CN114292226B - 具有异羟肟酸结构的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了具有异羟肟酸结构的化合物及其制备方法和应用，属于化学药物领域。本发明提供的具有异羟肟酸结构的化合物，具有如式I、Ⅱ或Ⅲ所示的化学结构，通过将刺猬信号通路拮抗剂的药效基团与异羟肟酸片段拼合，增加化合物与HDAC中锌离子的螯合作用，在保持对刺猬信号通路拮抗作用的同时表现出较强的HDAC抑制作用。本发明提供的具有异羟肟酸结构的化合物，在浓度为10μM时，对HDAC的抑制率高达93.43％，在浓度为5μM时，下调刺猬信号通路转录因子Gli1的表达可达到‑87.10％，表现出对刺猬信号通路的活性有较强的抑制作用，在浓度为10μM时，对A549非小细胞肺癌细胞增殖的抑制率高达86.84％，抑制Jurkat白血病细胞的IC50值低至0.57μM。

Description

具有异羟肟酸结构的化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及化学药物领域，尤其涉及具有异羟肟酸结构的化合物及其制备方法和应用。

背景技术

乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)是调控细胞内乙酰化修饰的关键酶。HAT可以将乙酰辅酶A的乙酰基部分转移到组蛋白赖氨酸残基的氨基上，促使染色体DNA构象的展开，招募转录因子进行基因表达，HDAC可以去除组蛋白赖氨酸残基上的乙酰基，使染色质结构变紧密，抑制基因的转录表达。HDAC功能和表达在多种癌症中受到干扰，并且常常与预后不良相关，抑制HDAC可对癌细胞产生多种作用。

此外，1980年，在果蝇中发现刺猬信号通路，脊椎动物有3种刺猬同源基因，即sonichedgehog(Shh)、indianhedgehog(Ihh)和deserthedgehog(Dhh)[Forbesa J.DevSuppl,1993,11(13):115-124.]。研究发现刺猬信号通路在器官形成、组织的修复/更新、干细胞存活等方面发挥重要作用。刺猬信号通路在肿瘤干细胞的增殖和自我修复、EMT过程、细胞凋亡等方面均具有非常重要的作用，其异常激活是肿瘤的发生、侵袭、转移、复发与耐药的关键因素。现已证明包括基底细胞癌(BCC)、髓母细胞瘤(MB)、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌和卵巢癌等超过30％的人类肿瘤与刺猬信号通路异常相关。并且，研究显示Gli蛋白的乙酰化作用是刺猬信号传导的关键翻译检查点。存在一种自动调整的环路，声音刺猬蛋白(SHh)增加HDAC1水平，HDAC1通过对Gli1和Gli2进行去乙酰化提高刺猬蛋白-诱导信号活化作用。此外，组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂抑制Gli1和Gli2的活化作用，可以抑制肿瘤细胞神经前体的刺猬蛋白依赖型生长。

目前研究表明，联合靶向组蛋白去乙酰化酶(HDAC)和刺猬信号通路传导能够提高胰腺腺癌的细胞毒性。然而，联合使用作用于不同靶点的试剂，或者将靶向治疗剂与标准化疗剂或者辐射相结合，在多数情况下，在达到药理学有意义的疗效之前，就已经发生了剂量极限毒性，并且目前，这种结合方式仅仅限于有限的药代动力学或者药效性质相兼容的药物。因此，如何将刺猬信号通路抑制作用和组蛋白去乙酰化酶抑制作用结合在单个分子中为治疗应用提供一种协同效应，即如何提供一种与刺猬信号通路和组蛋白去乙酰化酶有关的疾病和失调的药物治疗剂是目前研究的热点问题。

发明内容

本发明的目的在于提供具有异羟肟酸结构的化合物及其制备方法和应用，本发明提供的具有异羟肟酸结构的化合物，同时具有较强的刺猬信号通路抑制作用和组蛋白去乙酰化酶抑制作用，具有作为治疗与刺猬信号通路和组蛋白去乙酰化酶有关的疾病和失调的药物治疗剂的应用价值。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了具有异羟肟酸结构的化合物，具有如式I、Ⅱ或Ⅲ所示的化学结构：

所述式I、Ⅱ和Ⅲ中的R₁独立地为氟原子、氯原子、溴原子、碘原子或甲基；

所述式I、Ⅱ和Ⅲ中的R₂独立地为取代或者未被取代的芳基、取代或者未被取代的杂芳基、取代或者未被取代的饱和或者部分不饱和的杂环基；

所述式I和Ⅱ中的R₃独立地为氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、氢原子或甲基；

所述式Ⅲ中的R₄为氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、氢原子、甲基或甲氧基；

所述式Ⅲ中的X为-O-、-S-、-NH-或-CH₂-。

优选地，所述式I、Ⅱ和Ⅲ中的R₁为氯原子；

所述式I、Ⅱ和Ⅲ中的R₂独立地为

所述式I和Ⅱ中的R₃独立地为氯原子、氢原子或甲基；

所述式Ⅲ中的R₄为氢原子或甲氧基。

优选地，所述式I和Ⅱ中的-CH＝CH-CO-NH-OH在R₃的对位或间位；

所述式Ⅲ中的-CH＝CH-CO-NH-OH在R₄的对位或间位。

本发明还提供了包含上述技术方案所述具有异羟肟酸结构的化合物的药物组合物。

本发明还提供了上述技术方案所述具有异羟肟酸结构的化合物或权利要求4所述药物组合物在制备用于治疗与刺猬信号通路或组蛋白去乙酰化酶相关疾病的药物中的应用。

优选地，所述与刺猬信号通路或组蛋白去乙酰化酶相关疾病为白血病和/或非小细胞肺癌。

本发明还提供了上述技术方案所述具有异羟肟酸结构的化合物的制备方法，所述具有式I所示的化学结构的化合物的制备方法包括以下步骤：

(1)将具有式A-4所示结构的化合物、具有式V所示结构的化合物、碱性化合物和有机溶剂混合进行磺酰胺化反应，得到具有式A-5所示结构的化合物；

(2)将所述步骤(1)得到的具有式A-5所示结构的化合物、盐酸羟胺、甲醇和甲醇钠混合进行酰胺化反应，得到具有式I所示结构的化合物

本发明还提供了上述技术方案所述具有异羟肟酸结构的化合物的制备方法，所述具有式II所示的化学结构的化合物的制备方法包括以下步骤：

1)将具有式C-4所示结构的化合物、固体光气、碱性化合物和有机溶剂混合进行异氰酸酯制备反应，得到第一反应前体；

2)将所述步骤1)得到的第一反应前体、具有式V所示结构的化合物、碱性化合物和有机溶剂混合进行异氰酸酯加成反应，得到具有式C-5所示结构的化合物；

3)将所述步骤2)得到的具有式C-5所示结构的化合物、盐酸羟胺、四氢呋喃、甲醇和甲醇钠混合进行酰胺化反应，得到具有式II所示结构的化合物

本发明还提供了上述技术方案所述具有异羟肟酸结构的化合物的制备方法，其特征在于，所述具有式III所示的化学结构中X为-O-的化合物的制备方法包括以下步骤：

①将具有式E-5′所示结构的化合物、具有式W所示结构的化合物、乙腈、碳酸钾、碘化钾和四丁基溴化胺混合进行成醚反应，得到具有式E-6′所示结构的化合物；

②将所述步骤①得到的具有式E-6′所示结构的化合物、盐酸羟胺、四氢呋喃、甲醇和甲醇钠混合进行酰胺化反应，得到具有式Ⅲ所示结构的化合物

本发明还提供了上述技术方案所述具有异羟肟酸结构的化合物的制备方法，所述具有式III所示的化学结构中X为-S-、-NH-或-CH₂-的化合物的制备方法包括以下步骤：

(a)将具有式E-5所示结构的化合物、氯化亚砜和催化剂混合进行反应，得到第二反应前体；

(b)将所述步骤(a)得到的第二反应前体、具有式V所示结构的化合物、碱性化合物和有机溶剂混合进行缩合反应，得到具有式E-6所示结构的化合物；

(c)将所述步骤(b)得到的具有式E-6所示结构的化合物、盐酸羟胺、醇和甲醇钠混合进行酰胺化反应，得到具有式Ⅲ所示结构的化合物

本发明提供的具有异羟肟酸结构的化合物，具有如式I、Ⅱ或Ⅲ所示的化学结构，通过将刺猬信号通路拮抗剂的药效基团2-苯基取代的吡啶或苯并咪唑，以及取代苯环与异羟肟酸片段通过合适的连接链连接，其中2-苯基取代的吡啶或苯并咪唑可以与刺猬信号通路关键蛋白Smo产生氢键作用和疏水作用，并且可以作为HDAC抑制剂的Cap部分与HDAC结合口袋的表面区产生相互作用，异羟肟酸片段增加化合物与HDAC中锌离子的螯合作用，同时也与Smo蛋白中的氨基酸形成氢键。因此，本发明提供的提供的化合物在保持对刺猬信号通路拮抗作用的同时表现出较强的HDAC抑制作用。实施例的结果显示，本发明提供的具有异羟肟酸结构的化合物，在浓度为10μM时，对HDAC的抑制率高达93.43％，在浓度为5μM时，下调刺猬信号通路转录因子Gli1的表达可达到-87.10％，表现出对刺猬信号通路的活性有较强的抑制作用，在浓度为10μM时，对A549非小细胞肺癌细胞增殖的抑制率高达86.84％，抑制Jurkat白血病细胞的IC50值低至0.57μM。

具体实施方式

本发明提供了具有异羟肟酸结构的化合物，具有如式I、Ⅱ或Ⅲ所示的化学结构：

所述式I、Ⅱ和Ⅲ中的R₁独立地为氟原子、氯原子、溴原子、碘原子或甲基；

所述式I、Ⅱ和Ⅲ中的R₂独立地为取代或者未被取代的芳基、取代或者未被取代的杂芳基、取代或者未被取代的饱和或者部分不饱和的杂环基，更优选为

所述式I和Ⅱ中的R₃独立地为氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、氢原子或甲基，更优选为氯原子、氢原子或甲基；

所述式Ⅲ中的R₄为氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、氢原子、甲基或甲氧基，更优选为氢原子或甲氧基；

所述式Ⅲ中的X为-O-、-S-、-NH-或-CH₂-；

所述式I和Ⅱ中的-CH＝CH-CO-NH-OH优选在R₃的对位；

所述式Ⅲ中的-CH＝CH-CO-NH-OH优选在R₄的对位。

在本发明中，所述式I所示的化学结构的具有异羟肟酸结构的化合物优选为

中的任意一种。

在本发明中，所述式II所示的化学结构的具有异羟肟酸结构的化合物优选为

中的任意一种。

在本发明中，所述式III所示的化学结构的具有异羟肟酸结构的化合物优选为

中的任意一种。

本发明提供的具有异羟肟酸结构的化合物，具有如式I、Ⅱ或Ⅲ所示的化学结构，通过将刺猬信号通路拮抗剂的药效基团与异羟肟酸片段拼合，增加化合物与HDAC中锌离子的螯合作用，在保持对刺猬信号通路拮抗作用的同时表现出较强的HDAC抑制作用。

