CN114292729A - 一种细胞培养环境调控装置及操作方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种细胞培养环境调控装置及操作方法，本发明涉及细胞培养领域，该装置由培养瓶和培养箱组成，培养瓶瓶颈有网兜状滤网，瓶底分布密封连接孔，瓶盖有两层盖顶，第一层盖顶有滤膜，第二层盖顶为实体，盖顶一端和盖体连接，另一端卡扣开合，培养箱侧壁分布托盘，托盘上部有探针，探针穿透瓶身底部连接孔，进入细胞瓶，对培养液温湿度、pH、含氧量、光照进行检测，在培养箱屏幕显示，通过屏幕设置，利用探针通道和托盘对细胞培养环境调节。本发明实时调控培养环境温湿度、pH、含氧量、光照，使培养液处于最佳状态，网兜滤网有利于悬浮细胞传代，双层盖顶有利于细胞的培养及在不同培养箱传递。

Description

一种细胞培养环境调控装置及操作方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种细胞培养环境调控装置及操作方法。

背景技术

细胞和组织的体外培养已经成为生命科学和实践必不可少内容，细胞培养类型繁多，从病毒到真菌和细菌，从人体细胞到动物细胞和植物细胞，细胞的生长方式一般为贴壁生长或悬浮生长。细胞的原代培养是细胞培养，产业化必经历的一个阶段，原代培养对细胞生存环境有着严苛的要求，细胞环境的微小改变就会对细胞的生长，增殖产生严重影响，细胞培养瓶和培养箱用于细胞培养，可在有限的人力、物力、空间的条件下，获得大量的关于细胞的基本的生长信息和培养工艺参数的试验证据，因此被广泛应用于实验室研究和工业化生产。

然而，现有的细胞培养技术任然存在以下问题：（1）细胞在培养瓶培养过程需要消耗大量氧气，因此需要进行细胞瓶内外气体交换，现有的培养瓶的瓶盖与瓶身之间通过松动连接或者通过滤膜过滤空气，达到气体交换的目的，但是此种方式无法实现瓶内外气体充分快速交换，且随着细胞快速繁殖，瓶内气体产生及消耗的速度逐渐变快，上述方式无法充分满足细胞生长繁殖过程中的换气需求，反而抑制细胞生长；（2）细胞的生长和增殖等生命活动会产生大量二氧化碳，进而影响细胞培养液的pH，使细胞生存环境发生变化；（3）部分细胞增殖快，需要及时补充新鲜培养液并保持细胞培养瓶内湿度适宜；（4）部分植物细胞的培养需要给与一定时长波段的光照刺激；（5）悬浮细胞的传代，需要离心机离心来排除废弃培养基，离心过程会对细胞造成一定的伤害；（6）细胞在不同地域培养箱间传递，需要从带滤膜的培养瓶转移至不带滤膜培养瓶，转移过程会对细胞造成伤害，并且细胞转移后的驯化，重新适应环境的过程势必对细胞产生影响。

中国专利号202110059552.X公布了一种鲁尔接头连接高性能细胞培养瓶的全自动操作方法，发明包括全自动化控制单元：高自由度GMP合规机器人、大容量液体泵站、拟人操作注射器全自动操作单元、注射器操作滑台、物料中转转台、温控离心机、环境传感器组、鲁尔接头开盖/关盖单元、螺旋注射器安装单元，和拟人操作注射器全自动操作单元相对应设置有生物相容材料注塑生产的瓶体、生物相容有机材料制作的培养瓶瓶底、生物相容有机材料制作的培养瓶瓶顶透气结构、鲁尔连接、细胞收获管道和液体操作管道的IMMUNOVESSEL培养瓶，整个操作方法简单便捷，实用性较高，然而发明并未从细胞培养瓶这种细胞培养的基本单位考虑细胞的生存环境进行控制、调节。

