CN114295570A - 一种快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法及其应用，以TMB和DABCO混合溶液为硝酸根检测试剂，加入到待测水体中；通过硝酸根在紫外光照射下产生羟基自由基以实现对TMB氧化变色，再通过DABCO清除溶解氧在紫外光的照射下产生的单线态氧，排除单线态氧对TMB显色的影响，接着通过检测待测水体中TMB的氧化产物在423nm处的吸光度，以实现对待测水体中硝酸根浓度的测定。本发明操作简便、检测限较低、灵敏度较高、抗干扰能力较强，在环境水质分析等领域，有着广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及一种快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法及其应用。
背景技术
硝酸根作为最稳定的氮氧化物，广泛存在于自然环境中。硝酸根的主要来源为含硝酸根的工业废水和含氨氮农业废水的排放，含氨氮农业废水经一系列的氧化作用或微生物硝化作用后，生成硝酸根。硝酸根作为地下水和地表水中主要的污染物，硝酸根的积累会促进水体富营养化，从而导致水质进一步恶化，造成大范围环境污染。
若长期摄取硝酸根浓度超标的饮用水，可能会对人体健康造成严重危害。虽然硝酸根的自身毒性较低，但硝酸根在人体中可被还原为亚硝酸根；而亚硝酸根可引起高铁血红蛋白中毒。另外，水体中亚硝酸根和硝酸根，在各种含氮有机物的作用下，可形成致癌物亚硝胺和亚硝基酰胺化合物，导致人体患癌风险增加。因此，对环境中硝酸根浓度的检测十分必要。为提高饮用水的安全性，世界卫生组织(WHO)规定饮用水中硝酸根的氮的质量浓度不得超过50.0mg/L；我国现行的饮用水质量标准(GB5749-85)规定饮用水中硝酸根的氮的质量浓度不得超过10.0mg/L。
目前，已经开发了多种检测分析硝酸根浓度的方法，包括分光光度法、电化学分析法、流动注射法、离子色谱法、荧光法、和电泳法等等。但上述方法通常存在样品前处理繁琐、需要价格昂贵仪器设备等不足，迫切需要发展准确、高效测定硝酸根浓度的新方法。
因此，我们提出一种快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法及其应用。
发明内容
本发明的目的是针对背景技术中检测方案不足之处的改进，本发明公开了快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法，以3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)和三乙烯二胺(DABCO)混合溶液为硝酸根检测试剂，实现水体中硝酸根浓度的准确高效测定。
本发明通过以下技术方案来实现所述目的：
本发明提供了一种快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法，向待测样品溶液中加入硝酸根检测试剂，震荡混匀，将待测样品置于紫外光下，本发明以TMB为显色剂，通过利用硝酸根在紫外光照射下产生羟基自由基，实现TMB氧化变色，检测试剂中引入DABCO，清除溶解氧在紫外光的照射下产生单线态氧，排除单线态氧对TMB显色的影响，通过检测TMB的氧化产物在423nm处的吸光度，实现对待测样品溶液中硝酸根浓度的测定。
进一步改进在于，具体包括以下步骤：
(1)配制硝酸根检测试剂：将TMB粉末溶解在二甲基亚砜中，配制TMB溶液，避光保存；将DABCO粉末溶解在去离子水中，配制DABCO溶液；将TMB溶液和DABCO溶液振荡混合均匀，获得硝酸根检测用试剂；
(2)绘制标准工作曲线：配制不同浓度的硝酸根标准溶液，取配制的各浓度硝酸根标准溶液，加入至所述硝酸根检测试剂溶液中，紫外光照射后测试吸光度，利用不同硝酸盐浓度和对应浓度的吸光度绘制工作曲线并获得两者的相关关系；
(3)待测样品硝酸根浓度测定：选取预处理后的待测水样加入到所述硝酸根检测用试剂溶液中，紫外光照射后测试吸光度，根据得到的吸光度和所述工作曲线，获得待测样品中硝酸根浓度。
