CN105237444B - 异羟肟酸类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属医药技术领域，公开了异羟肟酸类化合物及其制备方法和用途。化合物的结构如下所示，其中R为H，C1‑C6烷基；R1和R2为H、卤素或卤素取代的C1‑C6烷基。其制备主要以肉桂酸酯为起始原料，经氯磺化、与取代的苯胺成磺酰胺、与羟胺反应得到目标化合物，操作简单、后处理方便、收率较高。目标化合物具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性，对多种癌细胞具有良好的抑制作用和对线虫具有良好的延长寿命作用，从而用于肿瘤的治疗及延长寿命等其他用途。
Description
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及异羟肟酸类化合物及其制备方法和用途，具体涉及含磺酰胺苯基丙烯异羟肟酸类化合物和含磺酰胺肉桂异羟肟酸类化合物及其制备方法和应用。
技术背景：
癌症严重危害人类身体健康，世界卫生组织指出，癌症是导致人类死亡的一个主要原因，2008年夺去了760万人的生命，而且这一数字还将快速上升，到2030年将超过1310万。我国近20年来癌症呈现年轻化及发病率和死亡率“三线”走高的趋势，据全国肿瘤登记中心披露，全国每年新发肿瘤病例估计约为312万例，每年因癌症死亡人数达270万。
1971年Friend等发现二甲亚砜可诱导小鼠红白血病细胞系分化引起了人们对组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的兴趣。HDAC在基因转录中起重要的作用，通过对组蛋白末端的赖氨酸进行去乙酰化，使组蛋白N末端的正电荷密度增加，从而与带负电荷的DNA之间的相互作用增强，使染色体的结构更加紧密，不利于特定基因的表达，包括一些肿瘤抑制基因。在哺乳动物细胞中共发现了18种HDAC，根据结构和功能的不同可以分为以下四类(Table 1-1)，其中Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ类HDAC是Zn2+依赖型，Ⅲ类HDAC是尼克酰胺腺嘌呤双核苷酸依赖型。
Table 1-1 Biological functions of Class I and Class II HDACs
研究发现，肿瘤细胞中HDAC活性明显增强，组蛋白大部分呈低乙酰化状态，基因表达异常。HDAC抑制剂(HDACI)能使肿瘤细胞中组蛋白乙酰化水平提高，诱导特定基因激活表达，作用于细胞中多条信号转导通路，产生较强的抗肿瘤活性。其抗肿瘤作用机制可能有：
阻滞细胞周期：HDACI通过诱导肿瘤细胞中CDK抑制剂(p15、p21等)的表达，抑制cyclins和CDK的表达，诱导肿瘤细胞发生G1或G2/M期停滞，从而抑制肿瘤细胞增殖。
诱导细胞凋亡：HDACI可以上调肿瘤细胞中死亡受体(DR)及其配体的表达，DR与相应的配体结合后，诱导激活caspase-8和caspase-3介导的细胞凋亡通路，导致细胞凋亡。另外HDACI作用于肿瘤细胞时能活化Bax和Bak等促凋亡蛋白，抑制Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡蛋白的表达，诱导肿瘤细胞凋亡。
抑制血管新生：HDACI抑制肿瘤细胞中HIF-1α及VEGF的表达，诱导HIF-1α和VEGF受体的降解，上调pVHL的表达，抑制肿瘤血管生成，使肿瘤细胞因缺血、缺氧而部分死亡，从而延缓肿瘤生长和抑制肿瘤转移。
诱导自我吞噬：HDACI作用于肿瘤细胞时，通过抑制mTOR和Bcl-2家族蛋白的表达，上调Beclin1和Atg蛋白水平等途径，促进肿瘤细胞的自我吞噬。
异羟肟酸类化合物是现今研究较为广泛的一类HDAC抑制剂，其抑酶活性较强，结构也比较简单。如2006年上市的第一个HDAC抑制剂Vorinostat，已取得较好的抗肿瘤效果且未发现严重的毒副反应。2009年上市的TSA是HDAC的可逆抑制剂，活性强于SAHA，可抑制多种肿瘤细胞的生长。该类化合物还有Scriptaid、Belinostat等。
发明内容：
