CN114292314A - 一种鞭毛素突变体及其在制备非洲猪瘟抗原融合蛋白中的应用 - Google Patents

一种鞭毛素突变体及其在制备非洲猪瘟抗原融合蛋白中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种鞭毛素突变体及其在制备非洲猪瘟抗原融合蛋白中的应用。所述的鞭毛素突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。本发明提供的鞭毛素截短突变体Fm能够高效上清表达，每升摇瓶培养及纯化后的蛋白产率可以达到40mg，易于放大及规模化生产，可以提高鞭毛素蛋白的广泛应用。将其与非洲猪瘟抗原蛋白融合后，在保持鞭毛素佐剂活性的同时，提高重组抗原的可溶性及表达水平，大大降低了表达及纯化工艺成本。

Description

一种鞭毛素突变体及其在制备非洲猪瘟抗原融合蛋白中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鞭毛素突变体及其在制备非洲猪瘟抗原融合蛋白中的应用。
背景技术
通过鞭毛素蛋白与目的蛋白混合或融合后免疫，可以提高机体对抗原的免疫应答，其中鞭毛素融合或偶联抗原免疫效果更为显著【1】【2】，以鞭毛素为佐剂的核酸疫苗仅在实验室阶段研究，虽然不用经过蛋白纯化工艺，但是核酸疫苗本身面临着不可预知的安全风险和临床监管；目前很多致病菌的鞭毛素可能具有潜在的危险性和毒性，免疫动物后产生大量针对自身的抗体，导致可能的耐受性及炎症反应，这主要源于鞭毛素可变区的高免疫原性。沙门氏同种属的鞭毛素蛋白的氨基及羧基末端比较保守，从结构上可以分为保守的D0，D1,可变区D2和D3区；其中鞭毛素蛋白抗原性很强的区域位于D2和D3区，根据文献报道，外源抗原通常可以与鞭毛素羧基端连接或插入高可变区(I型鞭毛素174-400位或201-368位)，均保留了鞭毛素TLR5信号通路活性【3、4】。保守D0结构域由N端和C端两组α螺旋构成，C末端6个氨基酸VLSLLR形成疏水基序Motif，位于鞭毛素内核，亚基间的强疏水相互作用是参与鞭毛素组装的关键驱动力【5、6】。
近年来非洲猪瘟在国内外集约化养猪场的感染率和发病率日益提高，给养殖场带来巨大的经济损失。非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswine fever virus，ASFV)引起的以高热、皮肤发绀、淋巴及内脏器官严重出血为特征的急性、接触性传染病，一旦暴发，死亡率接近90-100％。家猪和野猪是该病毒的自然宿主，感染后可终身带毒。ASFV是一种单股、两端共价连接的双链DNA病毒，具有二十面体结构，基因组全长约170kb～190kb，主要由4层组成：中央核仁、核衣壳、内层囊膜和二十面体的病毒衣壳，胞外病毒粒子，核衣壳具有双层囊膜。
研究表明，非洲猪瘟p54、p30等结构蛋白在病毒入侵，衣壳组装上起到重要作用【7、8】以这些蛋白为靶标的核酸疫苗及活载体疫苗均能一定程度上抑制非洲猪瘟在肺泡巨噬细胞(PAM)上的复制和增殖，降低带毒量，延缓病情的发作。非洲猪瘟病毒的传播途径主要为粪口传播，在唾液和扁桃体的分离率很高。因此，提高粘膜免疫对于非洲猪瘟的防控具有积极意义。
因此本发明对肠道沙门氏菌鞭毛素(WP_050188722)进行设计突变，与非洲猪瘟抗原融合表达，以期提高免疫猪群对靶抗原的黏膜免疫效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种鞭毛素突变体，所述的鞭毛素突变体，该突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。该突变体在降低鞭毛素抗原区免疫引起的副反应的同时，能够维持鞭毛素的佐剂活性。
本发明的另一个目的在于提供鞭毛素突变体在制备非洲猪瘟抗原融合蛋白中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人以肠道沙门氏菌鞭毛素(WP_050188722)为来源，以蛋白结构数据库5A3X主题骨架为模板，通过分子动力学模拟设计，保留了部分可变区的连接区，以最短的Linker序列GSGPGG替换了鞭毛素抗原可变区178～320位氨基酸(图1)，该鞭毛素突变体的预测自由能最小；同时去除了C末端促进鞭毛素亚基组装的6个氨基酸VLSLLR，以防止标签序列的包裹，提高鞭毛素蛋白的纯化效率；整个突变体在降低鞭毛素抗原区免疫引起的副反应的同时，能够维持鞭毛素的佐剂活性。获得的突变体Fm的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，编码该突变体的核苷酸为SEQ ID NO.3所示。
所述鞭毛素突变体可融合的促溶标签包括MBP、GST、NusA、TrxA、Sumo、Fh8、Msyb或Gb1；
优选的为：TrxA、Sumo及Msyb。
本发明的保护范围包括：鞭毛素突变体在制备非洲猪瘟抗原融合蛋白中的应用。
优选的，是将鞭毛素突变体与非洲猪瘟P54或P30蛋白进行融合表达。
优选地，制备的融合蛋白Fm-p54的氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示，Fm-p30的氨基酸序列为SEQ ID NO.13所示。
本发明的保护范围还包括：重组融合蛋白Fm-p54、Fm-p30在制备预防非洲猪瘟病毒感染的重组亚单位疫苗中的应用，包括利用本领域的常规方式，包括但不限于利用上述技术制备的融合蛋白，用于制备预防非洲猪瘟病毒感染的重组亚单位疫苗。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.本发明提供的鞭毛素截短突变体Fm能够高效上清表达，融合标签的鞭毛素突变体Fm上清表达量高达50～100mg/L，与镍柱结合的效果最好，上清中的目的蛋白大部分与镍柱结合，洗脱回收率超过90％，蛋白纯度高于90％，每升摇瓶培养及纯化后的蛋白产率可以达到40mg，易于放大及规模化生产，可以提高鞭毛素蛋白的广泛应用。
2.本发明构建了3种标签的鞭毛素突变体的重组载体，不同标签融合的鞭毛素突变体均在上清高效表达。这些载体能够广泛用于重组亚单位疫苗的表达，在保持鞭毛素佐剂活性的同时，提高重组抗原的可溶性及表达水平，大大降低了表达及纯化工艺成本。
3.由于所构建的鞭毛素突变体能够在上清中高效表达，融合后有助于p30、p54的上清表达。
4.本发明将非洲猪瘟保护性抗原与鞭毛素突变体融合，能够大量表达和制备。虽然p54、p30抗原的自身免疫原性具有差异，但是融合鞭毛素后，均可以显著提高抗原p54、p30的黏膜免疫水平；所述方法易于融合非瘟其它抗原，具有很强的扩展性。
附图说明
图1为Flagellin突变体(A所示)及抗原(Ant)融合构建(B所示)示意图。
图2：Flagellin全长及突变体片段扩增及载体回收核酸电泳图；
其中泳道1：Flagellin全长；2：Fm扩增片段；3：Fm-C6扩增片段；4：pET30t酶切回收骨架。
图3为pET30t-flagellin(全长)纯化SDS-PAGE图；
其中泳道1：Fla诱导表达上清液；2：Fla过NTA镍柱流穿液；3：Fla样品50mM咪唑洗涤收集4：Fla样品250mM咪唑洗脱收集。
图4为pET30t-Fm-C6纯化的SDS-PAGE图；
其中泳道1：Fm-C6诱导表达上清液；2：Fm-C6过NTA镍柱流穿液；3：Fm-C6样品50mM咪唑洗涤收集；4：Fm-C6样品250mM咪唑洗脱收集。
图5为pET30t-Fm纯化的SDS-PAGE图；
其中泳道1：Fm诱导表达上清液；2：Fm过NTA镍柱流穿液；3：Fm样品50mM咪唑洗涤液；4：Fm样品250mM咪唑洗脱收集1；5：Fm样品250mM咪唑洗脱收集2。
图6为Fm不同促溶标签载体表达SDS-PAGE图；
其中泳道1：Sumo-Fm表达总蛋白；2：Sumo-Fm表达上清；3：Sumo-Fm表达沉淀；4：TrxA-Fm表达总蛋白；5：TrxA-Fm表达上清；6：TrxA-Fm表达沉淀；7：Msyb-Fm表达总蛋白；8：Msyb-Fm表达上清；9：Msyb-Fm表达沉淀。
图7为Flagellin突变体Fm及非洲猪瘟基因扩增PCR示意图；
其中泳道M：DNA分子Marker；1：Fm；2：p54；3：p30。
图8为不同融合标签表达载体线性化核酸电泳图；
其中泳道1：pET30t线性化后骨架载体(BamHI/HindIII)；2：pET30s线性化后骨架载体(BamHI/HindIII)；3：pET30m线性化后骨架载体(BamHI/HindIII)。