进一步改进在于，所述步骤(1)具体为：将TMB粉末分散在二甲基亚砜中，配制浓度为100.0mM的TMB溶液，并避光保存；将DABCO粉末分散在去离子水中，配制浓度为100.0mM的DABCO溶液；取10.0μL浓度为100.0mM的DABCO溶液、2.0μL浓度为100.0mM的TMB溶液和2688.0μL去离子水，振荡混合均匀，即获得硝酸根检测试剂。
进一步改进在于，所述步骤(2)中硝酸根标准溶液的浓度范围为2.0μM-1000.0μM，分别为2.0μM，5.0μM，10.0μM，20.0μM，50.0μM，100.0μM，200.0μM，500.0μM，1000.0μM。
进一步改进在于，所述步骤(2)具体步骤为：
(1)配制浓度范围在2.0μM-1000.0μM之间的硝酸根溶液，分别取300.0μL硝酸根标准溶液，加入2700.0μL所述硝酸根检测试剂溶液，充分震荡混匀；
(2)将样品置于紫外灯下，紫外灯的功率为20W，波长为254nm，照射一段时间后，使用去离子水扣除溶剂背景，在波长范围200-800nm条件下进行光谱采集，并测定样品在423nm处的吸光度，记为Ai，记不含硝酸根样品的吸光度为A0；
(3)计算吸光度ΔA＝Ai-A0，根据硝酸根浓度和ΔA数据绘制标准工作曲线，获得两者的相关关系。
进一步改进在于，所述相关关系拟合为Y＝7.378×10-4X+0.0125，X表示硝酸根浓度，浓度单位为μM，Y为吸光度。
进一步改进在于，所述步骤(3)中实际样品的预处理步骤具体为：首先，将待测水样用树脂膜过滤除去悬浮物；然后，用C18固相萃取小柱过滤除去有机物；最后，选取滤液为检测用实际样品。
进一步改进在于，所述步骤(3)具体步骤为：
(1)分别取300.0μL预处理后的待测水样，加入到2700.0μL所述硝酸根检测试剂溶液中，充分震荡混匀；
(2)将样品置于紫外灯下，紫外灯的功率为20W，波长为254nm，照射一段时间后，使用去离子水扣除溶剂背景，在波长范围200-800nm条件下进行光谱采集，并测定样品在423nm处的吸光度，记为Ai，记不含硝酸根样品的吸光度为A0；
(3)计算ΔA样品＝A样品-A0，代入所述标准工作曲线中计算得出硝酸根浓度。
本发明提供了一种所述快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法及其在水环境监测领域中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法及其应用，本发明以TMB为显色剂，通过利用硝酸根在紫外光照射下产生羟基自由基，实现对TMB的氧化，致使TMB氧化变色。检测试剂中的DABCO，去除溶解氧在紫外光的照射下产生的单线态氧，排除单线态氧对TMB显色的影响。通过检测TMB的氧化产物在423nm处的吸光度，实现对溶液中硝酸根浓度的测定。本发明操作简单、检测下限低(2.0μM，氮含量28.0μg/L)、灵敏度高、抗干扰能力强，在环境检测、食品分析等领域，有着广阔的应用前景。
附图说明
图1为TMB的分子式；
图2为TMB黄色氧化产物的分子式；
图3为TMB黄色氧化产物的紫外-可见光谱图；
图4为本发明实施例中各硝酸根浓度工作溶液的紫外-可见光谱图；
图5为本发明实施例中所得标准工作曲线(2.0-1000.0μM)；
图6为图5中浓度2.0-1000.0μM之间曲线的线性拟合工作曲线(Y＝7.378*10-4X+0.0125)；
图7为本发明实例中实际水样分析的紫外-可见光谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据所述申请内容对本申请做出一些非本质的改进和调整。
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
本实施例中一种以TMB/DABCO为检测试剂，快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法，包括以下步骤：