本发明提供了一些高效、低毒的HDAC抑制活性的含有磺酰胺苯基丙烯异羟肟酸类化合物。在Belinostat基础上，我们将磺酰胺片段移至对位，发现同时在磺酰胺氨基的芳环间位引入卤素或三氟甲基，其HDAC抑制活性非常强，且化合物制备容易，生产成本大大低于间位的Belinostat，适合工业化生产，进一步把磺酰胺氮原子上的氢用短链的烷基如甲基、乙基等取代，能进一步增强对耐药肿瘤细胞株的活性，原因是烷基化之后能减少肿瘤细胞对药物的外排，即烷基化之后药物与药物外排转运载体蛋白P-糖蛋白(P-gp)形成氢键的能力减弱。
另外，本发明的化合物能显著延长线虫寿命。
本发明的化合物结构式如(1)：
其中R为H，C1-C6烷基；R1和R2为H、卤素或卤素取代的C1-C6烷基。
本发明优选具有如下结构的化合物：
其中，R为H，C1-C4烷基，优选H，甲基，乙基；
进一步地，本发明优选如下结构的化合物：
其中，R1和R2为H、卤素或卤素取代的C1-C4烷基，优选为H、F、Cl、Br或CF3，更优选为H、F、Cl、CF3。
本发明更优选如下具体化合物：
R:H,CH3,CH2CH3
本发明化合物的合成反应流程如下，其中起始原料肉桂酸酯，可以为甲酯、乙酯、丙酯等常见羧酸酯，优选甲酯、乙酯，下图以甲酯为例：
(1)制备4-氯磺酰基肉桂酸甲酯(Ⅱ)
肉桂酸甲酯缓缓滴加到氯磺酸中，-20到50度反应1-12小时，反应完全后，搅拌下将反应液缓缓倾入到冰水中，抽滤，得到4-氯磺酰基肉桂酸甲酯，其中，反应温度优选-10到10度，反应时间优选2-4小时；
(2)制备4-((N-取代苯基)氨基磺酰基)肉桂酸甲酯(Ⅲ)
4-氯磺酰基肉桂酸甲酯与各种取代的苯胺在合适的溶剂中，在缚酸剂的作用下，缩合得到4-((N-取代苯基)氨基磺酰基)肉桂酸甲酯(Ⅲ)，其中合适的溶剂是指本专业里常用于磺酰胺制备的溶剂，如丙酮、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、DMF、THF、二氯甲烷、氯仿等等，缚酸剂是常用的无机碱或有机碱，其中无机碱为碳酸钾(碳酸钠)、碳酸氢钾(钠)、氢氧化钾(钠)、碳酸铯等，有机碱为三乙胺、吡啶、DMAP、二异丙基乙胺等；
(3)制备4-((N-取代苯基)氨基磺酰基)肉桂异羟肟酸(Ⅳ)
4-(N-取代苯胺磺酰基)肉桂酸甲酯与盐酸羟胺在碱的作用下在合适溶剂里反应制得4-((N-取代苯基)氨基磺酰基)肉桂异羟肟酸，其中碱可以为无机碱或有机碱，其中无机碱为碳酸钾(碳酸钠)、碳酸氢钾(钠)、氢氧化钾(钠)、碳酸铯等，有机碱为三乙胺、吡啶、DMAP、二异丙基乙胺，溶剂为常用的溶剂，如甲醇、乙醇等醇类溶剂、DMF、丙酮、THF等，优选甲醇和乙醇，反应温度为0-80度，优选为25-50度；
(4)制备4-((N,N’-双取代)氨基磺酰基)肉桂酸甲酯(Ⅴ)；
4-(N-取代苯胺磺酰基)肉桂酸甲酯与烷基化试剂在碱催化下缩合得到4-((N,N’-双取代)氨基磺酰基)肉桂酸甲酯。其中烷基化试剂是指碘甲烷、碘乙烷、溴乙烷、溴丙烷、硫酸二甲酯、硫酸二乙酯；其中碱可以为无机碱或有机碱，其中无机碱为碳酸钾(碳酸钠)、碳酸氢钾(钠)、氢氧化钾(钠)、碳酸铯等，有机碱为三乙胺、吡啶、DMAP、二异丙基乙胺。
(5)制备4-((N,N’-双取代)氨基磺酰基)肉桂异羟肟酸(Ⅵ)
4-((N,N’-双取代)氨基磺酰基)肉桂酸甲酯与盐酸羟胺在碱的作用下在合适溶剂里反应制得4-((N-取代苯基)氨基磺酰基)肉桂异羟肟酸，其中碱可以为无机碱或有机碱，其中无机碱为碳酸钾(碳酸钠)、碳酸氢钾(钠)、氢氧化钾(钠)、碳酸铯等，有机碱为三乙胺、吡啶、DMAP、二异丙基乙胺，溶剂为常用的溶剂，如甲醇、乙醇等醇类溶剂、DMF、丙酮、THF等，优选甲醇和乙醇，反应温度为0-80度，优选为25-50度。
附图说明
图1为5个化合物和对照药丙戊酸钠(VPA)作用下的线虫寿命曲线。
具体实施方式：
实施例1(E)-3-(4-(氯磺酰基)苯基)丙烯酸甲酯的合成
于100mL三颈瓶中加入ClSO3H 37mL(0.54mol)，冰浴降温至0℃，分批加入肉桂酸甲酯10g(67mmol)，控制反应温度维持在0℃以下，加毕，移至温度平衡至40℃的油浴反应，4h后检测反应，基本反应完全，将反应液倾入300g碎冰中冰解，大量白色固体析出，抽滤，烘干，得(E)-3-(4-(氯磺酰基)苯基)丙烯酸甲酯12.2g，收率73.5％。