本发明还提供了包含上述技术方案所述具有异羟肟酸结构的化合物的药物组合物。

本发明还提供了上述技术方案所述具有异羟肟酸结构的化合物或所述药物组合物在制备用于治疗与刺猬信号通路或组蛋白去乙酰化酶相关疾病的药物中的应用。在本发明中，所述与刺猬信号通路或组蛋白去乙酰化酶相关疾病优选为白血病和/或非小细胞肺癌。

本发明还提供了上述技术方案所述具有异羟肟酸结构的化合物的制备方法。

在本发明中，所述具有式I所示的化学结构的化合物的制备方法包括以下步骤：

(1)将具有式A-4所示结构的化合物、具有式V所示结构的化合物、碱性化合物和有机溶剂混合进行磺酰胺化反应，得到具有式A-5所示结构的化合物；

(2)将所述步骤(1)得到的具有式A-5所示结构的化合物、盐酸羟胺、甲醇和甲醇钠混合进行酰胺化反应，得到具有式I所示结构的化合物

在本发明中，若无特殊说明，所采用的原料均为本领域常规市售产品。

在本发明中，若无特殊说明，所进行的操作均为室温条件。

本发明将具有式A-4所示结构的化合物、具有式V所示结构的化合物、碱性化合物和有机溶剂混合进行磺酰胺化反应，得到具有式A-5所示结构的化合物。

在本发明中，所述具有式A-4所示结构的化合物中-CH＝CH-CO-OCH₃在R₃的对位或间位。

在本发明中，所述碱性化合物优选为吡啶或三乙胺。

在本发明中，当所述碱性化合物为吡啶时，所述有机溶剂优选为吡啶。在本发明中，当时所述碱性化合物和有机溶剂均为吡啶时，所述具有式A-4所示结构的化合物、具有式V所示结构的化合物、碱性化合物和有机溶剂的混合优选为：首先将具有式V所示结构的化合物和具有式A-4所示结构的化合物分别吡啶混合后，得到具有式V所示结构的化合物的吡啶溶液和具有式A-4所示结构的化合物的吡啶溶液；将所述具有式V所示结构的化合物的吡啶溶液在氩气保护、冰水浴的条件下搅拌降温至温度低于5℃，然后滴加具有式A-4所示结构的化合物的吡啶溶液。

在本发明中，当所述碱性化合物为三乙胺时，所述有机溶剂优选为二氯甲烷。在本发明中，当时所述碱性化合物为三乙胺，有机溶剂优选为二氯甲烷时，所述具有式A-4所示结构的化合物、具有式V所示结构的化合物、碱性化合物和有机溶剂的混合优选为：首先将具有式A-4所示结构的化合物和部分二氯甲烷混合后，得到具有式A-4所示结构的化合物的二氯甲烷溶液；将所述具有式V所示结构的化合物、剩余二氯甲烷和三乙胺在冰水浴的条件下搅拌降温至温度低于5℃，然后滴加所述具有式A-4所示结构的化合物的二氯甲烷溶液。

在本发明中，所述具有式A-4所示结构的化合物的物质的量、具有式V所示结构的化合物的物质的量和碱性化合物的物质的量之比优选为1mol：(0.5～1.5)mol：(2～10)mol，更优选为1mol：(0.9～1.2)mol：(3～4)mol。本发明将上述原料的比例控制在上述范围内，有利于简化产品纯化过程并提高收率。

在本发明中，所述磺酰胺化反应的温度优选室温。在本发明中，所述磺酰胺化反应的时间优选为3～6h，更优选为3.5～5h。本发明将磺酰胺化反应的温度和时间控制在上述范围内，有利于提高原料转化率并减少杂质生成。

磺酰胺化反应完成后，本发明优选将所述磺酰胺化反应的产物进行后处理，得到具有式A-5所示结构的化合物。

在本发明中，当所述碱性化合物为吡啶时，所述后处理优选为将所述磺酰胺化反应的产物依次进行减压蒸馏、溶解、洗涤、干燥、抽滤、浓缩和重结晶。

本发明对所述减压蒸馏的方式没有特殊的限制，实现除去残留的吡啶的目的即可。在本发明中，所述溶解所用溶剂优选为乙酸乙酯。本发明对所述乙酸乙酯的用量没有特殊的限制，实现充分溶解的目的即可。在本发明中，所述洗涤优选包括依次进行的第一洗涤和第二洗涤；所述第一洗涤所用溶剂优选为去离子水，所述第二洗涤所用溶剂优选为饱和食盐水；所述第一洗涤和第二洗涤的次数优选独立地为1～4次。在本发明中，所述干燥的所用干燥剂优选为无水硫酸镁。在本发明中，所述干燥的温度优选为室温。在本发明中，所述干燥的时间优选为(5～15)h，更优选为(6～10)h。本发明对所述抽滤的方式没有特殊的限制，实现固液分离即可。本发明对所述浓缩的方式没有特殊的限制，实现除去溶剂，得到固体的目的即可。在本发明中，所述重结晶所用溶剂优选为无水乙醇。本发明对所述重结晶的方式没有特殊的限制，采用本领域熟知的技术方案即可。

在本发明中，当所述碱性化合物为三乙胺时，所述后处理为将所述磺酰胺化反应的产物依次进行后洗涤、干燥、抽滤、浓缩和柱层析。

在本发明中，所述洗涤优选包括依次进行的第一洗涤和第二洗涤；所述第一洗涤所用溶剂优选为去离子水，所述第二洗涤所用溶剂优选为饱和食盐水；所述第一洗涤和第二洗涤的次数优选独立地为1～4次。在本发明中，所述干燥的所用干燥剂优选为无水硫酸镁。在本发明中，所述干燥的温度优选为室温。在本发明中，所述干燥的时间优选为(5～15)h，更优选为(6～10)h。本发明对所述抽滤的方式没有特殊的限制，实现固液分离即可。本发明对所述浓缩的方式没有特殊的限制，实现除去溶剂，得到固体的目的即可。在本发明中，所述柱层析所用洗脱剂优选为由体积比为2：1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶液。

得到具有式A-5所示结构的化合物后，本发明将所述具有式A-5所示结构的化合物、盐酸羟胺、甲醇和甲醇钠混合进行酰胺化反应，得到具有式I所示结构的化合物。

在本发明中，所述具有式A-5所示结构的化合物、盐酸羟胺和甲醇钠的物质的量之比优选为1mol：(5～30)mol：(5～40)mol，更优选为1mol：(15～25)mol：(20～30)mol。本发明将所述具有式A-5所示结构的化合物、盐酸羟胺和甲醇钠的物质的量之比控制在上述范围内，有利于加快反应速率并提高具有式A-5所示结构的化合物的转化率。

在本发明中，所述具有式A-5所示结构的化合物、盐酸羟胺、甲醇和甲醇钠的混合优选为：首先将部分甲醇和甲醇钠混合，得到甲醇钠的甲醇溶液；将具有式A-5所示结构的化合物、盐酸羟胺和剩余的甲醇混合后，在冰盐浴条件下降温至温度低于0℃后，滴加所述甲醇钠的甲醇溶液，并控制滴加所述甲醇钠的醇溶液过程中反应体系的温度在10℃以下。

在本发明中，所述酰胺化反应的温度优选室温。在本发明中，所述酰胺化反应的时间优选为2～5h，更优选为3～4h。本发明将酰胺化反应的温度和时间控制在上述范围内，有利于提高转化率并减少含羧酸结构的杂质的生成。

酰胺化反应完成后，本发明优选将所述酰胺化反应的产物依次进行减压蒸馏、溶解、洗涤、调pH值、第一抽滤、浆洗、第二抽滤和干燥，得到具有式I所示结构的化合物。

本发明对所述减压蒸馏的方式没有特殊的限制，实现除去残留的甲醇的目的即可。在本发明中，所述溶解所用溶剂优选为水。本发明对所述水的用量没有特殊的限制，实现充分溶解的目的即可。在本发明中，所述洗涤所用溶剂优选为乙酸乙酯；所述洗涤的次数优选为1～4次。在本发明中，所述调pH值优选包括用质量分数为10％的氯化氢溶液调节洗涤完成后得到混合液的pH值为7。在本发明中。本发明对所述第一抽滤的方式没有特殊的限制，实现固液分离即可。在本发明中，所述浆洗所用试剂优选为甲醇。本发明对所述第二抽滤的方式没有特殊的限制，实现固液分离即可。本发明对所述干燥的方式没有特殊的限制，实现除去水分即可。

在本发明中，所述具有式II所示的化学结构的化合物的制备方法包括以下步骤：

1)将具有式C-4所示结构的化合物、固体光气、碱性化合物和有机溶剂混合进行异氰酸酯制备反应，得到第一反应前体；

2)将所述步骤2)得到的第一反应前体、具有式V所示结构的化合物、碱性化合物和有机溶剂混合进行异氰酸酯加成反应，得到具有式C-5所示结构的化合物；

3)将所述步骤2)得到的具有式C-5所示结构的化合物、盐酸羟胺、四氢呋喃、甲醇和甲醇钠混合进行酰胺化反应，得到具有式II所示结构的化合物

本发明将具有式C-4所示结构的化合物、固体光气、碱性化合物和有机溶剂混合进行异氰酸酯制备反应，得到第一反应前体溶液。

在本发明中，所述碱性化合物优选为吡啶、三乙胺和N,N-二异丙基乙胺中一种或多种。在本发明中，所述有机溶剂优选为四氢呋喃、二氧六环和甲基叔丁基醚中一种或多种。

在本发明中，所述具有式C-4所示结构的化合物、固体光气和碱性化合物的物质的量之比优选为1mol：(0.3～1)mol：(1.5～5)mol，更优选为1mol：(0.33～0.5)mol：(2～4)mol。本发明将具有式C-4所示结构的化合物、固体光气和碱性化合物的物质的量之比控制在上述范围内，有利于减少具有式C-4所示结构的化合物自身成脲的副产物的生成。

在本发明中，所述具有式C-4所示结构的化合物、固体光气和碱性化合物和有机溶剂的混合优选为：首先将具有式C-4所示结构的化合物和固体光气分别与有机溶剂混合后，具有式C-4所示结构的化合物溶液和固体光气溶液；将所述固体光气溶液在冷阱中搅拌降温至温度低于-10℃后，滴加具有式C-4所示结构的化合物溶液，并控制滴加具有式C-4所示结构的化合物溶液过程中反应体系的温度不高于0℃。