图9为Flagellin突变体Fm与非瘟基因融合PCR示意图；
其中泳道M：DNA分子Marker；1：Fm-p30；2：Fm-p54；3：pET30t线性化后骨架载体(BamHI/HindIII)。
图10为鞭毛素突变体融合非洲猪瘟抗原蛋白表达SDS-PAGE示意图；
其中泳道M：蛋白预染Marker；1：Fm-p30破胞总蛋白；2：Fm-p30破胞上清；3：Fm-p54破胞总蛋白；4：Fm-p54破胞上清。
图11为鞭毛素突变体融合非洲猪瘟抗原蛋白纯化示意图；
其中泳道M：蛋白预染Marker；1：p54；2：Fm；3：Fm-p54；4：p30；5：Fm；6：Fm-p30。
图12为滴鼻免疫后唾液中p30、p54抗原特异性IgA变化水平示意图。
图13为鞭毛素融合抗原刺激细胞后培养上清中IL8水平示意图。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的实施例。结合实施对本发明做进一步的描述和论证。但是本实施例不是对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所示试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：鞭毛素突变体的获得
1.目的基因的设计及构建
全长Flagellin序列参考原始序列(WP_050188722)，由北京擎科生物合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。对全长Flagellin进行不同截断，截短体Fm-C6以柔性Linker序列GSGPGG替换全长Flagellin可变区178-320范围的氨基酸，保留激活TLR5通路的骨架序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。截短体Fm蛋白以柔性Linker序列GSGPGG替换全长Flagellin可变区178-320范围的氨基酸，保留激活TLR5通路的骨架序列，同时删除羧基末端的6个氨基酸VLSLLR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。将全长Flagellin，Fm-C6及Fm分别构建到pET30t载体(为在pET30载体的基础上加了一个促溶标签TrxA)上，筛选鉴定的阳性克隆子分别命名为pET30t-Flagellin，pET30t-Fm-C6，pET30t-Fm，图2。
2.重组质粒表达和纯化效率的比较
将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，3个表达菌株pET30t-Flagellin/BL21DE3，pET30t-Fm-C6/BL21DE3，pET30t-Fm/BL21DE3各摇瓶培养200m，8000rpm离心收获菌体，以50mL的PBS重悬菌体，4℃，1000bar高压破碎细菌，循环2次，共计10分钟；总蛋白溶液于12000rpm冷冻离心20min，分离上清。以武汉汇研生物NI-IMAC填料纯化蛋白；在PBS平衡后，分别以含20mM咪唑，50mM咪唑，250mM咪唑的PBS缓冲液依次洗涤镍填料，收集含吸收峰的样品液，SDS-PAGE检测纯化效果。
结果见图3-5，pET30t-Flagellin诱导表达的Flagellin全长蛋白结合较少，经多次优化结合条件，回收率均低于20％；pET30t-Fm-C6诱导表达的上清液中，与全长鞭毛素相比，仅缺失超可变区的鞭毛素突变体Fm-C6表达量提高30％，与亲和镍柱的结合效率为50％-70％，但是在低浓度50mM咪唑下有大量洗脱，说明两者的亲和力不高，最终目的蛋白回收率低于50％；pET30t-Fm诱导表达的蛋白量最高，高压破碎后目的蛋白浓度超过1mg/mL，与镍柱结合的效果最好，上清中的目的蛋白大部分与镍柱结合，洗脱回收率超过90％，蛋白纯度高于90％。结果表明，鞭毛素突变体Fm具有显著的上清表达量和高纯化回收率，易于规模化生产，末端6个氨基酸的去除对纯化效率起到明显影响。
3.不同标签融合鞭毛素的表达
根据前述结果选取鞭毛素截短突变体Fm作为融合佐剂，筛选不同促融标签，设计原理见图1：N端融合六聚组氨酸，Trx促溶标签，融合蛋白Trx-Fm的序列为SEQ ID NO.5所示；N端融合六聚组氨酸，Sumo促溶标签，融合蛋白Sumo-Fm的序列为SEQ ID NO.6；N端融合六聚组氨酸，Msyb促溶标签，融合蛋白Msyb-Fm的序列为SEQ ID NO.7；其中促溶标签TrxA、Sumo或Msyb与Fm之间预留BamH I位点，以及Nde I/Hind III酶切位点，亚克隆到大肠杆菌pET30a表达载体上，最终载体命名为pET30t-Fm，pET30s-Fm，pET30m-Fm。
3个质粒pET30t-Fm，pET30s-Fm，pET30m-Fm分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，孵育活化20分钟，涂布含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基。分别挑取重组转化子活化，次日接种于含50ug/ml的10mL的LB液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养至OD600约为0.6左右时，加入0.2-0.5mM IPTG，20℃培养12-16小时，8000rpm离心收获菌体，以2mL的PBS重悬菌体，4℃，超声波破碎5分钟，2s工作，3s间歇；总蛋白溶液于12000rpm冷冻离心20min,，分离上清和沉淀，SDS-PAGE检测融合标签后的表达情况。
结果表明(图6)，TrxA-Fm，Sumo-Fm及Msyb-Fm表达绝大部分在上清，上清中目的蛋白表达量可以占到80％以上，这3个载体可以用于筛选和表达不同病原微生物的保护性抗原。
实施例2：鞭毛素融合抗原的重组构建
1、Fm融合抗原的PCR扩增
Flagellin突变体基因Fm密码子及合成，见序列Sequence ID NO.3,
用于Fm融合PCR扩增的引物分别为
上游引物：BamH-Fm-F(5’-ctgtatttccagggaggatc-3’)
下游引物：Linker-Fm-R(5’-actgcctccagagccacc-3’)
扩增片段长度为828bp。
用于p30融合PCR扩增的引物分别为
上游引物：Linker-p30-F：
(5’-ggtggctctggaggcagtatggattttatcctgaacatcag-3’)
下游引物：HindIII-p30-R：
(5’-ctcgagtgcggccgcaagcttaataaccatcagacgaacaac-3’)
扩增片段长度为621bp。
用于p54融合PCR扩增的引物分别为：
上游引物：Linker-p54-F：
(5’-ggtggctctggaggcagtgctatcgaagaagaagacatc-3’)
下游引物：HindIII-p54-R：
(5’-ctcgagtgcggccgcaagcttcagagagttttccaggtcttt-3’)
扩增片段长度为405bp。
非洲猪瘟p54基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示；非洲猪瘟p30基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示。用于扩增上述目的DNA片段(分别见SEQ ID NO：3、8、10)及融合后的片段的PCR反应体系(总体积50μl)如下：
2×MIX Buffer 25μl，10μM上、下游引物各2μl,无菌水20.5μl，模板0.5μl。
反应程序为：
步骤1：95℃，5分钟预变性，1个循环；
步骤2：95℃，20秒；56℃，20秒；72℃，10到15秒；共计30循环。
步骤3：72，5分钟，1个循环；
步骤4：16，保温5分钟。
其中Fm、p54、p30的片段PCR扩增时，72℃延伸时间为10秒，扩增结果见图7，Fm-p54、Fm-p30融合PCR引物对分别为各自的前向及反向引物。72℃延伸时间为15秒，扩增结果见图9。
构建的载体pET30t-Fm，pET30s-Fm，pET30m-Fm以BamHI/HindIII双酶切，琼脂糖凝胶回收约5600bp左右的载体骨架，见图8；
2、Fm融合抗原的同源重组，转化及重组子鉴定