实施例2(E)-3-(4-N-(3-三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯的制备
于100mL三颈瓶中加入3-三氟甲基苯胺2.2g(10mmol)，干燥的乙酸乙酯20mL，干燥的吡啶5.0mL(61.5mmol)，于室温搅拌5min后，冰浴降温至0℃，开始滴加(E)-3-(4-(氯磺酰基)苯基)丙烯酸甲酯2.0g(7.69mmol)的干燥乙酸乙酯溶液20mL，控制温度维持在0℃反应，10min滴毕，反应4h后检测反应，基本反应完全，将反应液倾入到100mL冰水中，乙酸乙酯50mL×4萃取，10％HCl溶液50mL×3洗涤，水洗至中性，饱和氯化钠水溶液100mL洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，蒸干，得白色固体(E)-3-(4-N-(3-三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯2.83g，收率94.6％。
用类似的方法得到以下化合物：
实施例3.(E)-3-(4-N-(2-三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯白色固体2.42g，收率81.1％。
实施例4.(E)-3-(4-N-(4-三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯白色固体2.61g，收率87.8％。
实施例5(E)-3-(4-N-(3,5-二三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯白色固体3.03g，收率86.2％。
实施例6(E)-3-(4-N-(3,4-二氟)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯白色固体2.74g，收率99.6％。
实施例7(E)-3-(4-N-(3,5-二氟)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯白色固体2.62g，收率95.9％。
实施例8(E)-3-(4-N-(3-三氟甲基-4-氯)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯白色固体3.16g，收率96.3％。
实施例9(E)-N-羟基-3-(4-(N-(3-(三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酰胺(即(E)-3-(4-(N-(3-(三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸)(SNOH-01)
于100mL茄形瓶中加入(E)-3-(4-N-(3-三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯1.9g(5mmol)，甲醇20mL，盐酸羟胺3.5g(50mmol)和氢氧化钾5g，室温搅拌反应2小时后，回流反应6小时，减压蒸去溶剂，残余物加少量水搅拌，稀盐酸调pH2-3，抽滤，干燥得粗品，乙醇重结晶，得(E)-3-(4-(N-(3-(三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸，收率72.2％，m.p.118-120℃。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)：δ(ppm)10.88(1H,s,CONHOH),10.81(1H,s,CONHOH),9.16(1H,s,SO2NH),7.77(4H,q,Ar-H),7.45(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),7.44(4H,m,Ar-H),6.55(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2)；MS(ESI)m/z 385[M-H]-.