在本发明中，所述异氰酸酯制备反应优选在冰水浴的条件下进行。本发明将异氰酸酯制备反应在冰水浴的条件下进行，有利于减少具有式C-4所示结构的化合物自身成脲的副产物的生成。在本发明中所述异氰酸酯制备反应的时间优选为30～90min，更优选为40～80min。本发明将异氰酸酯制备反应的时间控制在上述范围内，有利于提高制备所得异氰酸酯的产率和纯度。

得到第一反应前体溶液后，本发明将所述第一反应前体、具有式V所示结构的化合物、碱性化合物和有机溶剂混合进行异氰酸酯加成反应，得到具有式C-5所示结构的化合物。

在本发明中，所述碱性化合物优选为吡啶、三乙胺和N,N-二异丙基乙胺中一种或多种。在本发明中，所述有机溶剂优选为四氢呋喃、二氧六环和甲基叔丁基醚中一种或多种。

在本发明中，所述制备第一反应前体的原料具有式C-4所示结构的化合物的物质的量、具有式V所示结构的化合物的物质的量和碱性化合物的物质的量之比优选为1mol：(0.7～1.3)mol：(1.5～5)mol，更优选为1mol：(0.8～1.0)mol：(1.5～4)mol。本发明将第一反应前体的原料具有式C-4所示结构的化合物的物质的量、具有式V所示结构的化合物的物质的量和碱性化合物的物质的量之比控制在上述范围内，有利于提高具有式V所示结构的化合物的转化率。

本发明对所述第一反应前体、具有式V所示结构的化合物、碱性化合物和有机溶剂的混合没有特殊的限制，实现各组分混合均匀即可。

在本发明中，所述异氰酸酯加成反应的温度优选室温。在本发明中，所述异氰酸酯加成反应的时间优选为3～6h，更优选为3.5～5h。本发明将异氰酸酯加成反应的温度和时间控制在上述范围内，有利于提高具有式V所示结构的化合物的转化率。

异氰酸酯加成反应完成后，本发明优选将所述异氰酸酯加成反应的产物和乙酸乙酯混合后，依次进行洗涤、第一干燥、第一抽滤、浓缩、溶解、第二抽滤和第二干燥，得到具有式C-5所示结构的化合物。

在本发明中，所述洗涤优选包括依次进行的第一洗涤和第二洗涤；所述第一洗涤所用溶剂优选为去离子水，所述第二洗涤所用溶剂优选为饱和食盐水；所述第一洗涤和第二洗涤的次数优选独立地为1～4次。在本发明中，所述第一干燥的所用干燥剂优选为无水硫酸镁。在本发明中，所述第一干燥的温度优选为室温。在本发明中，所述第一干燥的时间没有特殊的限制，实现除去水分即可。本发明对所述第一抽滤的方式没有特殊的限制，实现固液分离即可。本发明对所述浓缩的方式没有特殊的限制，实现除去溶剂，得到固体的目的即可。在本发明中，所述溶解所用溶剂优选为甲醇。本发明对所述甲醇的用量没有特殊的限制，实现充分溶解的目的即可。本发明对所述第二抽滤的方式没有特殊的限制，实现固液分离即可。本发明对所述第二干燥的方式没有特殊的限制，实现除去水分目的即可。

得到具有式C-5所示结构的化合物后，本发明将所述具有式C-5所示结构的化合物、盐酸羟胺、四氢呋喃、甲醇和甲醇钠混合进行酰胺化反应，得到具有式II所示结构的化合物。

在本发明中，所述具有式C-5所示结构的化合物、盐酸羟胺和甲醇钠的物质的量之比优选为1mol：(5～30)mol：(5～40)mol，更优选为1mol：(15～25)mol：(20～30)mol。本发明将具有式C-5所示结构的化合物、盐酸羟胺和甲醇钠的物质的量之比控制在上述范围内，有利于加快反应速率并提高具有式C-5所示结构的化合物的转化率。

在本发明中，所述具有式C-5所示结构的化合物、盐酸羟胺、四氢呋喃、甲醇和甲醇钠混合优选为：首先将质量和体积比为1:4的甲醇钠和甲醇混合，得到甲醇钠的甲醇溶液；将具有式C-5所示结构的化合物、盐酸羟胺、四氢呋喃和甲醇混合后，在冰盐浴的条件下降温至温度低于0℃后，滴加所述甲醇钠的甲醇溶液，并且控制滴加所述甲醇钠的甲醇溶液过程中反应体系的温度在10℃以下。

在本发明中，所述酰胺化反应的温度优选为室温。在本发明中，所述酰胺化反应的时间优选为6～10h，更优选为7～8h。本发明将酰胺化反应反应的温度和时间控制在上述范围内，有利于提高收率并减少含羧酸结构的杂质的生成。

酰胺化反应完成后，本发明优选将所述酰胺化反应的产物依次进行减压蒸馏、溶解、调节pH值、第一抽滤、浆洗、第二抽滤和干燥，得到具有式II所示结构的化合物。

本发明对所述减压蒸馏的方式没有特殊的限制，实现除去残留的甲醇和四氢呋喃的目的即可。在本发明中，所述溶解所用溶剂优选为水。本发明对所述水的用量没有特殊的限制，实现充分溶解的目的即可。在本发明中，所述调pH值优选包括用质量分数为10％的盐酸调节洗涤完成后得到混合液的pH值为7。本发明对所述第一抽滤的方式没有特殊的限制，实现固液分离即可。在本发明中，所述浆洗所用试剂优选为甲醇。本发明对所述第二抽滤的方式没有特殊的限制，实现固液分离即可。本发明对所述干燥的方式没有特殊的限制，实现除去水分即可。

在本发明中，所述具有式III所示的化学结构中X为-O-的化合物的制备方法包括以下步骤：

①将具有式E-5′所示结构的化合物、具有式W所示结构的化合物、乙腈、碳酸钾、碘化钾和四丁基溴化胺混合进行成醚反应，得到具有式E-6′所示结构的化合物；

②将所述步骤①得到的具有式E-6′所示结构的化合物、盐酸羟胺、四氢呋喃、甲醇和甲醇钠混合进行酰胺化反应，得到具有式III所示的化学结构中X为-O-的化合物。

本发明将具有式E-5′所示结构的化合物、具有式W所示结构的化合物、乙腈、碳酸钾、碘化钾和四丁基溴化胺混合进行成醚反应，得到具有式E-6′所示结构的化合物。

在本发明中，所述具有式E-5′所示结构的化合物的物质的量、具有式W所示结构的化合物的物质的量、碳酸钾的物质的量、碘化钾的物质的量和四丁基溴化胺的物质的量之比优选为1mol：(0.5～1.5)mol：(1～4)mol：(0.2～1.5)mol：(0.2～1.5)mol，更优选为1mol：(0.8～1.2)mol：(2～3)mol：(0.3～0.8)mol：(0.3～0.8)mol。本发明将上述原料的比例控制在上述范围内，有利于氯取代的羰基alpha位被酚羟基进攻生成醚，有利于提高具有式E-6′所示结构的化合物的产率。

在本发明中，所述具有式E-5′所示结构的化合物、具有式W所示结构的化合物、乙腈、碳酸钾、碘化钾和四丁基溴化胺的混合优选为：首先将具有式W所示结构的化合物和乙腈混合，得到具有式W所示结构的化合物的乙腈；将所述具有式W所示结构的化合物的乙腈和具有式E-5′所示结构的化合物、碳酸钾、碘化钾和四丁基溴化胺混合。

在本发明中，所述成醚反应的温度优选为50-100℃，更优选为70-80℃。在本发明中，所述成醚反应的时间优选为8～14h，更优选为10～13h。本发明将成醚反应的温度和时间控制在上述范围内，有利于提高E-6′所示结构的化合物的产率并减少酯水解副产物的生成。

成醚反应完成后，本发明优选将成醚反应的产物依次进行第一抽滤、第一洗涤、第一浓缩、溶解、第二洗涤、干燥、第二抽滤、第二浓缩和柱层析，得到具有式E-6′所示结构的化合物。

本发明对所述第一抽滤的方式没有特殊的限制，实现固液分离即可。本发明对所述第一浓缩的方式没有特殊的限制，实现除去溶剂，得到固体的目的即可。在本发明中，所述溶解所用试剂优选为乙酸乙酯。本发明对所述乙酸乙酯的体积没有特殊的限制，实现充分溶解第一抽滤完成后得到的固体的目的即可。在本发明中，所述第二洗涤优选包括依次进行的水洗和饱和食盐水洗；所述水洗和饱和食盐水洗的次数优选独立地为1～4次。在本发明中，所述干燥的所用干燥剂优选为无水硫酸镁。在本发明中，所述干燥的温度优选为室温。本发明对所述干燥的时间没有特殊的限制，实现除去水分目的即可。本发明对所述第二抽滤的方式没有特殊的限制，实现固液分离即可。本发明对所述第二浓缩的方式没有特殊的限制，实现除去溶剂，得到固体的目的即可。在本发明中，所述柱层析所用洗脱剂优选为由体积比为2：1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶液。

得到具有式E-6′所示结构的化合物后，本发明将所述具有式E-6′所示结构的化合物、盐酸羟胺、四氢呋喃、甲醇和甲醇钠混合进行酰胺化反应，得到具有式Ⅲ所示结构中X为-O-的化合物。

在本发明中，所述具有式E-6′所示结构的化合物、盐酸羟胺和甲醇钠的物质的量之比优选为1mol：(5～30)mol：(5～40)mol，更优选为1mol：(15～25)mol：(20～30)mol。本发明将具有式E-6′所示结构的化合物、盐酸羟胺和甲醇钠的物质的量之比控制在上述范围内，有利于加快反应速率并提高具有式E-6′所示结构的化合物的转化率。

在本发明中，所述具有式E-6′所示结构的化合物、盐酸羟胺、四氢呋喃、甲醇和甲醇钠混合优选为：首先将质量和体积比为1:4的甲醇钠和甲醇混合，得到的甲醇钠的甲醇溶液；将具有式E-6′所示结构的化合物、盐酸羟胺、四氢呋喃和甲醇混合后，在冰盐浴的条件下降温至温度低于0℃后，滴加所述甲醇钠的甲醇溶液，并且控制滴加所述甲醇钠的甲醇溶液过程中反应体系的温度在10℃以下。

在本发明中，所述酰胺化反应的温度优选为室温。在本发明中，所述酰胺化反应的时间优选为2～5h，更优选为3～4h。本发明将酰胺化反应的温度和时间控制在上述范围内，有利于提高收率并减少含羧酸结构的杂质的生成。

酰胺化反应完成后，本发明优选将所述酰胺化反应的产物依次进行减压蒸馏、溶解、调节pH值、第一抽滤、浆洗、第二抽滤和干燥，得到具有式Ⅲ所示结构中X为-O-的化合物。

本发明对所述减压蒸馏的方式没有特殊的限制，实现除去残留的甲醇和四氢呋喃的目的即可。在本发明中，所述溶解所用溶剂优选为水。本发明对所述水的用量没有特殊的限制，实现充分溶解的目的即可。在本发明中，所述调pH值优选包括用质量分数为10％的盐酸调节洗涤完成后得到混合液的pH值为7。在本发明中。本发明对所述第一抽滤的方式没有特殊的限制，实现固液分离即可。在本发明中，所述浆洗所用试剂优选为甲醇。本发明对所述第二抽滤的方式没有特殊的限制，实现固液分离即可。本发明对所述干燥的方式没有特殊的限制，实现除去水分即可。