中国专利号201910877163.0公布了一种细胞培养瓶，培养瓶结构包括上瓶体、下瓶体、瓶颈、瓶盖、加料针头和加料装置，上瓶体为梯形状结构，下瓶体为长方体结构，上瓶体的下端面与下瓶体相连接，上瓶体的上端面与瓶颈相连接，瓶颈上连接有瓶盖，瓶盖包括外盖体和内盖体，内盖体内侧壁设有内螺纹，瓶颈外侧壁设有与内螺纹相配合的外螺纹，加料针头一端依次穿过外盖体与内盖体伸入至下瓶体内，加料针头另一端通过进料导管与加料装置相连通，该细胞培养瓶可快速方便进行加料或加药，且便于换气，显著提高细胞培养质量，但是仍未能对细胞生存环境进行实时监测，调节细胞生长环境具有一定的滞后性，不能对细胞进行实时调节。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种细胞培养环境调控装置及操作方法，所述的细胞培养环境调控装置的结构主要由细胞培养瓶和培养箱组成，细胞培养瓶由瓶身和瓶盖组成，瓶身部分，瓶颈倾斜向上，瓶颈上半部分，有滤网，瓶底间隔分布密闭连接孔，瓶盖有两层盖顶，第一层盖顶中空，覆有滤膜，第二层盖顶为实体，培养箱侧壁伸出和瓶底连接孔对应数量的探针，探针分为长短两个通道，短通道分别用于吸取微量细胞培养液及细胞瓶内气体输送至检测模块，检测细胞培养液的pH、含氧量或探针直接测量培养液温湿度、光照，通过培养箱屏幕观察检测数值，长通道分别连接控制模块和氧气瓶，二氧化碳气瓶，光源，细胞培养液，通过控制模块调控细胞培养液的温湿度、pH、含氧量、光照，探针接近头端位置，有紫外光源，探针下部为托盘，托盘中部镂空，铺有管路。

进一步，所述细胞培养瓶滤网，滤网覆盖瓶颈上半部位，面积在25%-50%，滤网孔径在40um-100um，滤网呈网兜状，网兜底部指向瓶盖方向。

进一步，所述瓶底密封式连接孔，连接孔分布均匀，通过可修复硅胶材料密封，可以和细胞培养箱探针密闭连接，并进行气体和液体的交换个。

进一步，所述滤膜孔径0.22um-0.45um，第二层盖顶为实体，两层盖顶一端和盖体连接，另一端为卡扣设计。

进一步，所述托盘中间镂空，镂空部位铺有一条或多条平行管路，管路中为恒温循环纯化水，纯化水流经温度控制模块。

进一步，所述光源为特定频率光源，其中包括但不限于紫外光源、蓝绿光源、红橙光源中的一种或几种，可对细胞瓶内部灭菌，刺激细胞生长。

进一步，所述探针可通过控制模块发出指令，刺入或抽出封式连接孔。

上述装置，包括如下使用步骤：

（1）细胞瓶操作方法：

闭合滤膜顶盖卡扣，打开实心顶盖，可进行正常细胞培养。

闭合滤膜顶盖卡扣，闭合实心瓶盖卡扣，可以有效隔绝细胞瓶内外物质交换，可用于细胞在不同实验室或不同培养箱之间的转移。

打开实心顶盖卡扣，打开滤膜顶盖卡扣，可以进行细胞换液，传代。

若培养悬浮细胞，细胞换液过程中，可以将细胞培养液经过网兜滤去，细胞留在网兜上，后加入新鲜培养基冲刷网兜，网兜上细胞冲入细胞瓶内，免去细胞离心去除废弃培养基的步骤。

细胞培养瓶使用完毕，清洁过后，可通过探针紫外光源灭菌，实现细胞瓶的重复使用。

（2）细胞培养液温湿度，pH，含氧量，光照调节方法：

将细胞瓶放置在细胞瓶托盘上，通过控制屏幕控制探针刺出，对应插入细胞培养瓶中，通过控制屏幕操作，对细胞培养液中的温湿度，pH，含氧量，光照进行参数设定。

通过探针短通道抽取微量细胞培养液及细胞瓶内气体，检测细胞培养瓶中培养液的温湿度，pH，含氧量，光照。

通过控制屏幕显示检测数据。

通过控制屏幕控制探针长通道向细胞培养液中注入氧气，二氧化碳，细胞培养液，调节光照，调节托盘循环水温度，从而对细胞生长环境进行调节。

与现有技术相比，本发明提供了一种细胞培养环境调控装置及操作方法，具备以下有益效果：

（1）通过探针通道和细胞培养瓶的结合，可以实时监测细胞培养液中温湿度，pH，含氧量，光照，然后在细胞培养瓶层面对细胞生长环境：温湿度、pH、含氧量、光照进行实时监测。