用类似的方法得到以下化合物：
实施例10.(E)-3-(4-(N-(2-(三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸(SNOH-02)，淡粉色固体，收率83.3％，m.p.141-143℃。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)：δ(ppm)10.88(1H,s,CONHOH),10.04(1H,s,CONHOH),9.14(1H,s,SO2NH),7.80(4H,q,Ar-H),7.72(1H,d,J＝7.2Hz,Ar-H),7.60(1H,t,Ar-H),7.53(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),7.46(1H,t,Ar-H),7.04(1H,d,J＝7.8Hz,Ar-H),6.61(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2)；MS(ESI)m/z 385[M-H]-.
实施例11.(E)-3-(4-(N-(4-(三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸(SNOH-03)，淡粉色固体，收率61.1％，m.p.187-189℃。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)：δ(ppm)10.97(1H,s,CONHOH),10.90(1H,s,CONHOH),9.17(1H,s,SO2NH),7.87(2H,d,Ar-H),7.75(2H,d,Ar-H),7.62(2H,d,J＝8.7Hz,Ar-H),7.48(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),7.30(2H,d,J＝8.7Hz,Ar-H),6.55(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2)；MS(ESI)m/z 385[M-H]-.
实施例12.(E)-3-(4-(N-(3,5-二(三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸(SNOH-04)，淡粉色固体，收率77.4％，m.p.159-161℃。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)：δ(ppm)11.29(1H,s,CONHOH),10.90(1H,s,CONHOH),9.16(1H,s,SO2NH),7.85(2H,d,Ar-H),7.78(3H,m,Ar-H),7.61(2H,s,Ar-H),7.48(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),6.57(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2)；MS(ESI)m/z 453[M-H]-.
实施例13.(E)-3-(4-N-(3,4-二氟)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸(SNOH-05)，淡粉色固体，收率75.1％，m.p.151-153℃。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)：δ(ppm)10.90(1H,s,CONHOH),10.58(1H,s,CONHOH),9.17(1H,s,SO2NH),7.76(4H,m,Ar-H),7.48(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),7.33(1H,q,Ar-H),7.12(1H,m,Ar-H),6.89(1H,m,Ar-H),6.56(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2)；MS(ESI)m/z 353[M-H]-.
实施例14.(E)-3-(4-N-(3,5-二氟)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸(SNOH-06)，粉色固体，收率81.2％，m.p.168-169℃。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)：δ(ppm)10.98(1H,s,CONHOH),10.91(1H,s,CONHOH),9.18(1H,s,SO2NH),7.85(2H,d,Ar-H),7.76(2H,d,Ar-H),7.50(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),6.90(1H,t,Ar-H),6.79(1H,d,Ar-H),6.57(1H,d,J＝15.6Hz,CH2＝CH2)；MS(ESI)m/z 353[M-H]-.
实施例15.(E)-3-(4-N-(3-三氟甲基-4-氯)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸(SNOH-07)，白色固体，收率64.7％。m.p.168-170℃。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)：δ(ppm)10.89(1H,s,CONHOH),10.86(1H,s,CONHOH),9.13(1H,s,SO2NH),7.77(4H,q,Ar-H),7.63(1H,s,Ar-H),7.57(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),7.47(1H,d,Ar-H),7.39(1H,dd,Ar-H),6.56(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2)；MS(ESI)m/z 419[M-H]-.