在本发明中，所述具有式III所示的化学结构中X为-S-、-NH-或-CH₂-的化合物的制备方法包括以下步骤：

(a)将具有式E-5所示结构的化合物、氯化亚砜和催化剂混合进行酰氯制备反应，得到第二反应前体；

(b)将所述步骤(a)得到的第二反应前体、具有式V所示结构的化合物、碱性化合物和有机溶剂混合进行缩合反应，得到具有式E-6所示结构的化合物；

(c)将所述步骤(b)得到的具有式E-6所示结构的化合物、盐酸羟胺、醇和甲醇钠混合进行酰胺化反应，得到具有式Ⅲ所示结构中X为-S-、-NH-或-CH₂-的化合物

本发明将具有式E-5所示结构的化合物、氯化亚砜和催化剂混合进行酰氯制备反应，得到第二反应前体。

在本发明中，所述具有式E-5所示结构中X为-NH-的化合物的制备方法优选包括以下步骤:

将具有式E(NH)-1所示结构的化合物、甲醇、乙醛酸、冰乙酸和氰基硼氢化钠混合进行还原胺化反应，得到具有式E-5所示结构中X为-NH-的化合物。

在本发明中，所述具有式E(NH)-1所示结构的化合物、乙醛酸、冰乙酸和氰基硼氢化钠的物质的量之比优选为1mol：(1～8)mol：(1～8)mol：(1～8)mol，更优选为1mol：(2～4)mol：(1～4)mol：(2～4)mol。本发明将有式E(NH)-1所示结构的化合物、乙醛酸、冰乙酸和氰基硼氢化钠的物质的量之比控制在上述范围内，有利于提高具有式E(NH)-1所示结构的化合物的转化率。

在本发明中，所述具有式E(NH)-1所示结构的化合物、甲醇、乙醛酸、冰乙酸和氰基硼氢化钠的混合优选为：将具有式E(NH)-1所示结构的化合物、甲醇、乙醛酸和冰乙酸混合后，再分批加入氰基硼氢化钠。

在本发明中，所述混合优选在搅拌的条件下进行；所述搅拌的时间优选为1～3h。

在本发明中，所述还原胺化反应的温度优选为室温。在本发明中，所述还原胺化反应的时间优选为3～7h，更优选为4～6h。本发明将还原胺化反应的温度和时间控制在上述范围内，有利于提高具有式E(NH)-1所示结构的化合物的转化率。

还原胺化反应完成后，本发明优选将还原胺化反应的产物和乙酸乙酯混合后，依次进行洗涤、干燥、抽滤和浓缩，得到具有式E-5所示结构中X为-NH-的化合物。

本发明对所述乙酸乙酯的用量没有特殊的限制，实现充分溶解还原胺化反应的产物即可。本发明对所述还原胺化反应的产物和乙酸乙酯的混合没有特殊的限制，实现各组分混合均匀即可。

在本发明中，所述洗涤优选包括依次进行的第一洗涤和第二洗涤；所述第一洗涤所用溶剂优选为去离子水，所述第二洗涤所用溶剂优选为饱和食盐水；所述第一洗涤和第二洗涤的次数优选独立地为1～4次在本发明中，所述干燥的所用干燥剂优选为无水硫酸镁。在本发明中，所述干燥的温度优选为室温。本发明对所述干燥的时间没有特殊的限制，实现除去水分即可。本发明对所述抽滤的方式没有特殊的限制，实现固液分离即可。本发明对所述浓缩的方式没有特殊的限制，实现除去溶剂的目的即可。

在本发明酰氯制备反应中，所述催化剂优选为DMF和吡啶中一种或多种。

在本发明中，所述具有式E-5所示结构的化合物的质量、氯化亚砜的和催化剂的体积之比优选为1g：(2～)10ml：(0.1～1)d(滴)，更优选为1g：(3～5)ml：(0.2～0.5)d(滴)。本发明将具有式E-5所示结构的化合物的质量、氯化亚砜和催化剂的体积之比控制在上述范围内，有利于提高所制备酰氯的收率。

在本发明中，所述酰氯制备反应的温度优选为20～100，更优选为60～80。在本发明中，所述酰氯制备反应的时间优选为0.5～4h，更优选为1.5～3h。本发明将酰氯制备反应的温度和时间控制在上述范围内，有利于提高所制备酰氯的收率和纯度。

酰氯制备反应完成后，本发明优选将所述酰氯制备反应的产物减压蒸馏和溶解，得到第二反应前体。

本发明对所述减压蒸馏的方式没有特殊的限制，实现除去残留的二氯亚砜的目的即可。在本发明中，所述溶解所用试剂优选为二氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮中一种或多种。

得到第二反应前体后，本发明将所述第二反应前体、具有式V所示结构的化合物、碱性化合物和有机溶剂混合进行缩合反应，得到具有式E-6所示结构的化合物。

在本发明中，所述碱性化合物优选为三乙胺、吡啶和N,N-二异丙基乙胺中一种或多种。在本发明中，所述有机溶剂优选为四氢呋喃。

在本发明中，所述第二反应前体的原料具有式E-5所示结构的化合物、具有式V所示结构的化合物和碱性化合物的物质的量之比优选为1mol：(0.5～1.5)mol：(1～8)mol，更优选为1mol：(0.8～1.2)mol：(2～4)mol。本发明将第二反应前体的原料具有式E-5所示结构的化合物、具有式V所示结构的化合物和碱性化合物的物质的量之比控制在上述范围内，有利于提高具有式V所示结构的化合物的转化率。

在本发明中，所述第二反应前体、具有式V所示结构的化合物、碱性化合物和有机溶剂的混合优选为将具有式V所示结构的化合物、碱性化合物和有机溶剂混合后，在冷阱中搅拌降温至温度低于0℃后，滴加第二反应前体。

在本发明中，所述缩合反应的温度优选室温。在本发明中，所述缩合反应的时间优选为2～5h，更优选为2.5～4h。本发明将缩合反应的温度和时间控制在上述范围内，有利于提高具有式E-6所示结构的化合物的收率并减少含羧酸结构的杂质的生成。

缩合反应完成后，本发明优选将所述缩合反应的产物和乙酸乙酯混合后，依次进行洗涤、干燥、抽滤、浓缩和柱层析，得到具有式E-6所示结构的化合物。

在本发明中，所述洗涤优选包括依次进行的第一洗涤和第二洗涤；所述第一洗涤所用溶剂优选为去离子水，所述第二洗涤所用溶剂优选为饱和食盐水；所述第一洗涤和第二洗涤的次数优选独立地为1～4次。在本发明中，所述干燥的所用干燥剂优选为无水硫酸镁。本发明对所述抽滤的方式没有特殊的限制，实现固液分离即可。本发明对所述浓缩的方式没有特殊的限制，实现除去溶剂的目的即可。在本发明中，所述柱层析所用洗脱剂优选为由体积比为2：1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶液。

得到具有式E-6所示结构的化合物后，本发明将所述具有式E-6所示结构的化合物、盐酸羟胺、醇和甲醇钠混合进行酰胺化反应，得到具有式Ⅲ所示结构中X为-S-、-NH-或-CH₂-的化合物。

在本发明中，所述具有式E-6所示结构的化合物、盐酸羟胺和甲醇钠的物质的量之比优选为1mol：(5～30)mol：(5～40)mol，更优选为1mol：(15～25)mol：(20～30)mol。本发明将具有式E-6所示结构的化合物、盐酸羟胺和甲醇钠的物质的量之比控制在上述范围内，有利于加快反应速率并提高具有式E-6所示结构的化合物的转化率。

在本发明中，所述具有式E-6所示结构的化合物、盐酸羟胺、四氢呋喃、甲醇和甲醇钠混合优选为：首先将质量和体积比为1:4的甲醇钠和甲醇混合，得到的甲醇钠的甲醇溶液；将具有式E-6所示结构的化合物、盐酸羟胺、四氢呋喃和甲醇混合后，在冰盐浴的条件下降温至温度低于0℃后，滴加所述甲醇钠的甲醇溶液，并且控制滴加所述甲醇钠的甲醇溶液过程中反应体系的温度在10℃以下。

在本发明中，所述酰胺化反应的温度优选为室温。在本发明中，所述酰胺化反应的时间优选为2～5h，更优选为3～4h。本发明将酰胺化反应的温度和时间控制在上述范围内，有利于减少含羧酸结构的杂质的生成。

酰胺化反应完成后，本发明优选将所述酰胺化反应的产物依次进行减压蒸馏、溶解、调节pH值、第一抽滤、浆洗、第二抽滤和干燥，得到具有式Ⅲ所示结构中X为-S-、-NH-或-CH₂-的化合物。

本发明对所述减压蒸馏的方式没有特殊的限制，实现除去残留的甲醇和四氢呋喃的目的即可。在本发明中，所述溶解所用溶剂优选为水。本发明对所述水的用量没有特殊的限制，实现充分溶解的目的即可。在本发明中，所述调pH值优选包括用质量分数为10％的盐酸调节洗涤完成后得到混合液的pH值为7。在本发明中。本发明对所述第一抽滤的方式没有特殊的限制，实现固液分离即可。在本发明中，所述浆洗所用试剂优选为甲醇。本发明对所述第二抽滤的方式没有特殊的限制，实现固液分离即可。本发明对所述干燥的方式没有特殊的限制，实现除去水分即可。

本申请提供的含异羟肟酸结构的化合物的制备方法具有反应条件温和，所用试剂廉价易得，可以有效控制含异羟肟酸结构的化合物中羧酸杂质的含量。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一、(E)-3-(3-氯磺酰基苯基)丙烯酸甲酯(具有式A-4所示结构中R₃为氢原子、-CH＝CH-CO-NH-OH在R₃的对位的化合物)的制备方法

(1)于100mL三口瓶中加入发烟硫酸(25mL)，冰水浴下搅拌降温，温度低于10℃后，滴加苯甲醛(10mL，9.4mmol)，控制温度不高于30℃，滴毕，升温至60℃反应9h，反应完全。将反应液倒入200g碎冰中，用碳酸钙调pH至6，抽滤，滤液用碳酸钠调pH值为8，抽滤，滤液蒸干，残渣中加入无水甲醇(100mL)搅拌，抽滤，滤液蒸干，得3-甲酰基苯磺酸钠，白色固体，12.42g，收率63.3％；

