的乙二醇终止反应，将产物装入截留分子量为500 Da的透析袋中，在4℃的注射用水中透析3 d，冷冻干燥回收后获得双醛肝素，保存备用；

（2）抗凝血脱细胞真皮基质的制备：称取2 g双醛肝素溶于100 mL重量份的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH 9.4）中，搅拌均匀后加入10 g胎牛皮脱细胞真皮基质（以绝干重计），在37℃条件下搅拌反应36 h，反应结束后加入500 g重量份的注射用水漂洗3次，每次30 min，冷冻干燥后获得抗凝血胎牛皮脱细胞真皮基质。

实施例 2

（1）双醛肝素的制备：称取0.5 kg低分子量肝素溶于1 kg重量份的蒸馏水中，加入2.5 kg重量份的0.25 mol/L的高碘酸钠溶液，在0℃、避光条件下磁力搅拌72 h，反应结束后加入0.25 kg重量份的乙二醇终止反应，将产物装入截留分子量为2000 Da的透析袋中，在4℃的注射用水中透析3 d，冷冻干燥回收后获得双醛肝素，保存备用；

（2）抗凝血脱细胞真皮基质的制备：称取0.12 kg双醛肝素溶于5 kg重量份的碳酸钠-氢氧化钠缓冲液（pH 10.4）中，搅拌均匀后加入1 kg脱细胞猪心包膜（以绝干重计），在37℃条件下搅拌反应72 h，反应结束后加入2 kg重量份的注射用水漂洗3次，每次30 min，冷冻干燥后获得抗凝血脱细胞猪心包膜。

实施例 3

（1）双醛肝素的制备：称取6 g那曲肝素钙溶于100 mL重量份的蒸馏水中，加入200mL重量份的0.25 mol/L的高碘酸钠溶液，在8℃、避光条件下磁力搅拌48 h，反应结束后加入过量的乙二醇终止反应，将产物装入截留分子量为1000 Da的透析袋中，在4℃的注射用水中透析3 d，冷冻干燥回收后获得双醛肝素，保存备用；

（2）抗凝血脱细胞真皮基质的制备：称取3.2 g双醛肝素溶于150 mL重量份的磷酸盐缓冲液（pH 8.0）中，搅拌均匀后加入25 g猪皮脱细胞真皮基质（以绝干重计），在37℃条件下搅拌反应48 h，反应结束后加入1000 g重量份的注射用水漂洗3次，每次30 min，冷冻干燥后获得抗凝血猪皮脱细胞真皮基质。

Claims (6)

1.一种抗凝血脱细胞真皮基质的制备方法，其特征是：

(1)双醛肝素的制备：称取20重量份的低分子量肝素溶于200～800重量份的蒸馏水中，加入40～160重量份的0.25mol/L高碘酸钠溶液，在0～10℃、避光条件下磁力搅拌24～72h，反应结束后加入10～30重量份的乙二醇终止反应，将产物装入截留分子量为500～2000Da的透析袋中，在0～10℃的注射用水中透析1～3d，冷冻干燥回收后获得双醛肝素，保存备用；

(2)抗凝血脱细胞真皮基质的制备：称取4～20重量份的双醛肝素溶于200～1000重量份的pH 8.0～10.4缓冲液中，搅拌均匀后加入100重量份以绝干重计的脱细胞真皮基质，在25～42℃条件下搅拌反应24～72h，反应结束后加入1000～2000重量份的注射用水漂洗3次，每次30min，冷冻干燥后获得抗凝血脱细胞真皮基质。

2.根据权利要求1所述的一种抗凝血脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于所述的低分子量肝素包括依诺肝素钠、达肝素钠、那曲肝素钙中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的一种抗凝血脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于所述双醛肝素的氧化度为30％～50％。

4.根据权利要求1所述的一种抗凝血脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于所述pH8.0～10.4缓冲液包括碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、硼酸-氯化钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、碳酸钠-氢氧化钠缓冲液中的一种。

5.根据权利要求1所述的一种抗凝血脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于所述脱细胞真皮基质包括猪皮脱细胞真皮基质、胎牛皮脱细胞真皮基质、脱细胞牛心包膜、脱细胞猪心包膜、猪腹膜脱细胞真皮基质中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的一种抗凝血脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于所述抗凝血脱细胞真皮基质的关键性能指标如下：

(1)抗凝血性能：经新鲜兔血检测，活化部分凝血活酶时间为117±5s，凝血酶原时间为61±5s，凝血酶时间为33±5s；

(2)抗血小板黏附性能：经新鲜兔血检测，表面血小板黏附数量显著减少；

(3)溶血率：经新鲜兔血检测，溶血率为0.73±0.21％；

(4)细胞相容性：72h浸提液的细胞形态呈正常梭状，且密度分布均匀；第7天的细胞相对增殖率为141±20％，细胞毒性反应0级；

(5)耐酶解性能：经3U/mL浓度的I型胶原酶溶液作用7天后，降解率为18.4±1.3％。

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