（2）通过穿入细胞瓶底部的探针长通道，细胞瓶下面的细胞瓶托盘循环水调节系统，可以根据检测结果，实时补充细胞瓶内新鲜培养基、二氧化碳、氧气、调节光照、调控培养瓶内温湿度。

（3）在细胞培养瓶瓶颈上半部位有网兜状滤网，悬浮细胞传代过程中可以经过滤网过滤细胞液，留下悬浮细胞，免除了悬浮细胞传代换液的离心操作。

（4）细胞瓶两层盖顶，外层盖顶实体，内层盖顶有滤膜，两侧盖顶都可以打开，闭合，细胞瓶盖顶的开合，可促进细胞瓶内外气体交换，方便细胞在不同培养箱之间传递。

（5）细胞瓶使用完毕，清洁烘干完成后，可将探针插入细胞瓶瓶底，开启探针上的紫外光源，可通过探针紫外光源灭菌，实现细胞瓶的重复使用。

附图说明：

为了更清楚的说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单的介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看做是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得相关的其他附图。

图1为本发明操作流程图；

图2为本发明外部示意图；

图3为 细胞瓶示意图；

图4为顶盖1示意图；

图5为过滤网示意图；

图6为细胞瓶底部示意图；

图7为托盘示意图；

图8为托盘穿刺针示意图；

图中：1-控制屏幕；2-培养箱；3-外界罐体；4-第二层顶盖；5-第一层顶盖；6-卡扣；7-细胞瓶底部；8-细胞瓶颈部；9-第一层顶盖滤膜；10-细胞瓶颈部滤网；11-细胞瓶底部密封式连接孔；12-进水口；13-出水口；14-托盘；15-托盘镂空部分；16-细胞培养箱侧壁；17-探针；18-托盘固定架。

具体实施方式：

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性的劳动前提下所获的其他所有实施方式，都属于本发明保护范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述，并非旨在限制保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明选定实施方式。基于本发明中的实施方式，都属于本发明的保护范围。

参照图1至图8可知，细胞培养环境调控装置及操作方法，主要由细胞培养瓶和细胞培养箱组成，该装置的操作方法：将细胞培养瓶固定于托盘固定架18上，通过培养箱控制屏幕2发出指令，培养箱侧壁16上的探针17穿过细胞瓶底部7用硅胶封闭的密封式连接孔11，探针17穿过位于细胞瓶底部硅胶封闭的连接孔11，通过探针短通道吸取微量的细胞培养液及瓶内气体，检测细胞瓶内光照，将细胞培养液通过管道，引致细胞培养箱内检测系统，通过检测将细胞瓶环境信息：温湿度、pH、光照、含氧量等信息反馈给控制系统，通过控制屏幕显示，然后设定参数，通过外接系统的外界罐体3引入，探针长通道释放无菌的氧气、二氧化碳、水、光照等来调节细胞瓶内细胞环境，其中第一盖体5中空，覆有滤膜9，在第二盖体4打开的情况下和外界直接进行气体交换，盖体闭合密封通过6卡扣实现，第一盖体4，第二盖体5闭合，细胞瓶和外界隔绝，可以在不同实验室或不同细胞培养箱之间运输，打开第一盖体4、第二盖体5，可以进行细胞换液，传代，当培养悬浮细胞时，可以将细胞培养液经细胞瓶颈部8的滤网10过滤细胞液，留下细胞，加入新鲜培养基对悬浮细胞进行传代或换液，当探针检测到细胞瓶内温度改变，控制温度调控系统，对托盘14镂空部位15分布的循环水管路中的循环水温度调控，从而调节细胞瓶内培养液的温度，循环水从进水口12进入，从出水口13流出。

本发明提供了一种细胞培养环境调控装置及操作方法，不仅能够在细胞培养瓶层面对细胞生长环境（温湿度、pH、氧含量、光照）进行实时监测和调节，减少了细胞的离心操作，通过开合细胞瓶的两层顶盖，对细胞的传代和运输提供优化解决方案，在细胞瓶清洗干净后，通过探针紫外光源灭菌，实现细胞瓶的重复使用。