实施例16.(E)-3-(4-(N-甲基-N-(3-(三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯
于100mL三颈瓶中加入(E)-3-(4-N-(3-三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯3.85g(10mmol)，干燥的乙酸乙酯30mL，硫酸二甲酯1.8mL(20mmol)和氢氧化钠2g(50mmol)，加热回流反应4h后检测反应，基本反应完全，将反应液倾入到100mL冰水中，乙酸乙酯50mL×4萃取，10％氢氧化钠溶液50mL洗涤，水洗至中性，饱和氯化钠水溶液100mL洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，蒸干，得白色固体(E)-3-(4-(N-甲基-N-(3-(三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯3.83g，收率95.9％
用类似的方法得到以下化合物：
实施例17.(E)-3-(4-(N-甲基-N-(2-(三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯白色固体3.42g，收率85.1％。
实施例18.(E)-3-(4-(N-甲基-N-(4-三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯白色固体3.62g，收率89.8％。
实施例19.(E)-3-(4-(N-甲基-N-(3,5-二三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯白色固体4.03g，收率88.2％。
实施例20.(E)-3-(4-(N-甲基-N-(3,4-二氟)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯白色固体3.74g，收率89.6％。
实施例21.(E)-3-(4-(N-甲基-N-(3,5-二氟)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯白色固体3.62g，收率87.9％。
实施例22.(E)-3-(4-(N-甲基-N-(3-三氟甲基-4-氯)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯酸甲酯白色固体3.56g，收率91.3％。
参照实施例9的合成方法得到如下化合物：
实施例23.(E)-3-(4-(N-甲基-N-(3-(三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸(SNOH-08)，淡粉色固体，收率73.0％，1H NMR(DMSO-d6,400MHz)：δ(ppm)10.89(1H,s,CONHOH),9.16(1H,s,CONHOH),7.76(4H,q,Ar-H),7.68(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),7.60-743(4H,m,Ar-H),6.65(1H,d,J＝15.8Hz,CH2＝CH2),3.20(s,3H)；MS(ESI)m/z:401.5[M+H]+,399.3[M-H]-.
实施例24.(E)-3-(4-(N-甲基-N-(2-(三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸(SNOH-09)，淡粉色固体，收率73.3％。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)：δ(ppm)10.88(1H,s,CONHOH),10.00(1H,s,CONHOH),7.82(4H,q,Ar-H),7.74(1H,d,J＝7.2Hz,Ar-H),7.61(1H,t,Ar-H),7.55(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),7.48(1H,t,Ar-H),7.07(1H,d,J＝7.8Hz,Ar-H),6.63(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),3.21(s,3H)；MS(ESI)m/z 399.2[M-H]-.
实施例25.(E)-3-(4-(N-甲基-N-(4-(三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸(SNOH-10)，淡粉色固体，收率71.1％。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)：δ(ppm)10.95(1H,s,CONHOH),10.91(1H,s,CONHOH),7.85(2H,d,Ar-H),7.77(2H,d,Ar-H),7.63(2H,d,J＝8.7Hz,Ar-H),7.48(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),7.33(2H,d,J＝8.7Hz,Ar-H),6.57(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),3.18(s,3H)；MS(ESI)m/z 399[M-H]-.
实施例26.(E)-3-(N-甲基-4-(N-(3,5-二(三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸(SNOH-11)，淡粉色固体，收率75.4％。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)：δ(ppm)11.31(1H,s,CONHOH),10.94(1H,s,CONHOH),7.87(2H,d,Ar-H),7.79(3H,m,Ar-H),7.64(2H,s,Ar-H),7.45(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),6.56(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),3.25(s,3H)；MS(ESI)m/z 467[M-H]-.