步骤1、检测试剂配制步骤：
将TMB溶解在二甲基亚砜中，配置成浓度为100.0mM溶液。因TMB溶液见光易氧化变色，需避光保存，TMB分子式如图1所示；将DABCO粉末溶解在去离子水中，配制浓度为100.0mM的DABCO溶液；选取10.0μL浓度为100.0mM的DABCO溶液、2.0μL浓度为100.0mM的TMB溶液和2688.0μL去离子水，振荡混合均匀，即获得硝酸根检测试剂溶液；
步骤2、吸光光谱波长的确定
(1)选取300.0μL硝酸根溶液(0.5mM)加入到2700.0μL所述硝酸根检测用试剂溶液中，充分震荡混匀；
(2)将样品置于紫外灯下，紫外灯的功率为20W，波长为254nm，照射一段时间后，TMB被氧化并伴有溶液从无色到黄色的变化，TMB黄色氧化产物的分子式，如图2所示。并将反应后的黄色反应液在波长范围200-800nm条件下进行光谱采集，在423nm处出现新的特征吸收峰。因此TMB黄色氧化产物的最大吸收波长为423nm，如图3所示。
步骤3、标准工作曲线
配置浓度范围在2.0μM-1000.0μM之间的硝酸根水溶液，分别为2.0μM，5.0μM，10.0μM，20.0μM，50.0μM，100.0μM，200.0μM，500.0μM，1000.0μM。分别选取300.0μL硝酸根标准溶液，加入到2700.0μL所述硝酸根检测用试剂，充分震荡混匀；
将样品置于紫外灯下，紫外灯的功率为20W，波长为254nm，照射一段时间后，使用去离子水扣除溶剂背景，在波长范围200～800nm条件下进行光谱采集，并测定样品在423nm处的吸光度，记为Ai，记不含硝酸根样品的吸光度为A0；并计算ΔA＝Ai-A0，根据硝酸根浓度和表1中所示ΔA423nm(0.016Abs，0.017Abs，0.019Abs，0.027Abs，0.050Abs，0.086Abs，0.129Abs，0.199Abs，0.282Abs)，绘制浓度和ΔA423nm的曲线关系，结果如图5所示。
表1配制硝酸溶液根浓度与其吸光度
| 硝酸根浓度(μM) | 2.0 | 5.0 | 10.0 | 20.0 | 50.0 | 100.0 | 200.0 | 500.0 | 1000.0 |
| 吸光度(Abs) | 0.016 | 0.017 | 0.019 | 0.027 | 0.050 | 0.086 | 0.129 | 0.199 | 0.282 |
通过观察标准工作曲线，发现在2.0-1000.0μM区间的硝酸根浓度和吸光度ΔA423nm存在一定的线性关系。选取并记录波长423nm处的吸光度，绘制标准工作曲线。并进行线性拟合，拟合方程为：Y＝7.378×10-4X+0.0125，相关系数为R2＝0.998，如图6所示。
步骤4、待测样品检测
选取实际样品，用树脂膜过滤去除悬浮物，用C18固相萃取小柱过滤除去有机物，取300.0μL预处理之后的实际水样，加入到2700.0μL所述硝酸根检测用试剂溶液中，充分震荡混匀；
(2)将样品置于紫外灯下，紫外灯的功率为20W，波长为254nm，照射一段时间后，使用去离子水扣除溶剂干扰，在波长范围200-800nm条件下进行光谱采集，并测定样品在423nm处的吸光度，记为Ai，记不含硝酸根样品的吸光度为A0；
计算ΔA样品＝A样品-A0，代入所述工作曲线计算得出硝酸根浓度。
3、验证
为验证本发明方法的准确性，对如下待测水样进行检测：
3.1模拟水样
配制浓度为20.0μM、50.0μM、80.0μM的硝酸根溶液，按所述的方法进行检测，分别取300.0μL不同浓度的硝酸根溶液，加入到2700.0μL所述硝酸根检测用试剂溶液中，充分震荡混匀；
将样品置于紫外灯下，紫外灯的功率为20W，波长为254nm，照射一段时间后，使用去离子水扣除溶剂背景，在波长范围200-800nm条件下进行光谱采集，并测定样品在423nm处的吸光度，记为Ai，记不含硝酸根空白对照样品的吸光度为A0。检测不同浓度硝酸根标准溶液(20.0μM、50.0μM、80.0μM)反应前后的吸光度的变化：