下面通过具体实施例表征本发明的部分效果，试验组代表本发明，对照组为上市销售产品。

实施例1：

将密度为2×10⁵ 个/mL悬浮细胞（人单核细胞THP-1），分别注入3组25t试验组培养瓶和2组25t对照组培养瓶，每组3个细胞瓶，试验组1细胞瓶网兜状滤网占据瓶径口面积的25%，试验组2滤网占据瓶径口面积的37%，试验组3滤网占据瓶径口面积的50%，对照组1细胞瓶网兜状滤网占据瓶径口面积的20%，对照组2滤网占据瓶径口面积的60%，其他条件完全形同，滤网孔径为60um，培养2小时，然后进行传代操作，每瓶细胞平均分成2瓶，分别对试验组和对照组的试验流畅度，传代时间（均值），传代后细胞数量（均值）进行统计。

由上表可知，试验组在传代程序的流畅度，传代时间和细胞数量方面均优于对照组，对照组1由于网兜状滤网瓶径口覆盖面积较小（20%），细胞液过滤时间按较长，部分细胞随着细胞液过滤流失，从而延长了传代时间，细胞数量较试验组少，对照组2由于网兜状滤网瓶径口覆盖面积较大（60%），细胞传代过程中，移液枪等操作无法顺利通过细胞瓶瓶颈，对细胞液的混匀，抽取有影响，导致了部分细胞随着细胞液过滤流失，延长了传代时间，细胞数量较试验组少，传代过程不流畅，因此本发明细胞瓶网兜状滤网占据瓶径口面积选定为25%。

实施例2：

将密度为2×10⁵ 个/mL悬浮细胞（人单核细胞THP-1），分别注入3组25t试验组培养瓶和2组25t对照组培养瓶，每组3个细胞瓶，试验组1细胞瓶网兜状滤网孔径为40um，试验组2网孔径为70um，试验组3滤网网孔径为100um，对照组1细胞瓶网孔径为20um，对照组2滤网网孔径为120um，其他条件完全形同，滤网占细胞瓶瓶颈面积的30%，培养2小时，然后进行传代操作，每瓶细胞平均分成2瓶，分别对试验组和对照组的细胞液过滤时间（均值）和传代后细胞数量（均值）进行统计。

由上表可知，相对于对照组，试验组在细胞液过滤时间，传代细胞数量方面均有优势，对照组1由于滤网孔径较小（20um），细胞液过滤时间较长，对照组2由于滤网孔径较大（120um），细胞传代过程中，部分细胞随着细胞液过滤流失，细胞数量较试验组少，因此本发明细胞瓶滤网孔径为40um-100um。

实施例3：

将密度为2×10⁵ 个/mL贴壁细胞（鼠成纤维细胞L929），分别注入3组25t试验组培养瓶和2组25t对照组培养瓶，每组3个细胞瓶，试验组1细胞瓶瓶盖滤膜孔径为0.22um，试验组2细胞瓶瓶盖滤膜孔径为0.33um，试验组3滤膜孔径为0.45um，对照组1滤膜孔径为0.10um，对照组2滤膜孔径为0.60um，其他条件完全形同,不通过探针调节细胞液pH，培养48小时，检测细胞瓶中pH变化情况以及细胞瓶是否被微生物污染。

由上表可知，相对于对照组，试验组在培养前后，细胞液pH变化较小，对照组1由于滤膜孔径较小（0.10um），细胞瓶内外气体交换不充分，导致细胞液pH变化较大，对照组2由于滤膜孔径较大（0.60um），细胞传代过程中，一瓶细胞染菌，因此本发明细胞瓶滤膜孔径为0.22um-0.45um。