在10μl反应体系中加入40ng左右的线性化骨架片段pET30t-Fm，目的片段Fm-p54、Fm-p30，各自反应体系中加入80ng-100ng，在重组酶作用下，50℃反应20分钟，热激法转化大肠杆菌DH5α感受态，孵育活化45分钟，涂布含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基，使用上述基因特异性引物鉴定初筛并测序鉴定，活化正确的重组子菌液，使用碱裂解法提取质粒pET30t-Fm-P30，pET30t-Fm-P54。
实施例4：鞭毛素融合非洲猪瘟抗原在大肠杆菌中的表达及纯化
1、Fm融合抗原的小试表达
pET30t-Fm-p54,pET30t-Fm-p30分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,孵育活化20分钟，涂布含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基。
分别挑取重组转化子活化，翌日接种于含50ug/ml的10mL的LB液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养至OD600约为0.6左右时，加入0.2-0.5mM IPTG，20℃培养12-16小时，8000rpm离心收获菌体，以1mL的PBS重悬菌体，4℃，超声波破碎5分钟，2s工作，3s间歇；总蛋白溶液于12000rpm冷冻离心20min,分离上清和沉淀，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况，见图10。由pET30t-Fm-p54和pET30t-Fm-p30诱导表达的目的蛋白在上清中的浓度分别为0.9mg/mL和0.35mg/ml。融合蛋白Fm-p54的氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示，Fm-p30的氨基酸序列为SEQ ID NO.13所示。
2、Fm融合抗原的大规模表达及纯化
活化的5mL甘油菌接种于含50μg/ml的1L的LB液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养至OD600约为0.6左右时，加入0.4mM IPTG，20℃培养12-16小时，8000rpm离心收获菌体，以总体积100mL的PBS重悬菌体，4℃，1000ba高压破碎2个循环，于12000rpm冷冻离心20min,分离上清；
使用Ni-IMAC或NI-NTA及其它同等镍柱亲和填料，以PBS pH7.4平衡10个柱体积，以适量的流速上样，以250mM咪唑洗脱目的蛋白，纯化的蛋白去内毒素后透析到PBS溶液中，由BCA法定量蛋白浓度，SDS-PAGE鉴定纯化的蛋白见图11。大规模表达和纯化时蛋白浓度可达到:每1L培养基中目的蛋白在上清中的表达浓度分别为0.80mg/mL和0.3mg/ml，经纯化后Fm-p54和Fm-p30浓度分别为78.0mg/L和28.5mg/L，回收率高于90％。
经标签融合鞭毛素的Fm-p30,Fm-p54均可表达在上清中，其中Fm-p54的目的蛋白约占上清总蛋白30％，通过一步镍柱亲和层析可以纯化达到90％纯度的目的蛋白，纯化方法步骤少，蛋白纯度高，易于规模化生产。
实施例5：滴鼻免疫及免疫效果评价
将表达的非洲猪瘟P54蛋白、P30蛋白；鞭毛素突变体融合P54蛋白(Fm-p54)；鞭毛素突变体融合P30蛋白(Fm-p30)；非洲猪瘟P54、P30蛋白分别混合鞭毛素突变体Fm进行小猪免疫效果评价。
具体免疫分组如下：
①100μg p54；②100μg Fm-p54；③100μg p54+100μg Fm；④100μg p30；⑤100μgFm-p30；⑥100μgp30+100μg Fm
采取鼻腔喷雾吸入，免疫3周加强免疫，在二免疫前和二免疫后3周取唾液样品，ELISA检测唾液抗原特异性IgA水平。
ELISA板分别包被p54、p30，抗原浓度梯度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8μg；优选0.2μg包被量进行特异性抗原的IgA的检测；使用5％脱脂奶粉4℃封闭过夜，PBST洗涤3次，拍打甩干，每次10分钟；分别与一定倍数稀释的猪唾液(1:10)混合，37℃孵育2h，PBST洗涤3次，拍打甩干，每次10分钟；以抗猪IgA并偶联HRP标记的鼠二抗(1:2000)37℃孵育2h，PBST洗涤3次，拍打甩干，每次10分钟，然后用PBS洗涤2次，每次5分钟；加入TMB反应液10分钟，加入50μL终止液，30分钟内在450nm测定每孔的吸收值，记录不同抗原在不同时间的抗原特异性IgA的变化水平。
结果如图12所示：融合鞭毛素突变体Fm的免疫原Fm-p30、Fm-p54，在唾液中特异性IgA水平显著高于单独免疫非洲猪瘟抗原和混合免疫抗原。
实施例6：融合抗原细胞刺激效果
培养的Caco2细胞以2×105个细胞/mL计数铺板，于DMEM+10％胎牛血清中37℃，5％CO2静置培养，分别在每孔中加入以下抗原组，每组设置3个重复孔；
①100ng/mL p54；②100ng/mL p54+100ng/mL Fm；③100ng/mL Fm-p54；④100ng/mL p30⑤100ng/mL p30+100ng/mL Fm；⑥100ng/mL Fm-p30
人IL8双抗夹心ELISA板预包被IL8抗体,使用5％BSA 4℃封闭过夜，PBST洗涤3次，拍打甩干，每次10分钟；分别设置样品孔和标准孔；每孔分别加入50ul细胞培养液上清样品或标准品，37℃孵育2h，PBST洗涤3次，拍打甩干，每次10分钟；以偶联HRP标记的IL8鼠二抗(1:2000)37℃孵育2h，PBST洗涤3次，拍打甩干，每次10分钟，然后用PBS洗涤2次，每次5分钟；加入TMB反应液10分钟，加入50μL终止液，30分钟内在450nm测定每孔的吸收值，以标准品的吸收值和对应的浓度建立标准曲线，计算对应样品孔的IL8浓度(ng/μL)。
结果如图13所示：不加鞭毛素的细胞刺激组IL8的水平很低，没有激活下游TLR5通路，而融合鞭毛素表达的抗原相比混合鞭毛素的抗原，Fm-p30，Fm-p54激活TLR5通路产生的IL8水平分别高2到3倍之间，具有显著性水平。
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序列表
<110> 武汉科前生物股份有限公司 华中农业大学
<120> 一种鞭毛素突变体及其在制备非洲猪瘟抗原融合蛋白中的应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1227
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa cctgaacaaa 60
tcccagtccg cactgggcac tgctatcgag cgtttgtctt ccggtctgcg tatcaacagc 120
gcgaaagacg atgcggcagg acaggcgatt gctaaccgtt ttaccgcgaa catcaaaggt 180
ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc 240
gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgcg 300
aatggtacta actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgcctg 360
aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaacg gcgtgaaagt cctggcgcag 420
gacaacaccc tgaccatcca ggttggtgcc aacgacggtg aaactatcga tattgattta 480
aaagaaatca gctctaaaac actgggactt gataagctta atgtccaaga tgcctacacc 540
ccgaaagaaa ctgctgtaac cgttgataaa actacctata aaaatggtac agatcctatt 600
acagcccaga gcaatactga tatccaaact gcaattggcg gtggtgcaac gggggttact 660
ggggctgata tcgaattctt tgaggataaa aacggtaagg ttattgatgg tggctatgca 720