A样品：0.028Abs，0.049Abs，0.072Abs；A0：0.001Abs，0.000Abs，0.00Abs，计算ΔA样品(ΔA样品＝A样品-A0)。通过标准工作曲线计算，计算的浓度分别为19.6μM、49.5μM、80.6μM，，如表2所示。
表2模拟水样硝酸根浓度与其吸光度
| 配制硝酸根浓度(μM) | 20.0 | 50.0 | 80.0 |
| 吸光度(Abs) | 0.027 | 0.049 | 0.072 |
| 本方法测定硝酸根浓度(μM) | 19.6 | 49.5 | 80.6 |
3.2实际水样检测
本实验在合肥市南淝河、巢湖进行取样：进行实际样品分析，测定了吸光度与实际水样中硝酸根浓度的关系，
将巢湖水样，南淝河水样-1，南淝河水样-2依次稀释100倍，分别取300.0μL预处理之后的实际样品，加入到2700.0μL所述硝酸根检测试剂溶液中，充分震荡混匀；
将样品置于紫外灯下，紫外灯的功率为20W，波长为254nm，照射一段时间后，使用去离子水扣除溶剂背景，在波长范围200-800nm条件下进行光谱采集，并测定样品在423nm处的吸光度记样品在423nm处的吸光度为Ai，记不含硝酸根样品的吸光度为A0。同时，选取波长范围350-550nm数据作图，其结果如图7所示。检测巢湖水样，河口水样1，河口水样2反应前后的吸光度变化：A样品：0.051Abs，0.045Abs，0.047Abs；A0：0.000Abs，0.000Abs，0.00Abs。计算ΔA样品＝A样品-A0，将计算得到的吸光度，代入线性回归方程，计算结果如表3所示。
表3实际样品中硝酸根浓度测定
| 样品序号 | 硝酸根浓度(μM) | 水样来源 |
| 1 | 52.2 | 巢湖水样 |
| 2 | 44.1 | 南淝河水样-1 |
| 3 | 46.8 | 南淝河水样-2 |
加标回收实验，具体操作如下：
实验步骤：
(1)将巢湖水样，南淝河水样三种实际样品均稀释100倍，
(2)每种实际水样选取相同的样品两份，并在其中一份加入35.0μM的硝酸根；
(3)分别选取300.0μL预处理之后的实际样品加入到2700.0μL所述硝酸根检测用试剂溶液中，充分震荡混匀；
(4)将样品置于紫外灯下，紫外灯的功率为20W，波长为254nm，照射一段时间后，使用去离子水扣除溶剂干扰，在波长范围200-800nm条件下进行光谱采集，并测定样品在423nm处的吸光度，记为Ai，记不含硝酸根样品的吸光度为A0；
(5)按照相同的实验操作步骤对两份样品进行分析，并计算其加标回收率。
检测巢湖水样、南淝河水样反应前后，与加标样品反应前后的吸光度变化：A样品：0.051Abs，0.047Abs；A0：0.000Abs，0.000Abs。A加标：0.075Abs，0.072Abs；A0：0.000Abs，0.000Abs。不同实际样品的加标回收率的结果，如表4所示。
表4不同实际水样中加标回收率
| 样品名称 | 硝酸根浓度(μM) | 加标量(μM) | 加标后含量(μM) | 回收率(％) |
| 巢湖水样 | 52.2 | 35.0 | 84.7 | 92.9 |
| 南淝河水样-2 | 46.8 | 35.0 | 80.7 | 96.9 |
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法，其特征在于：以TMB和DABCO的混合溶液作为硝酸根检测试剂，加入到待测水体中；通过硝酸根在紫外光照射下产生羟基自由基以实现对TMB氧化变色，再通过DABCO清除溶解氧在紫外光的照射下产生的单线态氧，排除单线态氧对TMB显色的影响，接着通过检测待测水体中TMB的氧化产物在423nm处的吸光度，以实现对待测水体中硝酸根浓度的测定。