(2)于100mL茄形瓶中，加入所述步骤(1)得到的3-甲酰基苯磺酸钠(5.0g,24.0mmol)，吡啶25mL，哌啶(0.5mL,5.6mmol)，搅拌下加入丙二酸(2.5g,24.0mmol)，升温至回流反应4.5h，反应完全，将反应液倒入10％的稀盐酸冰(100mL)溶液中，搅拌，抽滤，滤饼用水(2×50mL)洗涤，干燥，得(E)-3-(3-磺基苯基)丙烯酸，淡黄色固体，4.5g，收率82.1％。

(3)于100mL茄形瓶中，加入所述步骤(2)得到的(E)-3-(3-磺基苯基)丙烯酸(4.5g,19.7mmol)、氯化亚砜(14mL,0.2mol)，DMF(1d)，升温至回流反应12h，反应完全，得到第一反应混合液；

(4)将所述步骤(3)得到的第一反应混合液减压蒸去氯化亚砜，加入二氯甲烷(50mL)，搅拌溶解，冷阱中降温，温度低于0℃后，滴加无水甲醇(8.1mL,0.2mol)，滴毕，0℃反应4.5h，反应完全。反应液用水(50mL)、饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩得粗品5.0g，柱层析(洗脱剂PE:EA＝8:1)分离纯化，得(E)-3-(3-氯磺酰基苯基)丙烯酸甲酯(所述具有式A-4所示结构中R₃为氢原子、-CH＝CH-CO-NH-OH在R₃的对位的化合物)，白色固体，2.3g，收率44.7％。(E)-3-(3-氯磺酰基苯基)丙烯酸甲酯的¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.17(t,J＝1.9Hz,1H),8.05-8.04(m,1H),7.86(dt,J＝7.8,1.5Hz,1H),7.73(d,J＝16.0Hz,1H),7.67(t,J＝7.9Hz,1H),6.58(d,J＝16.0Hz,1H),3.84(s,3H)。

二、(E)-3-[3-[N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]胺磺酰基]苯基]-N-羟基丙烯酰胺(化合物a1，所述具有式I所示的化学结构中R₁为氯原子、R₂为

R₃为氢原子、-CH＝CH-CO-NH-OH在R₃的对位的化合物的化合物)的制备方法：

(1)于50mL三颈瓶中，加入具有式V所示结构中R₁为氯原子、R₂为

的化合物(0.5g,2.4mmol)、吡啶(10mL)，氩气保护，冰水浴中搅拌，温度低于5℃后，滴加(E)-3-(3-氯磺酰基苯基)丙烯酸甲酯(0.64g,2.4mmol)的吡啶(10mL)溶液，滴毕，室温下反应4h，反应完全，然后减压蒸去大部分吡啶得油状物，加入乙酸乙酯(150mL)，搅拌溶解后，用水(3×125mL)、饱和食盐水(125mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩得粗品1.1g，用无水乙醇(3.5mL)重结晶，得(E)-3-[3-[N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]氨磺酰基]苯基]丙烯酸甲酯(具有式A-5所示结构中R₁为氯原子、R₂为

R₃为氢原子、-CH＝CH-CO-OCH₃在R₃的对位的化合物的化合物)，0.59g，收率56.7％。

(2)于50mL三颈瓶中，将所述步骤(1)得到(E)-3-[3-[N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]氨磺酰基]苯基]丙烯酸甲酯(0.3g,0.7mmol)、甲醇(6mL)、盐酸羟胺(1g,14.0mmol)，冰盐浴下降温，温度低于0℃后，滴加甲醇钠甲醇溶液(3.8mL,17.5mmol,25％w/v)，控制温度在10℃以下，滴毕室温反应3.5h，反应完全，然后减压蒸去甲醇，加入水(10mL)，搅拌溶解后，用乙酸乙酯(3×15mL)洗涤，再用10％稀盐酸调pH至7，析出固体，抽滤，滤饼用甲醇(3mL)浆洗，抽滤，干燥，得(E)-3-[3-[N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]胺磺酰基]苯基]-N-羟基丙烯酰胺(化合物a1，所述具有式I所示的化学结构中R₁为氯原子、R₂为

R₃为氢原子、-CH＝CH-CO-NH-OH在R₃的对位的化合物)

实施例2

按照实施例1的方法制备化合物a2；

与实施例1不同的是，原料替换为与化合物a2对应的化合物。

实施例3

一、具有式A-4所示结构中R₃为氢原子、-CH＝CH-CO-OCH₃在R₃的间位的化合物的制备方法

(1)于100mL三颈瓶中，加入氯磺酸(35mL,540mmol)，冰盐浴下搅拌降温，温度低于-5℃后，分批加入肉桂酸(具有式A-1′所示结构中R₃为氢原子的化合物)(10g,67.5mmol)，控制温度不高于-5℃，加完后缓慢升至室温搅拌，20min后，升温50℃反应2h后，反应完全，将降温至室温的反应液倾入300mL碎冰中，析出固体，抽滤，滤饼水洗至中性，滤饼用1500mL EA溶解，饱和食盐水洗一次，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩，得(E)-3-[4-(氯磺酰基)苯基]丙烯酸(具有式A-2′所示结构中R₃为氢原子的化合物)，白色固体，13.57g，收率81.5％。

(2)于250mL茄形瓶中，加入所在步骤(1)得到的(E)-3-[4-(氯磺酰基)苯基]丙烯酸(13.57g,55mmol)、二氯甲烷(50mL)、氯化亚砜(40mL,0.55mol)、DMF(1d)，升温至回流反应2.5h，得到第一中间体；

(3)将所述步骤(2)得到的第一中间体减压浓缩得到黄色固体，用干燥二氯甲烷(70mL)溶解，氩气保护，置于冷阱中降温，温度低于0℃后，滴加无水甲醇(22mL,0.55mol)，滴完后在0℃搅拌反应2h，反应完全，然后将向降温至室温的反应液中用水(50mL)、饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩得粗品12.41g，用乙酸乙酯(11mL)重结晶，得(E)-3-[4-(氯磺酰基)苯基]丙烯酸甲酯(具有式A-4所示结构中R₃为氢原子、-CH＝CH-CO-OCH₃在R₃的间位的化合物)，类白色固体，3.1g，收率21.3％，m.p.115-118℃；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.06(d,J＝8.6Hz,2H),7.76-7.70(m,3H),6.59(d,J＝16.0Hz,1H),3.85(s,3H)。

二、(E)-3-[4-[N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]胺磺酰基]苯基]-N-羟基丙烯酰胺(化合物a3，所述具有式I所示的化学结构中R₁为氯原子、R₂为

R₃为氢原子、-CH＝CH-CO-NH-OH在R₃的间位的化合物的化合物)的制备

(1)于100mL三颈瓶中，加入具有式V所示结构中R₁为氯原子、R₂为

的化合物(0.39g,1.9mmol)、二氯甲烷(20mL)、三乙胺(0.5mL,6.8mmol)，冰水浴中搅拌降温，温度低于5℃后，滴加(E)-3-[4-(氯磺酰基)苯基]丙烯酸甲酯(具有式A-4所示结构中R₃为氢原子、-CH＝CH-CO-OCH₃在R₃的间位的化合物)(0.5g,1.9mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液，滴毕，室温下反应4h，反应完全。反应液用水(3×50mL)、饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩得粗品0.83g，柱层析纯化(洗脱剂PE:EA＝2:1)，得(E)-3-[4-[N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]氨磺酰基]苯基]丙烯酸甲酯(具有式A-5所示结构中R₁为氯原子、R₂为

R₃为氢原子、-CH＝CH-CO-OCH₃在R₃的间位的化合物)，白色固体，0.47g，收率57.81％。

(2)于50mL三颈瓶中，加入(E)-3-[4-[N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]氨磺酰基]苯基]丙烯酸甲酯(0.3g,0.7mmol)、甲醇(6mL)、盐酸羟胺(1g,14.0mmol)，冰盐浴下降温，温度低于0℃后，滴加甲醇钠甲醇溶液(3.8mL,17.5mmol,25％w/v)，控制温度在10℃以下，滴毕室温反应3.5h，反应完全，将降温至室温的反应液减压蒸去甲醇，加水(10mL)，搅拌溶解后，用乙酸乙酯(3×15mL)洗涤，再用10％稀盐酸调pH至7，析出固体，抽滤，滤饼用甲醇(3mL)浆洗，抽滤，干燥，得(E)-3-[4-[N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]胺磺酰基]苯基]-N-羟基丙烯酰胺(a3，所述具有式I所示的化学结构中R₁为氯原子、R₂为

R₃为氢原子、-CH＝CH-CO-NH-OH在R₃的间位的化合物)，淡粉色固体，0.08g，收率26.7％。

实施例4

按照实施例3的方法制备化合物a4；

与实施例1不同的是，原料替换为与化合物a4对应的化合物。

实施例5

按照实施例1的方法制备化合物a5；

与实施例1不同的是，原料替换为与化合物a5对应的化合物。

实施例6

按照实施例1的方法制备化合物a6；

与实施例1不同的是，原料替换为与化合物a6对应的化合物。

实施例7

按照实施例1的方法制备化合物a7；

与实施例1不同的是，原料替换为与化合物a7对应的化合物。

实施例8

按照实施例1的方法制备化合物a8；

与实施例1不同的是，原料替换为与化合物a8对应的化合物。

实施例9

按照实施例13的方法制备化合物c1；

与实施例13不同的是，原料替换为与化合物c1对应的化合物。

实施例10

按照实施例13的方法制备化合物c2；

与实施例13不同的是，原料替换为与化合物c2对应的化合物。

实施例11

按照实施例13的方法制备化合物c3；

与实施例13不同的是，原料替换为与化合物c3对应的化合物。

实施例12

按照实施例13的方法制备化合物c4；

与实施例13不同的是，原料替换为与化合物c4对应的化合物。

实施例13

一、具有式C-4所示结构中R₃为氯原子的化合物的制备方法

(1)于100mL茄形瓶中，加入吡啶(37mL)，搅拌下加入丙二酸(7.8g,76.8mmol)、哌啶(0.7mL,6.6mmol)、4-氯-3-硝基苯甲醛(具有式C-1所示结构中R₃为氯原子、醛基在R₃的对位的化合物，11.4g,61.5mmol)，加完升温至回流反应2.5h，反应完全，然后将向降温至室温的反应液倒入10％的稀盐酸(200mL)冰溶液中，搅拌，抽滤，滤饼用水(2×100mL)洗涤，干燥，得4-氯-3-硝基苯丙烯酸，淡黄色固体，11.5g，收率82.1％。

(2)于100mL茄形瓶中，加入所述步骤(1)得到的4-氯-3-硝基苯丙烯酸(3g,19.7mmol)、甲醇(60mL)、浓硫酸(0.5mL)，升温至回流，反应8h，反应完全，然后将反应液倒入10％的碳酸钠水溶液(180mL)中，搅拌，抽滤，滤饼用水(2×50mL)洗涤，干燥，得4-氯-3-硝基苯丙烯酸甲酯，白色固体，2.7g，收率84.9％。