实施例27.(E)-3-(N-甲基-4-N-(3,4-二氟)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸(SNOH-12)，淡粉色固体，收率72.3％。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)：δ(ppm)10.88(1H,s,CONHOH),10.53(1H,s,CONHOH),7.77(4H,m,Ar-H),7.46(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),7.38(1H,q,Ar-H),7.14(1H,m,Ar-H),6.85(1H,m,Ar-H),6.54(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),3.24(s,3H)；MS(ESI)m/z 367[M-H]-.
实施例28.(E)-3-(N-甲基-4-N-(3,5-二氟)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸(SNOH-13)，粉色固体，收率71.2％。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)：δ(ppm)10.90(1H,s,CONHOH),9.17(1H,s,CONHOH),7.78(2H,d,J＝8.24Hz,Ar-H),7.58(2H,d,J＝8.24Hz,Ar-H),7.52(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),7.21(1H,t,Ar-H),6.99(1H,d,Ar-H),6.60(1H,d,J＝15.6Hz,CH2＝CH2),3.17(s,3H)；MS(ESI)m/z：369.2[M+H]+，366.9[M-H]-.
实施例29.(E)-3-(N-甲基-4-N-(3-三氟甲基-4-氯)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸(SNOH-14)，白色固体，收率74.7％。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)：δ(ppm)10.89(1H,s,CONHOH),10.86(1H,s,CONHOH),7.76(4H,q,Ar-H),7.64(1H,s,Ar-H),7.58(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),7.48(1H,d,Ar-H),7.38(1H,dd,Ar-H),6.55(1H,d,J＝15.9Hz,CH2＝CH2),3.29(s,3H)；MS(ESI)m/z 433[M-H]-.
实施例30.(E)-3-(N-乙基-4-N-(3,5-二氟)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸(SNOH-15)，粉色固体，收率74.2％。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)：δ(ppm)10.89(1H,s,CONHOH),9.16(1H,s,CONHOH),7.78(2H,d,J＝7.9Hz,Ar-H),7.62(2H,d,J＝8.1Hz,Ar-H),7.53(1H,d,J＝15.8Hz,CH2＝CH2),7.28(1H,t,J＝9.2Hz,Ar-H),6.94(1H,d,J＝6.3Hz,Ar-H),6.60(1H,d,J＝15.8Hz,CH2＝CH2),3.63(q,J 6.88Hz,2H)，0.99(t,J 6.96Hz,1H),MS(ESI),m/z:383.4[M+H]+,381.2[M-H]-.
实施例31.(E)-3-(N-乙基-4-N-(3-三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸(SNOH-16)，粉色固体，收率70.2％。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)：δ(ppm)10.88(brs,1H),9.16(brs,1H),7.76(d,J 8.04Hz,2H),7.72(s,1H),7.60(t,J 7.96Hz,1H),7.55(d,J8.04Hz,2H),7.52(d,J 15.88Hz,1H),7.40(m,2H),6.60(d,J 15.88Hz,1H),3.66(q,J6.9Hz,2H),0.97(t,J 7.0Hz,3H),MS(ESI),m/z:453.6[M+K]+,412.5[M-H]-.