实施例4：

将密度为1×10⁵ 个/mL悬浮细胞（人单核细胞THP-1），分别注入3支25t试验组培养瓶，和3支25t对照组培养瓶，1mL/瓶，加入10%胎牛血清RPMI-1640培养基各4mL，培养48小时，通过平板计数法检测细胞数量，试验组通过网兜过滤，对照组离心收集细胞，加入培养基稀释为1×10⁵ 个/mL的浓度，5mL/瓶，传代培养，再培养48小时，检测细胞数量，将试验组细胞培养瓶清洗，利用培养箱探针紫外照射60min，加入10毫升培养基，培养7天后，目测培养基是否浑浊，检测细胞瓶是否无菌，试验结果如表4：

由上表可知，试验组在细胞培养方面的效果明显好于对照组，细胞传代后的效果更加明显，细胞瓶紫外灭菌后达到了无菌的效果。

实施例5：

将密度为1×10⁵ 个/mL贴壁细胞（鼠成纤维细胞L929），分别注入3支25T试验组培养瓶，和6支25T对照组培养瓶，1mL/瓶，加入10% 胎牛血清RPMI-1640培养基各4mL，培养48小时，3支试验组注满培养基，盖上两层顶盖，于室外放置72小时，3支对照组传代到盖子没有滤膜的培养瓶，待细胞贴壁后注满培养基，于室外放置72小时，在室外放置期间，放置于8°冰箱12小时，置于恒温气浴震荡箱，38℃，50r/min，震荡12小时，其余时间室温放置，模拟运输环境，3支对照组在培养箱中正常传代，72小时后，放回细胞培养箱继续培养2小时，细胞稀释1×10⁵ 个/mL，对应加入稀释后的细胞各5毫升，培养24小时，利用CCK8试剂检测细胞活性，以一直处于普通培养箱中培养的3支对照组L929细胞为阴性对照。试验结果如表5：

由上表可知，试验组在细胞培养方面的效果明显好于对照组，试验组细胞在实验室之间传递更加安全有效，且相对于对照组，试验组节省了对照组细胞传代的时间（24小时）。

Claims (7)

1.一种细胞培养环境调控装置，其特征在于，该装置的结构主要由细胞培养瓶和细胞培养箱组成；细胞培养瓶由瓶身和瓶盖组成，瓶身部分，瓶颈倾斜向上，瓶颈上半部分，有滤网，瓶底间隔分布密闭连接孔，瓶盖有两层盖顶，第一层盖顶中空，覆有滤膜，第二层盖顶为实体；培养箱侧壁伸出和瓶底连接孔对应数量的探针，探针分为长短两个通道，短通道分别用于吸取微量细胞培养液及细胞瓶内气体输送至检测模块，检测细胞培养液的pH、含氧量或探针直接测量培养液温湿度、光照，通过培养箱屏幕显示检测数值，长通道分别连接控制模块和氧气瓶、二氧化碳气瓶、光源、细胞培养液，通过控制模块调控细胞培养液的温湿度、pH、含氧量、光照、探针接近头端位置，有紫外光源，探针下部为托盘，托盘中部镂空，铺有管路。

2.根据权利要求1所述的一种细胞培养环境调控装置，其特征在于，所述细胞培养瓶滤网，滤网覆盖瓶颈上半部位面积在25%-50%之间，滤网孔径在40um-100um，滤网呈网兜状，网兜底部指向瓶盖方向。

3.根据权利要求1所述的一种细胞培养环境调控装置，其特征在于，所述瓶底分布密封式连接孔，连接孔分布均匀，通过可修复硅胶材料密封，可以和细胞培养箱对应部位密闭连接，并进行气体和液体的交换。

4.根据权利要求1所述的一种细胞培养环境调控装置，其特征在于，所述瓶盖第一层盖顶中空，覆有0.22um-0.45um滤膜，第二层盖顶为实体，盖顶一端和盖体连接，另一端为卡扣设计。

5.根据权利要求1所述的一种细胞培养环境调控装置，其特征在于，所述托盘中部镂空，铺有一条或多条平行管路，管路中为恒温循环纯化水。

6.如权利要求1所述的一种细胞培养环境调控装置，其特征在于，所述光源为特定频率光源，包括但不限于紫外光源，蓝绿光源，红橙光源中的一种或几种，可对细胞瓶内部灭菌，刺激细胞生长。

7.根据权利要求1所述的一种细胞培养环境调控装置，其特征在于，所述探针可通过控制模块发出指令，刺入或抽出瓶底连接孔。

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