gtgaaaatgg gcgacgattt ctatgccgct acatatgatg agaaaacagg tgcaattact 780
gctaaaacca ctacttatac agatggtact ggcgttgctc aaactggagc tgtgaaattt 840
ggtggcgcaa atggtaaatc tgaagttgtt actgctaccg atggtaagac ttacttagca 900
agcgaccttg acaaacataa cttcagaaca ggcggtgagc ttaaagaggt taatacagat 960
aagactgaaa acccactgca gaaaattgat gctgccttgg cacaggttga tacacttcgt 1020
tctgacctgg gtgcggttca gaaccgtttc aactccgcta tcaccaacct gggcaatacc 1080
gtaaataacc tgtcttctgc ccgtagccgt atcgaagatt ccgactacgc aaccgaagtc 1140
tccaacatgt ctcgcgcgca gattctgcag caggccggta cctccgttct ggcgcaggcg 1200
aaccaggttc cgcaaaacgt cctctct 1227
<210> 2
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn Asn
1 5 10 15
Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu Ser
20 25 30
Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala
35 40 45
Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ser
50 55 60
Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala
65 70 75 80
Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala Val
85 90 95
Gln Ser Ala Asn Gly Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile Gln
100 105 110
Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln
115 120 125
Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu Thr
130 135 140
Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu Lys
145 150 155 160
Glu Ile Ser Ser Lys Thr Leu Gly Leu Asp Lys Leu Asn Val Gln Asp
165 170 175
Gly Ser Gly Pro Gly Gly Lys Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp
180 185 190
Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val
195 200 205
Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn
210 215 220
Asn Leu Ser Ser Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr
225 230 235 240
Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr
245 250 255
Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu
260 265 270
Leu Arg
<210> 3
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcacaagtca ttaatacaaa cagcctgtcg ctgttgaccc agaataacct gaacaaatcc 60
cagtccgcac tgggcactgc tatcgagcgt ttgtcttccg gtctgcgtat caacagcgcg 120
aaagacgatg cggcaggaca ggcgattgct aaccgtttta ccgcgaacat caaaggtctg 180
actcaggctt cccgtaacgc taacgacggt atctccattg cgcagaccac tgaaggcgcg 240
ctgaacgaaa tcaacaacaa cctgcagcgt gtgcgtgaac tggcggttca gtctgcgaat 300
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gaaatcagct ctaaaacact gggacttgat aagctgaatg tccaagatgg aagcggtccg 540
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caggcgaacc aggttccgca aaac 804
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<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn Asn
1 5 10 15
Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu Ser
20 25 30
Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala
35 40 45
Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ser
50 55 60
Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala
65 70 75 80
Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala Val
85 90 95
Gln Ser Ala Asn Gly Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile Gln
100 105 110
Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln
115 120 125
Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu Thr
130 135 140
Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu Lys
145 150 155 160
Glu Ile Ser Ser Lys Thr Leu Gly Leu Asp Lys Leu Asn Val Gln Asp
165 170 175
Gly Ser Gly Pro Gly Gly Lys Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp
180 185 190
Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val
195 200 205
Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn
210 215 220
Asn Leu Ser Ser Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr
225 230 235 240
Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr
245 250 255
Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn
260 265
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<211> 404
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Asn His Lys Val His His His His His His Val Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu
20 25 30
Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly
35 40 45
Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr
50 55 60
Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly
65 70 75 80
Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe
85 90 95
Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly
100 105 110
Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Gly Glu
115 120 125
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser
130 135 140
Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala
165 170 175
Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn
180 185 190
Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser
195 200 205
Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu
210 215 220
Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Gln Ser Ala Asn Gly Thr Asn Ser
225 230 235 240
Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn
245 250 255
Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val
260 265 270
Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly
275 280 285
Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu Lys Glu Ile Ser Ser Lys Thr Leu Gly
290 295 300
Leu Asp Lys Leu Asn Val Gln Asp Gly Ser Gly Pro Gly Gly Lys Thr
305 310 315 320
Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Thr
325 330 335
Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile
340 345 350
Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Ser Ser Ala Arg Ser Arg
355 360 365
Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala
370 375 380
Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln
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Val Pro Gln Asn
<210> 6
<211> 397
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro
20 25 30
Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val
35 40 45
Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro
50 55 60
Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met
65 70 75 80
Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln
85 90 95
Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His
100 105 110
Arg Glu Gln Ile Gly Gly Ser Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly
115 120 125
Ser Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn
130 135 140
Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu
145 150 155 160
Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln
165 170 175
Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala
180 185 190
Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly
195 200 205
Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala
210 215 220
Val Gln Ser Ala Asn Gly Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile
225 230 235 240
Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly
245 250 255
Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu
260 265 270
Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu
275 280 285
Lys Glu Ile Ser Ser Lys Thr Leu Gly Leu Asp Lys Leu Asn Val Gln
290 295 300
Asp Gly Ser Gly Pro Gly Gly Lys Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile
305 310 315 320
Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala
325 330 335
Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val
340 345 350
Asn Asn Leu Ser Ser Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala
355 360 365
Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly
370 375 380
Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn
385 390 395
<210> 7
<211> 428