生物学实验部分
1.实验细胞株及来源
2.实验试剂
3.实验方法
3.1、药物处理
化合物均配制成相同浓度的母液(100mmol/L)，储存于-20℃。细胞增殖抑制试验中，初筛时用RPMI1640培养基将试验药物及阳性药SAHA、BEXA稀释为10μmol/L进行实验。DMSO配置的样品进行实验时，DMSO的终浓度为1‰。复筛时将初筛出的药物及阳性药SAHA、BEXA浓度设为100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L、和0.1μmol/L。HDAC靶点确证试验中，初筛时实验药物及阳性药SAHA浓度设为20μmol/L，复筛时药物浓度设为20μmol/L、2μmol/L、0.2μmol/L、0.02μmol/L。
3.2、MTT检验
1)MTT法的基本原理
细胞成活率测定采用MTT分析法，以活细胞代谢还原四甲基偶氮唑盐(3-(4，5-dimethyl-2thiahiazoy1)-3，5-di-phenyl-tetrazolium bromide，MTT)为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下四氮唑环开裂，生成蓝色的Formazan结晶，Formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比。死细胞中此酶消失，不能和20％的十二烷基磺酸钠(pH4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定492nm处的光密度OD值，OD值的大小与所生成的Formazan结晶的量成正比，从而反应出药物对细胞成活率的影响。
2)细胞处理
取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，100μl/well，培养于37℃，5％CO2的培养箱内。贴壁过夜，换液加药，作用48h。分设空白组、给药组和阳性对照组，每组设4个复孔。
3)MTT法的测定方法
药物作用48h后，将细胞与0.25mg/ml MTT于37℃下共同孵育3-4h，吸除培养液后每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，完全溶解后使用酶标仪于492nm测定其光密度OD值。最后以空白组OD值为100％，计算各组细胞抑制率。
3.3、HDAC靶点的确证
1)基本原理
药物对HDAC活性的影响采用HDAC活性检测试剂盒来考察。在样品(细胞裂解液)中加入含有乙酰化赖氨酸链的底物，样品中的有活性的HDAC会将底物上的赖氨酸链去乙酰化，从而使底物活化。再加入赖氨酸发光试剂，即产生荧光，用酶标仪记录信号用于表示样品中HDAC的活性。
2)测定方法
1)将未加药处理的A549细胞裂解液50μg溶解于85μL(终体积)的ddH2O中。对于阳性空白组，先加2μL的HeLA核提取物，再加入83μL ddH2O。阴性空白组，加入2μLTrichostatin A和83μL ddH2O。
2)每孔中加入10μL的10倍缓冲液。
3)每孔加入5μLHDAC的荧光底物，并且加入药物，使终浓度达到所设定的浓度，充分混合，37℃孵育30min。
4)加入10μL赖氨酸显影液，充分混合，停止反应。37℃下孵育30min。
5)酶标仪检测荧光度值(条件为发射波长/激发波长为350-380/440-460nm)。
3.4、统计方法
全部资料采用SPSS(16.0)统计软件包进行检验分析。各组数据用均值±标准误(Mean±S.E.)表示，采用One-Way ANOVA评价整体性差异，并进行Dunnett或Dunnett’s T3检验进行组间比较。
4、实验结果
4.1.MTT实验
(1)化合物对人白血病HL60细胞增殖的影响
实验结果如表1所示，药物10μM作用48h，化合物SNOH-1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16、17、19、对HL60细胞增殖有显著抑制作用，抑制率均大于50％。选择10μM作用48h后抑制率大于50％的样品进行复筛，实验结果如表2所示。
表1.化合物(10μM)对HL60细胞株的存活抑制率(％)(Mean±SE)
***P＜0.001Vs Control；**P＜0.01Vs Control；*P＜0.05Vs Control.
表2.化合物对HL60细胞株的存活抑制率(％)(Mean±SE)
***P＜0.001Vs Control；**P＜0.01Vs Control；*P＜0.05Vs Control.
(2)化合物对人皮肤T细胞淋巴瘤Hut102细胞增殖的影响
实验结果如表3所示，药物10μM作用48h，化合物SNOH-1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19对Hut102细胞增殖有显著抑制作用，抑制率均大于50％。选择10μM作用48h后抑制率大于50％的样品进行复筛，实验结果如表3所示。
表3.化合物对Hut102细胞株的存活抑制率(％)(Mean±SE)
***P＜0.001Vs Control；**P＜0.01Vs Control；*P＜0.05Vs Control.
4.2.HDAC靶点的确证实验
实验结果如表4所示，未加药处理的细胞提取总蛋白后，药物20μM作用48h，化合物SNOH-1、3、5、7、9、11、13、15、17、19对A549细胞的HDAC有显著抑制作用，抑制率均大于50％。选择10μM作用48h后HDAC抑制率大于50％且MTT试验中IC50小于10μM的10个样品进行复筛，实验结果如表5所示。
表4.化合物对A549细胞HDAC活性的影响(％)(Mean)
表5.化合物对A549细胞HDAC活性的影响(％)(Mean±SE)