(3)于100mL三颈瓶中，加入还原铁粉(1.7g,30.4mmol)、氯化铵(1.6g,30.4mmol)、水(20mL)，开动机械搅拌，升温到90℃搅拌20min，降温，温度低于60℃后，加入甲醇(20mL)，所述步骤(2)得到的4-氯-3-硝基苯丙烯酸甲酯(2g,8.7mmol)，加完，70℃反应2h，反应完全，然后向降温至室温的反应液中加入乙酸乙酯(50mL)，饱和碳酸钠水溶液(5mL)，搅拌，抽滤，滤饼用乙酸乙酯(2×20mL)洗涤，取滤液，分出有机相，饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩，得4-氯-3-氨基苯丙烯酸甲酯(具有式C-4所示结构中R₃为氯原子、-CH＝CH-CO-OCH₃在R₃的对位的化合物)，淡黄色固体，1.4g，收率80.0％。

二、(E)-3-[4氯-3-[3-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]脲基]苯基]-N-羟基丙烯酰胺(化合物c5，具有式II所示的化学结构中R₁为氯原子、R₂为

R₃为氯原子、-CH＝CH-CO-NH-OH在R₃的对位的化合物)的制备方法

1)于50mL三颈瓶中，加入固体光气(0.2g,0.66mmol)和四氢呋喃(5mL)，冷阱中搅拌降温，温度低于-10℃后，滴加4-氯-3-氨基苯丙烯酸甲酯(0.37g,1.76mmol)和吡啶(0.17mL,3mmol)的四氢呋喃(5mL)溶液，滴加时控制温度不高于0℃，加完冰水浴中反应1h，得到第一反应前体；

2)向所述步骤1)得到的第一反应前体中，加入具有式V所示结构中R₁为氯原子、R₂为

的化合物(0.3g,1.5mmol)和吡啶(0.3mL,3.8mmol)的四氢呋喃(5mL)溶液，加完缓慢升温到室温反应6h，反应完全，向降温至室温的反应液中加入乙酸乙酯(50mL)，用水(3×50mL)和饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩得粗品0.45g。加入甲醇(10mL)，搅拌30min,抽滤。滤饼干燥，得(E)-3-[4氯-3-[3-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]脲基]苯基]丙烯酸甲酯(具有式C-5所示结构中R₁为氯原子、R₂为

R₃为氯原子、-CH＝CH-CO-OCH₃在R₃的对位的化合物)，白色固体，0.22g，收率37.3％。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ9.68(s,1H),8.71(d,J＝4.4Hz,1H),8.42(s,1H),8.40(d,J＝2.1Hz,1H),7.92(td,J＝7.7,1.9Hz,1H),7.83(d,J＝2.5Hz,1H),7.68(d,J＝7.9Hz,1H),7.62(d,J＝16.0Hz,1H),7.53(d,J＝8.4Hz,1H),7.51–7.46(m,2H),7.46–7.42(m,2H),6.57(d,J＝16.0Hz,1H),3.73(s,3H)。

3)于50mL三颈瓶中，将所述步骤2)得到的(E)-3-[4氯-3-[3-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]脲基]苯基]丙烯酸甲酯(0.22g,0.49mmol)、甲醇(4mL)、四氢呋喃(1mL)和盐酸羟胺(0.68g,9.81mmol)混合，冰盐浴降温，温度低于0℃后，滴加甲醇钠甲醇溶液(2.65mL,12.3mmol,25％w/v)，控制温度在10℃以下，滴毕，升温到室温反应8.5h，反应完全，将降温至室温的反应液减压蒸去甲醇和四氢呋喃，加入水(10mL)，用10％稀盐酸调pH至7，析出固体，抽滤，滤饼用甲醇(3mL)浆洗，抽滤，干燥，得(E)-3-[4氯-3-[3-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]脲基]苯基]-N-羟基丙烯酰胺(化合物c5，具有式II所示的化学结构中R₁为氯原子、R₂为

R₃为氯原子、-CH＝CH-CO-NH-OH在R₃的对位的化合物)，近白色固体，0.10g，收率45.5％。

实施例14

按照实施例13的方法制备化合物c6；

与实施例13不同的是，原料替换为与化合物c6对应的化合物。

实施例15

按照实施例13的方法制备化合物c7；

与实施例13不同的是，原料替换为与化合物c7对应的化合物。

实施例16

按照实施例13的方法制备化合物c8；

与实施例13不同的是，原料替换为与化合物c8对应的化合物。

实施例17

按照实施例18的方法制备化合物e1；

与实施例18不同的是，原料替换为与化合物e1对应的化合物。

实施例18

一、具有式E-5′所示结构中R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-OCH₃在R₄的对位的化合物的制备方法

(1)100mL茄形瓶中，加入吡啶(15mL)，搅拌下加入丙二酸(5.1g,50mmol)，再加入哌啶(0.4mL,4mmol)、间羟基苯甲醛(具有式E-1′所示结构中R₄为氢原子的化合物，5g，40mmol)，加完升温至回流反应5h，反应完全。将反应液倒入10％的稀盐酸(75mL)冰溶液中，搅拌，抽滤，滤饼用水(2×50mL)洗涤，干燥，得间羟基苯丙烯酸(具有式E-2′所示结构中R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-OH在R₄的对位的化合物)，淡黄色固体，5.9g，收率88.1％；

(2)于100mL茄形瓶中，加入所述步骤(1)得到的间羟基苯丙烯酸(5.9g,36.0mmol)、甲醇(60mL)、浓硫酸(0.5mL)，升温至回流反应6h后，常压蒸去大部分甲醇，反应完全，然后将降温至室温的反应液倒入10％的碳酸钠水溶液(180mL)中，搅拌，抽滤，滤饼用水(2×50mL)洗涤，干燥，得间羟基苯丙烯酸甲酯(具有式E-5′所示结构中R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-OCH₃在R₄的对位的化合物),白色固体，6.1g，收率95.3％。m.p.76-79℃。

二、(E)-3-[3-[2-[N-[4-氯-3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)苯基]氨基]-2-氧代乙氧基]苯基]-N-羟基丙烯酰胺(化合物e2，具有式III所示的化学结构中X为-O-、R₁为氯原子、R₂为

R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-NH-OH在R₄的对位的化合物)的制备方法

①于100mL茄形瓶中，加入具有式W所示结构中R₁为氯原子、R₂为

的化合物(0.3g,0.94mmol)、乙腈(40mL)，搅拌溶解后，加入碳酸钾(0.26g,1.88mmol)，碘化钾(0.08g,0.47mmol)，四丁基溴化胺(0.15g,0.47mmol)、间羟基苯丙烯酸甲酯(0.17g,0.94mmol)，升温至回流反应12h，反应完全。抽滤，滤饼用乙酸乙酯(10mL)洗涤，滤液浓缩，所得固体用乙酸乙酯(100mL)溶解，再用水(3×100mL)、饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩，得粗品0.41g。柱层析分离纯化(PE:EA＝2:1洗脱)，得(E)-3-[3-[2-[N-[4-氯-3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)苯基]氨基]-2-氧代乙氧基]苯基]丙烯酸甲酯(具有式E-6′所示结构中R₁为氯原子、R₂为

R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-OCH₃在R₄的对位的化合物)，白色固体，0.16g，收率40.0％。m.p.186-188℃；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.73(s,1H),8.32(d,J＝2.7Hz,1H),8.20(d,J＝8.6Hz,1H),7.72-7.71(m,2H),7.66(d,J＝15.9Hz,1H),7.46(d,J＝8.5Hz,1H),7.40–7.33(m,3H),7.22(d,J＝7.7Hz,1H),7.19-7.18(m,1H),7.04(d,J＝8.2Hz,1H),6.47(d,J＝16.0Hz,1H),4.64(s,2H),3.82(s,3H)；MS(ESI)m/z:462.0[M+H]⁺,464.0[M+H]⁺。

②于50mL三颈瓶中，加入所述步骤①得到的(E)-3-[3-[2-[N-[4-氯-3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)苯基]氨基]-2-氧代乙氧基]苯基]丙烯酸甲酯(0.16g,0.35mmol)、甲醇(5mL)、四氢呋喃(1mL)、盐酸羟胺(0.48g,6.94mmol)，冰盐浴下降温，温度低于0℃后，滴加甲醇钠甲醇溶液(1.9mL,8.68mmol,25％w/v)，控制温度在10℃以下，滴毕室温反应3.5h，反应完全，然后将反应液减压蒸去甲醇，加入水(10mL)，用10％稀盐酸调pH至7，析出固体，抽滤，滤饼用甲醇(3mL)浆洗，抽滤，干燥，得(E)-3-[3-[2-[N-[4-氯-3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)苯基]氨基]-2-氧代乙氧基]苯基]-N-羟基丙烯酰胺(化合物e2，具有式III所示的化学结构中R₁为氯原子、R₂为

R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-OCH₃在R₄的对位、X为-O-的化合物)，白色固体，0.08g，收率50.1％。

实施例19

按照实施例18的方法制备化合物e3；

与实施例18不同的是，原料替换为与化合物e3对应的化合物。

实施例20

按照实施例18的方法制备化合物e4；

与实施例18不同的是，原料替换为与化合物e4对应的化合物。

实施例21

按照实施例18的方法制备化合物e5；

与实施例18不同的是，原料替换为与化合物e5对应的化合物。

实施例22

按照实施例18的方法制备化合物e6；

与实施例18不同的是，原料替换为与化合物e6对应的化合物。

实施例23

按照实施例18的方法制备化合物e7；

与实施例18不同的是，原料替换为与化合物e7对应的化合物。

实施例24

按照实施例18的方法制备化合物e8；

与实施例18不同的是，原料替换为与化合物e8对应的化合物。

实施例25

一、具有式E-5所示结构中R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-OCH₃在R₄的间位、X为或-S-的化合物的制备方法

(1)于50mL三颈瓶中，加入对氨基苯硫酚(具有式E(S)-1所示结构中R₄为氢原子的化合物，5.0g,38.8mmol)，重蒸四氢呋喃(20mL)，搅拌溶解，冰水浴下降温，温度低于5℃后，分批加入氢化钠(1.7g,42.6mmol,65％)，控制温度不高于20℃，加完，室温下搅拌30min，滴加氯乙酸甲酯(3.7mL,42.6mmol)，滴毕，室温下反应2h，反应完全，将降温至室温的反应液倒入冰水(50mL)中，加入乙酸乙酯(50mL)，分出有机相，用10％稀盐酸(3×50mL)萃取，合并盐酸相，用饱和碳酸钠水溶液调pH到8，再用乙酸乙酯(3×50mL)萃取，合并乙酸乙酯，用饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩，得2-[(4-氨基苯基)硫代]乙酸甲酯，6.5g，收率82.5％。MS(ESI)m/z:198[M+H]⁺。