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ser Asp Glu Asn His Asn Ser Asp Val Gln Asp
20 25 30
Ile Pro Ser Pro Glu Leu Ser Val Asp Ser Asn Ser Asn Glu Asn Glu
35 40 45
Leu Met Asn Asn Ser Ser Ala Asp Asp Gly Ile Glu Phe Asp Ala Pro
50 55 60
Gly Asn Asp Asn Ser Ser Val Gly Ser Asp Ser Ala Ala Glu Asp Gly
65 70 75 80
Glu Asp Glu Glu Asp Lys Lys Asp Lys Thr Lys Asp Lys Glu Val Glu
85 90 95
Leu Arg Arg Glu Thr Leu Glu Lys Glu Gln Lys Asp Val Asp Glu Ala
100 105 110
Ile Lys Lys Ile Thr Arg Glu Glu Asn Asp Asn Thr His Phe Pro Thr
115 120 125
Asn Met Glu Asn Val Asn Tyr Asp Leu Leu Gln Lys Gln Val Lys Tyr
130 135 140
Ile Met Asp Gly Gly Ser Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser
145 150 155 160
Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn Asn
165 170 175
Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu Ser
180 185 190
Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala
195 200 205
Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ser
210 215 220
Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala
225 230 235 240
Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala Val
245 250 255
Gln Ser Ala Asn Gly Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile Gln
260 265 270
Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln
275 280 285
Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu Thr
290 295 300
Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu Lys
305 310 315 320
Glu Ile Ser Ser Lys Thr Leu Gly Leu Asp Lys Leu Asn Val Gln Asp
325 330 335
Gly Ser Gly Pro Gly Gly Lys Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp
340 345 350
Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val
355 360 365
Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn
370 375 380
Asn Leu Ser Ser Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr
385 390 395 400
Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr
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<210> 8
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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tctctg 366
<210> 9
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ala Ile Glu Glu Glu Asp Ile Gln Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Asp Gln
1 5 10 15
Gln Trp Val Glu Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr Ser Lys Pro Ala Gly
20 25 30
Ala Thr Thr Ala Ser Ala Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr
35 40 45
Asn Arg Pro Ala Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro Val Thr Asp
50 55 60
Arg Leu Val Met Ala Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala
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Ser Ala His Pro Thr Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr
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Tyr Thr His Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu
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<210> 10
<211> 582
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggatttta tcctgaacat cagcatgaaa atggaagtta tttttaaaac cgatctgcgc 60
agcagctccc aggttgtgtt tcatgcaggt agcctgtata actggtttag cgtggaaatt 120
attaacagcg gtcgcattgt taccacagcc attaaaaccc tgctgagcac cgttaaatat 180
gatattgtta aaagcgcccg tatttatgca ggtcagggct ataccgaaca tcaggcacag 240
gaagaatgga atatgattct gcatgttctg tttgaagaag aaaccgaaag tagcgcaagc 300
agcgaaaata ttcatgaaaa aaatgataat gaaaccaatg aatgtaccag cagctttgaa 360
accctgtttg aacaggaacc gagcagcgaa gttccgaaag atagcaaact gtatatgctg 420
gcacagaaaa ccgttcagca tattgaacag tatggtaaag caccggattt taataaagtt 480
attcgtgcac ataattttat tcagaccatt tatggtaccc cgctgaaaga agaagaaaaa 540
gaagttgttc gtctgatggt tattaaactg ctgaaaaaaa aa 582
<210> 11
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys
1 5 10 15
Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu
20 25 30
Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr
35 40 45
Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys
50 55 60
Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln
65 70 75 80
Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu
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Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr
100 105 110
Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser
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Ser Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Met Leu Ala Gln Lys Thr
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Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val
145 150 155 160
Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys
165 170 175
Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu Met Val Ile Lys Leu Leu Lys
180 185 190
Lys Lys
<210> 12
<211> 532
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Asn His Lys Val His His His His His His Val Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu
20 25 30
Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly
35 40 45
Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr
50 55 60
Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly
65 70 75 80
Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe
85 90 95
Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly
100 105 110
Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Gly Glu
115 120 125
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser
130 135 140
Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala
165 170 175
Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn
180 185 190
Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser
195 200 205
Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu
210 215 220
Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Gln Ser Ala Asn Gly Thr Asn Ser
225 230 235 240
Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn
245 250 255
Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val
260 265 270
Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly
275 280 285
Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu Lys Glu Ile Ser Ser Lys Thr Leu Gly
290 295 300
Leu Asp Lys Leu Asn Val Gln Asp Gly Ser Gly Pro Gly Gly Lys Thr
305 310 315 320
Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Thr
325 330 335
Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile
340 345 350
Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Ser Ser Ala Arg Ser Arg
355 360 365
Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala
370 375 380
Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln
385 390 395 400
Val Pro Gln Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Ile Glu Glu Glu Asp
405 410 415
Ile Gln Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val Thr
420 425 430
Pro Gln Pro Gly Thr Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ser Ala
435 440 445
Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala Thr Asn
450 455 460
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465 470 475 480
Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala His Pro Thr Glu
485 490 495
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500 505 510
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Glu Asn Ser Leu
530
<210> 13
<211> 604
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Asn His Lys Val His His His His His His Val Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu
20 25 30
Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly
35 40 45
Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr
50 55 60
Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly
65 70 75 80
Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe
85 90 95
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100 105 110
Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Gly Glu
115 120 125
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser
130 135 140
Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala
165 170 175
Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn
180 185 190
Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser
195 200 205
Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu
210 215 220
Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Gln Ser Ala Asn Gly Thr Asn Ser
225 230 235 240
Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn
245 250 255
Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val
260 265 270
Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly
275 280 285
Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu Lys Glu Ile Ser Ser Lys Thr Leu Gly
290 295 300
Leu Asp Lys Leu Asn Val Gln Asp Gly Ser Gly Pro Gly Gly Lys Thr
305 310 315 320
Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Thr
325 330 335
Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile
340 345 350
Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Ser Ser Ala Arg Ser Arg
355 360 365
Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala
370 375 380
Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln
385 390 395 400
Val Pro Gln Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Asp Phe Ile Leu Asn
405 410 415
Ile Ser Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys Thr Asp Leu Arg Ser Ser
420 425 430
Ser Gln Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu Tyr Asn Trp Phe Ser Val
435 440 445
Glu Ile Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr Thr Ala Ile Lys Thr Leu
450 455 460
Leu Ser Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys Ser Ala Arg Ile Tyr Ala
465 470 475 480
Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln Glu Glu Trp Asn Met Ile
485 490 495
Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu Ser Ser Ala Ser Ser Glu
500 505 510
Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr Asn Glu Cys Thr Ser Ser
515 520 525
Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser Ser Glu Val Pro Lys Asp
530 535 540
Ser Lys Leu Tyr Met Leu Ala Gln Lys Thr Val Gln His Ile Glu Gln
545 550 555 560
Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val Ile Arg Ala His Asn Phe
565 570 575
Ile Gln Thr Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys Glu Glu Glu Lys Glu Val
580 585 590
Val Arg Leu Met Val Ile Lys Leu Leu Lys Lys Lys
595 600
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctgtatttcc agggaggatc 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
actgcctcca gagccacc 18
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggtggctctg gaggcagtat ggattttatc ctgaacatca g 41
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctcgagtgcg gccgcaagct taataaccat cagacgaaca ac 42
<210> 18
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggtggctctg gaggcagtgc tatcgaagaa gaagacatc 39
<210> 19
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctcgagtgcg gccgcaagct tcagagagtt ttccaggtct tt 42

Claims (6)

1.一种人工合成的鞭毛素突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述的鞭毛素突变体在制备非洲猪瘟抗原融合蛋白中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，所述融合蛋白的促融标签为TrxA、Sumo或Msyb。
4.根据权利要求2所述的应用，是将鞭毛素突变体与非洲猪瘟P54或P30蛋白进行融合表达获得不同的融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的应用，所述的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.12或SEQID NO.13所示。
6.根据权利要求2所述的应用，所述的融合大白在制备预防非洲猪瘟病毒感染的重组亚单位疫苗中的应用。
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