2.根据权利要求1所述的一种快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)配制硝酸根检测试剂：将TMB粉末溶解在二甲基亚砜中，配制TMB溶液，避光保存；将DABCO粉末溶解在去离子水中，配制DABCO溶液；将TMB溶液和DABCO溶液振荡混合均匀，获得硝酸根检测用试剂；
(2)绘制标准工作曲线：配制不同浓度的硝酸根标准溶液，取配制的各浓度硝酸根标准溶液，加入至所述硝酸根检测试剂溶液中，紫外光照射后测试吸光度，利用不同硝酸盐浓度和对应浓度的吸光度绘制工作曲线并获得两者的相关关系；
(3)待测样品硝酸根浓度测定：选取预处理后的待测水样加入到所述硝酸根检测用试剂溶液中，紫外光照射后测试吸光度，根据得到的吸光度和所述工作曲线，获得待测样品中硝酸根浓度。
3.根据权利要求1所述的一种快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为：将TMB粉末分散在二甲基亚砜中，配制浓度为100.0mM的TMB溶液，并避光保存；将DABCO粉末分散在去离子水中，配制浓度为100.0mM的DABCO溶液；取10.0μL浓度为100.0mM的DABCO溶液、2.0μL浓度为100.0mM的TMB溶液和2688.0μL去离子水，振荡混合均匀，即获得硝酸根检测试剂。
4.根据权利要求1所述的一种快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法，其特征在于：所述步骤(2)中硝酸根标准溶液的浓度范围为2.0μM-1000.0μM，分别为2.0μM，5.0μM，10.0μM，20.0μM，50.0μM，100.0μM，200.0μM，500.0μM，1000.0μM。
5.根据权利要求4所述的一种快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体步骤为：
(1)配制浓度范围在2.0μM-1000.0μM之间的不同浓度硝酸根溶液，分别取300.0μL不同浓度的硝酸根标准溶液，加入2700.0μL所述硝酸根检测试剂，充分震荡混匀；
(2)将样品置于紫外灯下，紫外灯的功率为20W，波长为254nm，照射一段时间后，使用去离子水扣除溶剂背景，在波长范围200～800nm条件下进行光谱采集，并测定标准工作溶液在423nm处的吸收度，记为Ai，记不含硝酸根样品的吸光度为A0；
(3)计算吸光度ΔA＝Ai-A0，根据硝酸根浓度和ΔA数据，绘制标准工作曲线-，获得两者的相关关系。
6.根据权利要求5所述的一种快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法，其特征在于：所述相关关系拟合为Y＝7.378×10-4X+0.0125，X表示硝酸根浓度，单位为μM，Y为423nm处吸光度。
7.根据权利要求1所述的一种快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法，其特征在于，所述步骤(3)中水体样品的预处理步骤具体为：将待测水样用树脂膜过滤除去悬浮物；用C18固相萃取小柱过滤除去有机物；选取滤液为检测用实际样品。
8.根据权利要求1所述的一种快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体步骤为：
(1)分别取300.0μL预处理后的待测水样，加入2700.0μL所述硝酸根检测试剂，充分震荡混匀；
(2)将样品置于紫外灯下，紫外灯的功率为20W，波长为254nm，照射一段时间后，使用去离子水扣除溶剂背景，在波长200-800nm范围内，进行光谱分析，并测定样品在423nm处的吸光度，记为Ai，记不含硝酸根样品的吸光度为A0；
(3)计算ΔA样品＝A样品-A0，代入所述相关关系中计算得出硝酸根浓度。
9.一种如所述权利要求1-8任一所述的快速高效测定水体中硝酸根浓度的方法，及其在水环境监测领域中的应用。
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