(2)于100mL三颈瓶中，加入所述步骤(1)得到的2-[(4-氨基苯基)硫代]乙酸甲酯(6.5g，33.0mmol)，开动机械搅拌，再加入浓盐酸(30mL)和水(30mL)，并将反应体系置于冷阱中搅拌降温，温度低于-10℃后，将亚硝酸钠(2.5g，36.3mmol)的水溶液(5mL)滴加到反应体系，温度保持在-10-0℃之间。滴毕，低温下搅拌30min，得到重氮盐溶液；

(3)于100mL三颈瓶中，加入碘化钾(8.2g,49.5mmol)、水(30mL)、乙酸乙酯(60mL)，室温搅拌，滴加所述步骤(2)得到的重氮盐溶液，滴毕，室温反应3h，反应完全。将反应液倒入乙酸乙酯(200mL)中，用水100mL，40％亚硫酸氢钠水溶液(2×100mL)和饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩得2-[(4-碘苯基)硫代]乙酸甲酯，淡黄色固体，6.8g，收率66.9％。

(4)于100mL三颈瓶中，加入所述步骤(3)得到的2-[(4-碘苯基)硫代]乙酸甲酯(6.8g,22.1mmol)、乙醇(30mL)、30％NaOH水溶液(15mL)，升温至回流反应3h，反应完全，向降温至室温的反应液中加入乙酸乙酯(100mL)，用水(3×50mL)萃取，合并水层，用10％稀盐酸调pH到2，再用乙酸乙酯(3×50mL)萃取，合并有乙酸乙酯，用饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩得淡黄色固体。柱层析分离纯化(PE:EA＝5:1+0.5％AcOH洗脱)，得2-[(4-碘苯基)硫代]乙酸，近白色固体，3.2g，收率50.1％。MS(ESI)m/z:292.9[M-H]^-。

(5)于100mL水热合成反应釜，加入所述步骤(4)得到的2-[(4-碘苯基)硫代]乙酸(1g,3.4mmol)、乙酸钯(0.04g,0.2mmol)、乙腈(20mL)、三乙胺(3.7mL,27.2mmol)、丙烯酸甲酯(1.2mL,13.6mmol)，密封，升温到140℃反应10h，反应完全。将反应液倒入乙酸乙酯(100mL)中，用10％稀盐酸调pH至2，抽滤，取滤液，用水(2×100mL)、饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩得(E)-2[[4-(3-甲氧基-3-氧代-1-烯-1-基)苯基]硫代]乙酸(具有式E-5所示结构中R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-OCH₃在R₄的间位、X为或-S-的化合物)，淡黄色固体，0.73g，收率85.9％。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ12.79(s,1H),7.67(d,J＝8.4Hz,2H),7.62(d,J＝16.1Hz,1H),7.34(d,J＝8.4Hz,2H),6.61(d,J＝16.0Hz,1H),3.89(s,2H),3.72(s,3H)。

二、(E)-3-[4-[2-[N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]氨基]-2-氧代乙硫基]苯基]-N-羟基丙烯酰胺(化合物e9，具有式III所示的化学结构中R₁为氯原子、R₂为

R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-NHOH在R₄的间位、X为或-S-的化合物)的制备方法

(a)于50mL茄形瓶中，加入上述方法制备的(E)-2[[4-(3-甲氧基-3-氧代-1-烯-1-基)苯基]硫代]乙酸(0.3g,1.2mmol)、氯化亚砜(6mL,82.6mmol)、DMF(1d)，升温到回流反应2h，减压蒸去二氯亚砜，加入二氯甲烷(10mL)备用，得到第二反应前体。

(b)于50mL三颈瓶中，加入具有式V所示结构中R₁为氯原子、R₂为

的化合物(0.24g,1.2mmol)、四氢呋喃(10mL)、三乙胺(0.41mL,3.0mmol)，搅拌溶解后，置于冷阱中降温，温度低于0℃后，滴加所述(1)得到的第二反应前体，滴毕，缓慢升温到室温，反应3.5h，反应完全，向降温至室温的反应液中加入乙酸乙酯(100mL)，用水(2×50mL)、饱和食盐水50mL洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩得粗品0.55g，柱层析分离纯化(洗脱剂PE:EA＝2:1)，得(E)-3-[4-[2-[N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]氨基]-2-氧代乙硫基]苯基]丙烯酸甲酯(具有式E-6所示结构中R₁为氯原子、R₂为

R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-OCH₃在R₄的间位、X为或-S-的化合物)，白色固体，0.33g，收率63.5％。

(c)于50mL三颈瓶中，加入所述步骤(b)得到的(E)-3-[4-[2-[N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]氨基]-2-氧代乙硫基]苯基]丙烯酸甲酯(0.33g,0.76mmol)、甲醇(6mL)、盐酸羟胺(1.1g,15.3mmol)，冰盐浴降温，温度低于0℃后，滴加甲醇钠甲醇溶液(4.1mL,19.1mmol,25％w/v)，控制温度低于10℃，滴毕室温反应3.5h，反应完全，将反应液蒸去甲醇，加入水(10mL)，用10％稀盐酸调pH至7，析出固体，抽滤，滤饼用甲醇(3mL)浆洗，抽滤，干燥，得(E)-3-[4-[2-[N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]氨基]-2-氧代乙硫基]苯基]-N-羟基丙烯酰胺(化合物e9，具有式III所示的化学结构中R₁为氯原子、R₂为

R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-NHOH在R₄的间位、X为或-S-的化合物)，粉红色固体，0.03g，收率9.1％。

实施例26

按照实施例25的方法制备化合物e10；

与实施例25不同的是，原料替换为与化合物e10对应的化合物。

实施例27

一、所述具有式E-5所示结构中R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-OCH₃在R₄的间位、X为-CH₂-的化合物的制备方法

(1)以对硝基苯甲醛为原料，按照上述具有式C-4所示结构的化合物的制备方法，制备得到对氨基苯丙烯酸甲酯(具有式E(CH)-2所示结构的化合物)。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ7.60(d,J＝15.9Hz,1H),7.35(d,J＝8.2Hz,2H),6.65(d,J＝8.2Hz,2H),6.25(s,1H),3.94(s,2H),3.78(s,3H)；MS(ESI)m/z:178.2[M+H]⁺,200.1[M+Na]⁺；

(2)于100mL茄形瓶中，加入将所述步骤(1)得到的对氨基苯丙烯酸甲酯(3g,16.9mmol)、钯碳(0.3g,5％)、无水乙醇(30mL)，氩气置换，充氢气，室温反应4h，反应完全，将降温至室温的反应液抽滤，滤液蒸干，得对氨基苯丙酸甲酯，白色固体，3g，收率99.0％；

(3)于100mL三颈瓶中，加入所述步骤(2)得到的对氨基苯丙酸甲酯(3g，16.7mmol)，开动机械搅拌，再加入浓盐酸(15mL)和水(15mL)，将反应体系置于冷阱中搅拌降温，温度低于-10℃后，将亚硝酸钠(1.3g，18.6mmol)的水溶液(2mL)滴加到反应体系，温度保持在-10-0℃之间。滴毕，低温度下搅拌30min，得到重氮盐溶液；

(4)100mL三颈瓶中，加入碘化钾(4.2g,25.4mmol)、水(10mL)、乙酸乙酯(20mL)，室温下搅拌，滴加所述步骤(3)得到的重氮盐溶液，滴毕，室温反应3h，反应完全。将反应液倒入乙酸乙酯(100mL)中，用水(50mL)、40％亚硫酸氢钠水溶液(2×50mL)和饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩得对碘苯丙酸甲酯，淡黄色固体，3.2g，收率65.8％。

(5)于100mL三颈瓶中，加入所述步骤(4)得到的对碘苯丙酸甲酯(3.2g,22.1mmol)、甲醇(15mL)、30％NaOH水溶液(15mL)，升温至回流反应5h，反应完全，向降温至室温的反应液中加入水(100mL)，用乙酸乙酯水(2×50mL)洗涤，水相用10％稀盐酸调pH到2，析出固体，抽滤，干燥得黄色固体。柱层析分离纯化(PE:EA＝20:1+0.5％AcOH洗脱)，得对碘苯丙酸，近白色固体，1.7g，收率56.7％。MS(ESI)m/z:274.5[M-H]

(6)于100mL水热合成反应釜，加入所述步骤(5)得到的对碘苯丙酸(1g,3.6mmol)、乙酸钯(0.04g,0.2mmol)、乙腈(20mL)、三乙胺(4.0mL,29.0mmol)、丙烯酸甲酯(1.3mL,14.5mmol)，密封，升温到140℃反应10h，反应完全。将反应液倒入乙酸乙酯(100mL)中，用10％稀盐酸调pH至2，抽滤，取滤液，用水(2×100mL)、饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩得(E)-3-[4-(3-甲氧基-3-氧代-1-烯-1-基)苯基]丙酸(具有式E-5所示结构中R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-OCH₃在R₄的间位、X为-CH₂-的化合物)，淡黄色固体，0.76g，收率89.4％。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ7.67(d,J＝16.0Hz,1H),7.46(d,J＝8.0Hz,2H),7.24(d,J＝7.9Hz,2H),6.41(d,J＝16.1Hz,1H),3.80(s,3H),2.98(t,J＝7.7Hz,2H),2.70(t,J＝7.7Hz,2H)。

二、(E)-3-[4-[1-[N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]氨基]-1-氧丙基-3-基]苯基]-N-羟基丙烯酰胺(化合物e11，具有式III所示的化学结构中R₁为氯原子、R₂为

R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-NHOH在R₄的间位、X为-CH₂-的化合物)的制备方法

以上述方法制备的(E)-3-[4-(3-甲氧基-3-氧代-1-烯-1-基)苯基]丙酸和具有式V所示结构中R₁为氯原子、R₂为

的化合物为原料，使用化合物e9合成的类似方法，经缩合和氨解得(E)-3-[4-[1-[N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]氨基]-1-氧丙基-3-基]苯基]-N-羟基丙烯酰胺(e11，具有式III所示的化学结构中R₁为氯原子、R₂为

R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-NHOH在R₄的间位、X为-CH₂-的化合物)，近白色固体，0.13g。

实施例28

按照实施例27的方法制备化合物e12；

与实施例27不同的是，原料替换为与化合物e12对应的化合物。

实施例29

一、具有式E-5所示结构中R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-OCH₃在R₄的间位、X为-NH-的化合物的制备方法