***P＜0.001Vs Control；**P＜0.01Vs Control；*P＜0.05Vs Control.
表6.化合物靶向HDAC筛药结果汇总(％)(Mean±SE)
对线虫寿命影响实验：
实验方法：
实验选取秀丽隐杆线虫(N2野生型)，在NGM固体培养基((w/v)0.3％NaCl、0.25％Peptone、1.5％Agar、0.00005％Cholesterol、1mM CaCl2、1mM MgSO4，25mM KH2PO4)上进行扩增，以E.coli OP50为食物，培养温度为20℃。线虫寿命实验使用同步化成虫，获得同步化成虫需将成虫亲本挑入新的固体培养基中产卵，4-8小时后将成虫挑出。卵孵化3天后，线虫发育至L4后期，收集该线虫用于寿命实验。寿命观察使用96孔板，线虫培养于NGM液体培养基中((w/v)0.3％NaCl、0.25％Peptone、0.00005％Cholesterol、1mM CaCl2、1mM MgSO4，25mM KH2PO4、30μM 5-Fluoro-2’-deoxyuridine，加入1/24体积的的OD600为0.5的OP50E.coli)。实验设置空白对照组(不加药组)和药物处理组，每组10-15个复孔，每孔挑入10条同步化线虫，加入200μl培养基，置于20℃培养，每隔三天更换1/3培液。将化合物溶于DMSO配置成储存液，按照实验所需浓度稀释于NGM液体培养基中，线虫培养基中的DMSO终浓度低于1/10000。线虫寿命统计从药物处理的第二天开始，每组起始为100-150只线虫，每天观察线虫是否存活，以线虫不动作为线虫死亡的标志，当线虫在某天发生死亡事件，该只线虫死亡则计录为1，直至全部死亡。数据用Graphpad Prism5的Survival曲线作图，计算PValue(Log-rank(Mantel-Cox)Test，vs空白对照组)。给药剂量：
CG-03-01(SNOH-3)和CG-03-02(SNOH-11)共用了7个剂量组：0，0.1μM,0.3μM,1μM,3μM,10μM，30μM，CG-03-03(SNOH-14)、CG-30-04(SNOH-15)和CG-03-05(SNOH-16)共用了6个剂量组：0，0.1μM,0.3μM,1μM,3μM,10μM，VPA(丙戊酸)共用了5个剂量组:0,0.3mM,1mM,3mM,6mM
线虫寿命曲线(图1)显示5个化合物均有延长寿命的作用，VPA已报道可以延长线虫寿命，5个化合物的作用远远好于VPA。
Claims (6)
1.如下的异羟肟酸类化合物，选自：
(E)-3-(4-(N-(4-(三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸；
(E)-3-(N-甲基-4-(N-(3,5-二(三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸；
(E)-3-(N-甲基-4-N-(3-三氟甲基-4-氯)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸；
(E)-3-(N-乙基-4-N-(3,5-二氟)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸；
(E)-3-(N-乙基-4-N-(3-三氟甲基)苯基)磺酰胺基)苯基)丙烯异羟肟酸。
2.药物组合物，包含权利要求1所述的异羟肟酸类化合物。
3.权利要求1所述的异羟肟酸类化合物或权利要求2所述的药物组合物在制备治疗细胞增殖疾病药物或保健品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的细胞增殖疾病为淋巴瘤、白血病、非小细胞肺癌或肾癌。
5.权利要求1所述的异羟肟酸类化合物或权利要求2所述的药物组合物在制备延长寿命药物或保健品中的应用。
6.如权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，以肉桂酸甲酯为原料：制备如下：
其中，R为C1-C6烷基；R1和R2为卤素或卤素取代的C1-C6烷基。
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