于50mL三颈瓶中，加入对氨基苯丙烯酸甲酯(具有式E(NH)-1所示结构的化合物，0.5g,2.8mmol)、甲醇(10mL)、乙醛酸(0.4g,5.6mmol)、冰乙酸(0.17mL,2.8mmol)，室温下搅拌1.5h。再分批加入氰基硼氢化钠(0.5g,8.5mmol)，加完室温下反应5h，反应完全。将反应液倒入乙酸乙酯(100mL)中，用水(2×100mL)、饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，浓缩得固体0.61g。柱层析分离纯化(PE:EA＝4:1+0.5％AcOH洗脱)，得(E)-N-[4-(3-甲氧基-3-氧代-1-烯-1-基)苯基]甘氨酸(具有式E-5所示结构中R₄为氢原子、X为-NH-的化合物)，淡黄色固体，0.32g，收率48.5％。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ12.68(s,1H),7.51(d,J＝15.8Hz,1H),7.44(d,J＝8.4Hz,2H),6.58-6.54(m,3H),6.27(d,J＝15.8Hz,1H),3.86(s,2H),3.67(s,3H)；MS(ESI)m/z:236.4[M+H]⁺,234.2[M-H]^-。

二、(E)-3-[4-[1-[N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]氨基]-1-氧丙基-3-基]苯基]-N-羟基丙烯酰胺(化合物e13，所述具有式III所示的化学结构中R₁为氯原子、R₂为

R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-NHOH在R₄的间位、X为-NH-的化合物)的制备方法

以(E)-N-[4-(3-甲氧基-3-氧代-1-烯-1-基)苯基]甘氨酸和具有式V所示结构中R₁为氯原子、R₂为

的化合物为原料，使用化合物e9合成的类似方法，经缩合和氨解得(E)-3-[4-[N-[2-[N-[4-氯-3-(吡啶-2-基)苯基]氨基]-2-氧乙基]氨基]苯基]-N-羟丙烯酰胺(化合物e13，所述具有式III所示的化学结构中R₁为氯原子、R₂为

R₄为氢原子、-CH＝CH-CO-NHOH在R₄的间位、X为-NH-的化合物)，黄色固体，0.04g。

实施例30

按照实施例29的方法制备化合物e13；

与实施例27不同的是，原料替换为与化合物e13对应的化合物。

表1实施例1～30制备的各化合物的结构和检测的核磁氢谱、碳谱和质谱数据统计

由表1可知，本申请成功制备得到了具有异羟肟酸结构的化合物。

检测一、HDAC抑制活性检测

检测方法：

(1)将密度达到80％以上的A549细胞用细胞刮处理，1500r/min，5min离心，弃去培养液，加1×PBS体积2mL重悬细胞，1500r/min，5min再次离心，弃去上清，加RIPA裂解液(含蛋白酶混合抑制剂和磷酸酶混合抑制剂)，转移至1.5mLEP管中，使用超声破碎仪进行细胞裂解，冰浴30min后置于4℃离心机中，12000g，15min离心，取上清即活性的蛋白样品)。

(2)用BCA法测定所述步骤(1)得到的活性的蛋白样品浓度，分别设置空白组(只加85μL/孔的ddH₂O)；阳性对照组(2μL/孔HeLa核提取物稀释到83μL/孔的ddH₂O中)；阴性对照组(加2μL/孔的曲古抑菌素A(TSA))；加药组(分别用ddH₂O稀释实施例()制备的化合物至终浓度10μM，加入10-50μg待测的活性蛋白样品，终体积达到85μL)/孔；室温条件下每孔加10×HDAC分析缓冲液10μL；向每孔加入5μL HDAC荧光底物，尽可能混匀，并放置于培养箱中37℃孵育30min。加赖氨酸显色剂10μL/孔，混匀充分后，置于37℃培养箱中孵育30min，终止反应，然后利用多功能酶标仪读取荧光板上的值(Ex/Em＝350-380/440-460)，此信号值在室温室温下可维持几个小时，HDAC的活性表示为每微克蛋白样品相对荧光单位，具体结果见表2。

表2实施例制备的化合物在浓度为10μM时，对HDAC的抑制率(％)

由表2可知，本发明提供的具有异羟肟酸结构的化合物，在浓度为10μM时，对HDAC的抑制率高达93.43％。

检测二、A549非小细胞肺癌细胞增殖抑制检测

检测方法：

(1)将实施例制备的化合物配制成浓度为10μmol/L，调整对数生长期的细胞到适当密度，然后接种于96孔板中，每孔加入含10％血清的培养液100μl，培养于37℃，5％CO₂的培养箱内，过夜加药，作用72h，设置空白组和给药组，并且每组设置3-4个复孔；

(2)药物作用72h后，避光加0.25mg/ml MTT(10ul/孔)，在37℃下孵育3-5h，弃去培养液，每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，溶解后使用酶标仪测定在492nm处的OD值。设空白组OD值为100％，按如下公式计算各组细胞抑制率，具体结果见表3。

表3实施例1、3、5和7制备的化合物在浓度为10μM时，对A549非小细胞肺癌细胞增殖的抑制率(％)

由表3可知，本发明提供的具有异羟肟酸结构的化合物，在浓度为5μM时，下调刺猬信号通路转录因子Gli1的表达可达到-87.10％，表现出对刺猬信号通路的活性有较强的抑制作用，

检测三、Hh信号通路抑制活性评价

检测方法：

(1)A549细胞用RPMI1640培养液进行培养，常规加入10％胎牛血清，在5％CO₂的37℃培养箱中传代培养。培养细胞A549，倒出培养液，用1×PBS清洗一次；每10cm²生长的培养细胞中加入1ml的Trizol试剂，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落；将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。将上述取得的Trizol裂解液转移到EP管中，室温(15～30℃)下放置5分钟；然后加入氯仿(0.2ml/1ml Trizol液)，剧烈摇荡离心管15秒。室温下(15～30℃)放置3分钟后，10000g(4℃)离心15分钟；取上层水相，转移到一新的离心管中，加入异丙醇(0.5ml/1ml Trizol液)，室温下(15～30℃)放置10分钟，10000g(4℃)离心10分钟；弃去上清液，加入预冷的75％乙醇(1ml/1ml Trizol液)进行洗涤，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。75％乙醇使用无水乙醇+0.01％浓度的DEPC水配置；弃去上清液，所得RNA在室温下自然干燥或真空干燥5-10分钟；加Rnase-free water约20μl，溶解RNA沉淀，用枪头反复吸取混匀，取2μl加入Rnase-free water 98μl，进行下游实验或-70℃保存备用。RNA浓度和电泳检测：OD260/OD280＝1.9-2.0时RNA纯度较好，小于1.8时含蛋白质等杂质较多，大于2.2时RNA降解。通过琼脂糖凝胶电泳测定完整性：将2.5μL所提RNA与上样缓冲液混合，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳(120V,20min)。若凝胶成像显示5s带不明显，并且18s、28s条带清晰、明亮，28s带的宽度和亮度约为18s带的2倍，则RNA完整性较好、无降解，总RNA可以用于逆转录；

(2)按逆转录试剂盒加入反应体系，10μl每管，一次可以多配几管进行逆转录，cDNA较为稳定，可以保存较长时间。加入RNA不要超过每管500ng，每个样品RNA量要调平；冰上加样，注意先加体积大的后加体积小的，全部在管底部，不留气泡，然后吹打混匀，通过短暂离心使样品溶液集中在管底，再在PCR仪上进行反转录反应(37℃15min，85℃5sec)，反应结束后-20℃保存或立即进行real time PCR。一排管有8个孔，前三个加目的，后三个加内参，保证误差在可控范围内。设空白对照管(dH₂O代替模板)用来验证有无污染的发生；设内参(GAPDH)；把除了引物的mixture统一配，然后再加入第1或第8个孔与引物进行混合，最后分装到各个孔中。按如下体系加样：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL；Primer mix(10μM)1μL；cDNA 1μL；dH₂O 8μL。配置结束后离心，拿出来的时候注意不要震荡(容易产生气泡)，还要仔细检查有无气泡，有气泡还要继续离心；两步法real time PCR扩增标准程序：Stage 1：预变性，Repeat：1，95℃3min；Stage 2：PCR反应，Repeat：40，95℃15s，55℃30s；Stage 3：Dissociation。

(3)实验结果分析：反应结束后，确认real time PCR的扩增曲线和融解曲线，取三次重复的平均值为样本的Ct值，以GAPDH为内参基因，CON组为对照组，用ΔΔCt法对目的基因进行相对定量。

表4实施例3、4、11、12、27和28制备的化合物抑制Jurkat白血病细胞的IC₅₀值。

由表4可知，本发明提供的具有异羟肟酸结构的化合物，本申请在浓度为10μM时，抑制Jurkat白血病细胞的IC50值低至0.57μM。

由实施例可知，本发明提供的具有异羟肟酸结构的化合物，在浓度为10μM时，对HDAC的抑制率高达93.43％，在浓度为5μM时，下调刺猬信号通路转录因子Gli1的表达可达到-87.10％，表现出对刺猬信号通路的活性有较强的抑制作用，在浓度为10μM时，对A549非小细胞肺癌细胞增殖的抑制率高达86.84％，抑制Jurkat白血病细胞的IC50值低至0.57μM。

本发明提供的具有异羟肟酸结构的化合物，具有如式I、Ⅱ或Ⅲ所示的化学结构，通过将刺猬信号通路拮抗剂的药效基团2-苯基取代的吡啶或苯并咪唑，以及取代苯环与异羟肟酸片段通过合适的连接链连接，其中2-苯基取代的吡啶或苯并咪唑可以与刺猬信号通路关键蛋白Smo产生氢键作用和疏水作用，并且可以作为HDAC抑制剂的Cap部分与HDAC结合口袋的表面区产生相互作用，异羟肟酸片段增加化合物与HDAC中锌离子的螯合作用，同时也与Smo蛋白中的氨基酸形成氢键。因此，本发明提供的提供的化合物在保持对刺猬信号通路拮抗作用的同时表现出较强的HDAC抑制作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种具有异羟肟酸结构的化合物，具有如式I所示的化学结构：

所述式I中的R1为氯原子；

所述式I中的R2为

所述式I中的R3为氯原子、氢原子或甲基。

2.根据权利要求1所述的具有异羟肟酸结构的化合物，其特征在于，所述式I中的-CH＝CH-CO-NH-OH在R3的对位或间位。

3.一种包含权利要求1或2所述具有异羟肟酸结构的化合物的药物组合物。

4.权利要求1或2所述具有异羟肟酸结构的化合物或权利要求3所述药物组合物在制备用于治疗与刺猬信号通路或组蛋白去乙酰化酶相关疾病的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述与刺猬信号通路或组蛋白去乙酰化酶相关疾病为白血病和/或非小细胞肺癌。

6.一种权利要求1或2所述具有异羟肟酸结构的化合物的制备方法，其特征在于，所述具有式I所示的化学结构的化合物的制备方法包括以下步骤：

(1)将具有式A-4所示结构的化合物、具有式V所示结构的化合物、碱性化合物和有机溶剂混合进行磺酰胺化反应，得到具有式A-5所示结构的化合物；

(2)将所述步骤(1)得到的具有式A-5所示结构的化合物、盐酸羟胺、醇和甲醇钠混合进行酰胺化反应，得到具有式I所示结构的化合物